一种bmp-3蛋白及其作为骨修复注射剂的制备方法及应用

文档序号:10482791阅读:442来源:国知局
一种bmp-3蛋白及其作为骨修复注射剂的制备方法及应用
【专利摘要】本发明提供了一种BMP?3的提取及含BMP?3的注射剂的制备方法。通过提取部分纯化的BMP?3与胶原蛋白及PEG 2000,泊洛沙姆和PVP制得注射剂。本发明提供了一种以天然提取、部分纯化的BMP为基础并具有缓释作用的最佳载体的注射剂及制备方法,通过优化提取过程中的工艺条件,获得的BMP纯度高、活性高、利用率高,并优化注射剂载体组分及比例,制得的骨修复注射剂具有需用量少、效果显著、使用方便等优点。
【专利说明】
一种BMP-3蛋白及其作为骨修复注射剂的制备方法及应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种医用材料及其制备方法,具体讲涉及一种BMP-3蛋白及其骨修复注射剂的制备方法及应用。
【【背景技术】】
[0002]骨形态发生蛋白即Bone Morphogenetic Protein,缩写为BMP,是一种对骨生长和修复具有明显生物活性的细胞因子,具有突出的诱导成骨活性,因而在基础及临床应用方面具有广阔的应用前景。到目前为止,已发现二十种BMP,对其中的骨形态发生蛋白-2(bonemorphogenetic protein-2,BMP_2)的研究较多c^BMP-2可从动物组织内提纯,也可用基因工程构建重组细胞表达合成。1979年Urist领导的科研小组率先从兔脱钙骨中成功地分离纯化了兔的BMP-2,于1982年从牛骨中提取出牛骨形态发生蛋白(bBMP),并在1987年建立了一套从人及牛骨中提取BMP的标准流程。
[0003]经皮注射的骨生长因子,可直接将高效的骨诱导剂输送至骨折、骨缺损及骨不连接部位,具有创伤小,适应症广等优点。针对临床中大段粉碎性骨折患者,在闭合复位后向骨折部位注入骨生长因子能够大大提高骨折愈合率;而对于骨不连患者,在内固定或外固定完善的情况下,采取局部注射骨生长因子,可进一步扩大了非手术治疗的适应范围。如王登虎在《注射型BMP的相关实验研究及初步临床应用研究》一文中将bBMP、bFGF与PVP复合在一起,制成注射型BMP(IBMP)用于治疗骨折延迟连接、不连接及骨缺损。将BMP与具有热力学可逆性的泊洛沙姆(poloxamer)结合,在温度较低时,泊洛沙姆能溶于水形成溶胶,在体内由于温度较高,能够形成粘性凝胶,有利于BMP和生长因子的缓慢释放,提高了骨的诱导能力。但BMP在骨中含量少,且提取量有限,使用高纯化的BMP又易被组织吸收,难以发挥作用。因此,应用时必须同时考虑BMP和搭配载体的问题。现有技术中常用的载体有脱钙骨基质(DBM)、多空磷酸钙(TCP)、羟基磷灰石(HA)、生物活性玻璃陶瓷及纤维蛋白等,但是这些载体都或多或少地存在这样或那样的问题。

【发明内容】

[0004]为克服上述现有技术中的不足,本发明提供了一种以天然提取、部分纯化的BMP为基础并搭配有最佳载体的具有缓释作用的最佳载体的注射剂及其制备方法,通过优化提取过程中的工艺条件,获得的BMP纯度高、活性高、利用率高,并优化注射剂载体组分及比例,制得的骨修复注射剂具有需用量少、效果显著、使用方便等优点。
[0005]为实现上述目的,发明采用以下技术方案:
[0006]本发明提供了一种BMP-3的提取方法,包括下述步骤:
[0007]I)粗提:
[0008]将粉碎后的小牛腿皮质骨依次经1:1氯仿/甲醇处理10-15h,3_10%的H2O2处理10-15h,于室温下用0.6mol/L的HCl处理3-6min,将离心得到的分离液于37 °C下调pH至7.2并加入其总重0.0006%的胶原酶浸提24h,减压浓缩后溶于终浓度为6mol/L脲/0.5mol/L CaCl2中提取24h,分离液经截留分子量为70KD的微孔滤膜过滤,透析、离心后得粗制BMP,将其复溶于4mol/L盐酸胍/0.5mol/L CaCl2中,滤液再经透析,离心得BMP粗品;
[0009]2)纯化:
[0010]a)取160mg BMP粗品,复溶于1ml的Buffer A中,20,000g下离心30min,取上清液对160mm X 1mm的肝素亲和层析柱加样;
[0011]所述BufferA的组成为6mol/L脈/50mmol/L Tris.HC1/0.lmol/L NaCl ,pH 7.0;
[0012]b)层析柱以120cm/h的速度依次用以下三种缓冲液洗脱处理:Buffer A、含有
0.15mol/L NaCl的Buffer A的Buffer B和含有0.5mol/L NaCl的Buffer A的Buffer C分别洗脱,收集Buffer C洗脱下来的蛋白质,获得BMP-3。
[0013]还提供了一种含有本发明提取获得的BMP-3的骨修复注射剂,由BMP-3、胶原蛋白、磷脂及助剂组成,其中骨修复注射剂中BMP-3的浓度为1.0-2.0mg/ml,胶原蛋白的质量百分浓度为2-5 %,磷脂的浓度为0.5-1.5mg/ml,余量为助剂。
[0014]本发明提供的骨修复注射剂中助剂包括PEG、泊洛沙姆或PVP。
[0015]泊洛沙姆(poloxamer)是聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的非专利名,其商品名为普朗尼克(Pluronic)。
[0016]本发明提供的骨修复注射剂中PEG的质量百分浓度为15%。
[0017]本发明提供的骨修复注射剂中泊洛沙姆的质量百分浓度为15.25%。
[0018]本发明提供的骨修复注射剂中PVP的质量百分浓度为15%。
[0019]本发明提供的骨修复注射剂中PEG为PEG 2000,泊洛沙姆为po1xamer 124、poloxamer 188、poloxamer 237、poloxamer 338或poloxamer 407。
[0020]本发明还提供了一种制备骨修复注射剂的制备方法,在无热原水中依次加入BMP-
3、胶原蛋白后匀浆、过滤并洗脱,在洗脱液中加入磷脂及助剂,混匀后加入装入安剖瓶内,冻干后,得到骨修复注射剂。
[0021]本发明提供的骨修复注射剂的制备方法中,匀浆后,加入质量百分浓度为10%的戊二醛溶液,于室温下搅拌2-4h后,过截留分子量为10,000Da的微孔滤膜,将留在微孔滤膜上BMP-3与交联物用无热原水冲洗得洗脱液。
[0022]与最接近的现有技术比,本发明提供的制备工艺条件优化,提取的BMP纯度高、活性高、利用率高;优化骨修复注射剂的组分及比例,选择最适载体制得的骨修复注射剂需用量少、效果显著、使用方便。
[0023]下面,通过本发明提供的制备工艺结合实际操作,做进一步说明:
[0024]提取BMP-3:
[0025]选取新鲜小牛四肢骨,将牛腿皮质骨用液氮遇冷后粉碎制成骨粉,依次经1:1氯仿/甲醇处理12h,10%过氧化氢氧化处理12h,于室温下0.6mol/L盐酸处理5min,离心得到分离液调节PH 7.2,加入其总重0.0006%的胶原酶于37°C无菌条件下浸提24h后得到的液体于室温减压浓缩后溶于提取液使其终浓度为6mol/L脲/0.5mol/L CaCl2,提取24h,滤液经截流分子量为70KD的微孔滤膜过滤,滤液经透析、离心后得到粗制BMP,将其溶于纯化液(4mol/L盐酸胍/0.5mol/L CaCl2)中,上清液再经透析、离心后得到BMP粗品。取160mg BMP粗品复溶于1mL的平衡缓冲液中(Buffer A:6mol/L脲/50mmol/L Tris.HC1/0.lmol/LNaCl,pH 7.0),以20000g的速度离心30min,除去其中不溶物,取滤液用160_X 10mm的肝素亲和层析柱加样。层析柱以120cm/h的速度分别按次序用以下三种缓冲液洗脱处理,SPBuffer A溶液,Buffer B液(含有0.15mol/L NaCl的Buffer A)及用Buffer C液洗脱(含有
0.5mol/L NaCl的Buffer A),分别收集洗脱下来的蛋白质,经透析、离心、冻干后保存,测质量。
[0026]蛋白相对分子量的测定:
[0027]采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将纯化后的蛋白质溶于含有二硫苏糖醇(DTT)或不含有DTT的样品缓冲液中,90 °C加热4min,离心后用上清液加样。电泳凝胶为50ml/L的积层胶、125ml/L的分离胶。电泳完毕后,用考马斯亮蓝R 250染色,再测其相对分子量。
[0028]将部分纯化的蛋白质加人层析柱后,洗脱液以120cm/h的速度洗脱。用BufferA洗脱时,未吸附的蛋白质基本都流出;改用Buffer B液(含有0.15mol/L NaCl),洗脱吸附较弱的蛋白,PH值下降,离子浓度增加,且有较大量的杂蛋白流出,称为B峰;用含有0.5mol/LNaCl的Buffer C液洗脱时,获得C峰,此峰为我们主要收集的目的蛋白。A段蛋白与肝素亲和层析无亲和力,故弃去不用,将B峰、C峰收集的蛋白对四蒸水进行透析约24h,其间换液3次。透析发现,C峰蛋白有白色絮状沉积,表明不溶于水;而B峰蛋白透析液仍澄清透明,均溶于水。将C峰蛋白真空冻干后,测其质量为8.23mg,纯化近20倍。
[0029]纯化后BMP电泳结果如图2所示,纯化后的蛋白成份较为单一,纯度较高,蛋白Mr约为35X 103(图2B),经还原处理后,蛋白Mr变为22父103,也为单一的一条带(图20。
[0030]对蛋白进行成分分析,已经确认是一种酸性混合蛋白,等电点为4左右,蛋白相对分子质量的测定:采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,它多用于蛋白质及核酸的测定。将纯化后的蛋白质溶于含有二硫苏糖醇(DTT)或不含有DTT的样品缓冲液中,90 °C加热3-5min,离心后用上清加样.电泳凝胶为50mL/L的积层胶、125mL/L的分离胶。电泳完毕后,用考马斯亮蓝R250染色,再测其相对分子质量。对含BMP的提取物进行SDS凝胶电泳分析,其分子量从14X 13到44X 103。其中肝素亲和层析纯化及SDS凝胶电泳揭示的35X 13的电泳带。依靠离子间作用力洗脱,经洗脱得到3个峰,一个峰是分子量35 X 103,一个峰是水溶性的蛋白,一个峰被称为非35X 13蛋白。该蛋白提取物活性物质由3个部分组成;
[0031](I)被鉴别出的35X 103蛋白BMP-3
[0032](2)—种水溶性的蛋白系被降解的胶原蛋白。
[0033](3)非35 X 13蛋白,系几种蛋白的混合物。
[0034]其中有大于14X 13至小于22X 13的蛋白。这些蛋白是BMP的单链,30X 13蛋白是BMP-2o
[0035]B峰蛋白透析液澄清透明,溶于水,系被降解的胶原蛋白。C峰四蒸水进行透析液,呈白色絮状沉积,蛋白Mr约为35 X 103,经还原处理后,蛋白Mr变为22 X 103,为单一的一条带。按肝素亲和层析纯化及SDS凝胶电泳分析,蛋白提取物中骨形态发生蛋白为BMP-3。该30mg部分纯化的BMP蛋白中含有BMP-3 1.5mg,每份供注射用骨修复剂中含有1.5mg骨修复蛋白BMP-3。
[0036]制备骨修复注射剂:
[0037]1.取BMP-3的蛋白加入无热原水,使BMP-3蛋白浓度为1.0mg_2.0mg/ml,其胶原蛋白的重量浓度为2-5%即20mg-50mg/ml,勾楽,加入终浓度为15.25%的poloxamer 407混合,罐装于2ml安剖瓶内,每份供注射用骨修复剂中含有1.5mg骨修复蛋白BMP-3。经冷冻干燥后得成品。
[0038]2.取含有BMP-3蛋白加入无热原水,使的BMP-3蛋白浓度为1.0mg-2.0mg/ml,其胶原的重量浓度为2-5 %,匀浆,加入终浓度为15 %的PEG 2000混合,每份供注射用骨修复剂中含有骨修复蛋白BMP-3 1.5mg。罐装于2ml安剖瓶内,冷冻干燥后得成品。
[0039]3.取含有BMP-3蛋白加入无热原水1ml,使BMP-3蛋白浓度为1.0mg-2.0mg/ml,其胶原的重量浓度为2-5 %,匀浆,加入1 %的戊二醛溶液5ml混合,搅拌3h后,过截留分子量为10,000Da的微孔滤膜,将留在微孔滤膜上的BMP-3蛋白与胶原的交联物用无热原水洗下来,加入终浓度为15 %的PEG 2000混合,罐装于4支2ml安剖瓶内,每份供注射用骨修复剂中含有骨修复蛋白BMP-3 1.5mg。冷冻干燥后得成品。
[0040]4.取含有BMP-3蛋白加入无热原水1ml,使BMP-3蛋白浓度为1.0mg-2.0mg/ml,其胶原的重量浓度为2-5%,匀浆,加入10%浓度的戊二醛溶液5ml混合,搅拌3小时后,过截留分子量为10,000Da的微孔滤膜,将留在微孔滤膜上的BMP-3蛋白与胶原的交联物用无热原水洗下来,加入终浓度为15.25 %的poloxamer 407混合后,分别罐装于4支2ml安剖瓶内,每份供注射用骨修复剂中含有骨修复蛋白BMP-3 1.5mg。冻干得成品。
[0041 ] 5.取BMP-3蛋白加入无热原水1ml,使BMP-3蛋白浓度为1.5mg/ml,其胶原的重量浓度为3 %,匀浆,加入10%浓度的戊二醛溶液5ml混合,搅拌3小时后,过截留分子量为10,OOODa的微孔滤膜,将留在微孔滤膜上的BMP-3蛋白与胶原的交联物用无热原水洗下来,加入终浓度为15 %的PVP混合,冷冻干燥后装入4支2ml安剖瓶里,每份供注射用骨修复剂中含有骨修复蛋白BMP-3 1.5mg得成品。
[0042]6.取含有BMP-3蛋白加入无热原水10ml,使BMP-3蛋白浓度为1.00mg/ml,其胶原的重量浓度为2%,加入注射剂用磷脂10mg匀浆,加入终浓度在15%PVP混合,罐装于4支2ml安剖瓶内,每份供注射用骨修复剂中含有骨修复蛋白BMP-3 1.5mg冷冻干燥后得成品。
[0043]7.取BMP-3蛋白加入无热原水,使BMP-3蛋白浓度为2.0mg/ml,其胶原的重量浓度为5 %,加入注射剂用磷脂10mg,匀浆,加入终浓度为15.25 %的poloxamer 407混合,每份供注射用骨修复剂中含有骨修复蛋白BMP-3 1.5mg,冷冻干燥后得成品。
[0044]8.取BMP-3蛋白加入无热原水,使BMP-3蛋白浓度为1.0mg_2.0mg/ml,其胶原的重量浓度为2-5 %,加入注射剂用磷脂10mg,匀浆,加入终浓度在15%的PEG 2000,混合,每份供注射用骨修复剂中含有骨修复蛋白BMP-3 1.5mg,冷冻干燥后得成品。
【【附图说明】】
[0045]图1为BMP的Heparin Sepharose C1-6B层析图;
[0046]图2为纯化后BMP的电泳结果。
【【具体实施方式】】
[0047]实施例1提取活性蛋白BMP-3:
[0048]选取新鲜小牛四肢骨,将牛的腿皮质骨用液氮遇冷后粉碎骨干制成骨粉,经1:1氯仿/甲醇处理12h,10%过氧化氢氧化处理12h,室温下0.6mol/L盐酸处理5min,离心后得到的分离液调节PH 7.2,加入0.0006%胶原酶于37°(:无菌条件下浸提24h后得到的液体于室温减压浓缩后溶于提取液使其终浓度6mol/L脲/0.5mol/L CaCl2,提取24h,滤液经截流分子量为70KD的微孔滤膜过滤得滤液,经透析、离心后得到粗制BMP,将其复溶于纯化液(4mol/L盐酸胍/0.5mol/L CaCl2),上清再经透析、离心后得到了部分纯化的BMP。取160mg部分纯化的BMP蛋白复溶于1ml的平衡缓冲液中(Buffer A:6mol/L脲/50mmol/L Tris.HC1/0.lmol/L NaClpH 7.0),以20000g的速度离心30min,除去其中不溶的物质。用上清对160mmX 1mm的肝素亲和层析柱加样。层析柱分别按次序用以下三种缓冲液洗脱,即含有
0.1,0.15,0.5mol/L NaCl 的 Buffer A 溶液,Buffer B液(含有 0.15mol/L NaCl)及用含有
0.5mol/L NaCl的Buffer C液洗脱,B峰蛋白透析液澄清透明,溶于水,系被降解的胶原蛋白。C峰四蒸水进行透析液,呈白色絮状沉积,蛋白Mr约为35 X 103,经还原处理后,蛋白Mr变为22X 103,为单一的一条带。按肝素亲和层析纯化及SDS凝胶电泳分析,蛋白提取物中骨形态发生蛋白为BMP-3。该30mg部分纯化的BMP蛋白中含有BMP-3 1.5mg,每份供注射用骨修复剂中含有1.5mg骨修复蛋白BMP-3。
[0049]实施例2
[0050]取BMP-3的蛋白加入无热原水,使BMP-3蛋白浓度为2.0mg/ml,其胶原的重量浓度为4%即40mg/ml,匀浆,加入终浓度为15.25%的poloxamer 407混合,经冷冻干燥后得成品。实施例3
[0051 ] 取含有BMP-3蛋白加入无热原水,使的BMP-3蛋白浓度为1.0mg/ml,其胶原的重量浓度为3%,匀浆,加入终浓度为15%的PEG 2000混合,冷冻干燥后得成品。
[0052]实施例4
[0053]取含有BMP-3蛋白加入无热原水10ml,使BMP-3蛋白浓度为1.5mg/ml,其胶原的重量浓度为2.5%,匀浆,加入10%的戊二醛溶液5ml混合,搅拌3小时后,过截留10,OOODa的微孔滤膜,将留在微孔滤膜上的BMP-3蛋白与胶原的交联物用无热原水洗下来,加入终浓度为15%的PEG 2000混合,冷冻干燥后得成品。
[0054]实施例5
[0055]取含有BMP-3蛋白加入无热原水1ml,使BMP-3蛋白浓度为2mg/ml,其胶原的重量浓度为3.5%,勾浆,加入10%浓度的戊二醛溶液5ml混合,搅拌3小时后,过截留10,OOODa的微孔滤膜,将留在微孔滤膜上的BMP-3蛋白与胶原的交联物用无热原水洗下来,加入终浓度为15.25%的poloxamer 407混合后,冷冻干燥。
[0056]实施例6
[0057]取BMP-3蛋白加入无热原水10ml,使BMP-3蛋白浓度为1.0mg/ml,其胶原的重量浓度为4.5%,勾浆,加入10%浓度的戊二醛溶液5ml混合,搅拌3小时后,过截留10,000道尔顿的微孔滤膜,将留在微孔滤膜上的BMP-3蛋白与胶原的交联物用无热原水洗下来,加入终浓度为15 %的PVP混合,冷冻干燥得成品。
[0058]实施例7
[0059]取含有BMP-3蛋白加入无热原水10ml,使BMP-3蛋白浓度为1.5mg/ml,其胶原的重量浓度为2.5%,加入注射剂用磷脂I OOmg匀浆,加入终浓度在15 % PVP混合,冷冻干燥后得成品。
[0060]实施例8
[0061 ] 取BMP-3蛋白加入无热原水,使BMP-3蛋白浓度为1.5mg/ml,其胶原的重量浓度为2-5%,加入注射剂用磷脂10mg,匀浆,加入终浓度为15.25%的poloxamer 407混合,冷冻干燥后得成品。
[0062]实施例9
[0063]取BMP-3蛋白加入无热原水,使BMP-3蛋白浓度为1.5mg/ml,其胶原的重量浓度为3 %,加入注射剂用磷脂10mg,匀浆,加入终浓度在15 %的PEG 2000混合,冷冻干燥后得成品。实施例10提取BMP-3
[0064]将牛的腿皮质骨5kg,将牛的腿皮质骨用液氮遇冷后粉碎骨干制成骨粉,经1:1氯仿/甲醇处理12h,10%过氧化氢氧化处理12h,室温下0.6mol/L盐酸处理5min,离心后得到的骨粉调节PH 7.2加入0.0006%胶原酶于37°C无菌条件下浸提24h后的液体于室温减压浓缩将其连同骨粒形成的骨基质明胶溶于提取液使终浓度6mol/L脲/0.5mol/L CaCl提取24h,上清液经截流分子量70KD的微孔滤膜过滤得滤液,经透析、离心后得到粗制BMP,将其复溶于纯化液(4mol/L盐酸胍/0.5mol/L CaCl),上清再经透析、离心后得到了部分纯化的BMP。
[0065]取160mg部分纯化的BMP蛋白复溶于1ml的平衡缓冲液中(Buffer A:6mol/L脲/50mmol/L Tris.HC1/0.lmol/L NaCl pH 7.0),以20,000g的速度离心30min,除去其中不溶的物质。用上清对160mmX 1mm的肝素亲和层析柱加样。层析柱分别按次序用以下三种缓冲液洗脱,即含有0.1,0.15,0.5mol/L NaCI的Buffer A溶液,Buffer B液(含有0.15mol/LNaCl)及用含有0.5mol/L NaCl的Buff er C液洗脱,B峰蛋白透析液澄清透明,溶于水,系被降解的胶原蛋白。C峰四蒸水进行透析液,呈白色絮状沉积,蛋白Mr约为35X 103,经还原处理后,蛋白Mr变为22X 103,为单一的一条带。按肝素亲和层析纯化及SDS凝胶电泳分析,蛋白提取物中骨形态发生蛋白为BMP-3。该30mg部分纯化的BMP蛋白中含有BMP-3 1.5mg。
[0066]以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1.一种BMP-3的提取方法,包括下述步骤: 1)粗提: 将粉碎后的小牛腿皮质骨依次经1:1氯仿/甲醇处理10-15h,3-10%的H2O2处理10-15h,于室温下用0.6mol/L的HCl处理3-6min,将离心得到的分离液于37°C下调pH至7.2并加入其总重0.0006%的胶原酶浸提2411,减压浓缩后溶于终浓度为611101/1脲/0.511101/1 CaCl2中提取24h,分离液经截留分子量为70KD的微孔滤膜过滤,经透析、离心后得粗制BMP,将其复溶于4mol/L盐酸胍/0.5mol/L CaCh中,滤液再经透析,离心得BMP粗品; 2)纯化: a)取160mgBMP粗品,溶于1ml的Buffer A中,20,000g下离心30min,取上清液对160mmX 1mm的肝素亲和层析柱加样; 所述Buffer A的组成为6mol/L脈/50mmol/L Tris.HC1/0.lmol/L NaCl ,pH 7.0; b)层析柱以120cm/h的速度依次用以下三种缓冲液处理:BufferA、含有0.15mol/LNaCl的Buffer A的Buffer B和含有0.5mol/L NaCl的Buffer A的Buffer C分别洗脱,收集Buffer C洗脱下来的蛋白质,获得所述BMP-3。2.一种含有如权利要求1所述提取方法获得的BMP-3的骨修复注射剂,由BMP-3、胶原蛋白、磷脂及助剂组成,其特征在于:骨修复注射剂中所述BMP-3的浓度为1.0-2.0mg/ml,胶原蛋白的质量百分浓度为2-5 %,磷脂的浓度为0.5-1.5mg/ml,余量为助剂。3.如权利要求2所述的骨修复注射剂,其特征在于所述助剂包括PEG、泊洛沙姆或PVP。4.如权利要求3所述的骨修复注射剂,其特征在于所述PEG的质量百分浓度为15%。5.如权利要求4所述的骨修复注射剂,其特征在于所述PEG为PEG2000。6.如权利要求3所述的骨修复注射剂,其特征在于所述泊洛沙姆的质量百分浓度为15.25%。7.如权利要求6所述的骨修复注射剂,其特征在于所述泊洛沙姆为po1xamer124、poloxamer 188、poloxamer 237、poloxamer 338或poloxamer 407。8.如权利要求3所述的骨修复注射剂,其特征在于所述PVP的质量百分浓度为15%。9.一种如权利要求2所述的骨修复注射剂的制备方法,其特征在于:在无热原水中依次加入BMP-3和胶原蛋白后匀浆,过滤并洗脱,在洗脱液中加入磷脂及助剂,混匀后加入装入安It1J瓶内,冻干后,得所述骨修复注射剂。10.如权利要求9所述的制备方法,其特征在于:匀浆后,加入质量百分浓度为10%的戊二醛溶液,于室温下搅拌2-4h后,过截留分子量为10,000Da的微孔滤膜,将留在微孔滤膜上BMP-3与交联物用无热原水冲洗得所述洗脱液。
【文档编号】C07K1/34GK105837682SQ201610183898
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月28日
【发明人】宋富智, 梁世昌, 宋德顺
【申请人】天津中津生物发展有限公司
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