一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用

文档序号:10482793
一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用
【专利摘要】本发明涉及医学生物工程技术领域,具体是一种抗RNA表观遗传修饰m6A的单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的复合物、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以及该单抗在检测不同器官组织、不同发育阶段器官组织及肿瘤组织中RNA甲基化程度的应用。本发明的单克隆抗体可特异性识别吸附在硝酸纤维素膜上的变性状态下的m6A分子,实现准确、灵敏地检测RNA的甲基化水平及m6A在RNA转录物的分布,可用于研究RNA甲基化修饰对人类器官发育和肿瘤发生等生理及病理过程的调控作用,对基因表达的转录后调控机制及相关疾病的研究具有十分重大的意义。CCTCC No:C20161920160122
【专利说明】
一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及医学生物工程技术领域,具体地说,是一种抗m6A单克隆抗体,以及该 单克隆抗体在研究RNA甲基化修饰对人类器官发育和肿瘤发生等生理及病理过程的调控作 用中的应用。
【背景技术】
[0002] 化学修饰是人类基因组丰富的组件,存在于DNA和蛋白质上,其动态变化通过参与 基因表达调控,决定细胞的状态,影响细胞的分化和发育。最新的研究表明,RNA的化学修饰 也存在这类似的动态调控机制。其中,m6A作为真核生物最常见的RNA转录后修饰形式,成为 了近年来表观遗传学研究的热点。m6A是发生在碱基A第六位N原子上的甲基化修饰形式,广 泛出现在mRNA、tRNA、rRNA以及ncRNA中,其导致了超过80 %的RNA碱基甲基化。研究证实,基 于m6A修饰的RNA甲基化调控通过调节RNA的代谢,参与机体发育、代谢及繁殖的整个过程。 该表观修饰表达丰度的变化与肥胖和糖尿病等多种疾病密切相关。但目前人们对m6A的研 究还十分有限,其在转录物中的分布和具体生物学功能仍不明确。
[0003] 因此,制备具有高特异性、高亲和力的m6A单克隆抗体,实现准确、灵敏地检测RNA 的甲基化水平及m6A在RNA转录物的分布,对基因表达的转录后调控机制及相关疾病的研究 具有十分重大的意义。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种抗RNA表观遗传修饰m6A的单克隆抗体、用于制备该单 克隆抗体的复合物、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以及该单抗在检测不同器官组织、 不同发育阶段器官组织及肿瘤组织中RNA甲基化程度的应用。
[0005] 本发明针对m6A的分子量只有281Da,免疫原性较弱的问题,在抗体制备过程中通 过与半抗原偶联提高m6A的免疫原性。常见的半抗原包括BSA、0VA和KLH,鉴于KLH分子量最 大、免疫原性最好,本发明通过活化KLH的羧基基团与m6A的氨基偶联,形成具有较好免疫原 性的蛋白-核苷偶联复合物。
[0006] 本发明克服传统ELISA筛选方法假阳性多、工作量大的缺陷,采用多轮点杂交技术 筛选出高特异性、高亲和力的单克隆抗体细胞株,作为抗m6A单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0007] 本发明的单克隆抗体的获得采用了本技术领域常规的方法,即通过在小鼠体内接 种杂交瘤细胞并产生腹水抗体,取出腹水经纯化而得到。
[0008] 本发明的第一方面,提供一种用于制备抗m6A单克隆抗体的蛋白-核苷偶联复合物 (简称KLH-m6A复合物),包括核苷及其偶联的载体蛋白。其中核苷是m6A,其化学结构如下式 所示;其中偶联的载体蛋白是钥孔血蓝蛋白(KLH,keyhole limpet hemocyanin),其氨基酸 序列如SEQ ID N0:1所示;
[0009]
[0010] 本发明的第二方面,提供一种抗m6A单克隆抗体,是由保藏编号为CCTCC No: C201619的杂交瘤细胞株分泌产生。
[0011] 本发明的第三方面,提供一种杂交瘤细胞株,命名为RME,保藏于中国典型培养物 保藏中心(简称CCTCC),保藏日期2016年1月22日,保藏编号CCTCC N〇:C201619。
[0012] 本发明的第四方面,提供一种上述抗m6A单克隆抗体的制备方法,包括以下步骤: [0013] a)合成上述的由核苷m6A和载体蛋白KLH组成的KLH-m6A复合物;
[0014] b)将上述复合物作为免疫原免疫小鼠;
[0015] c)获取免疫小鼠的脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞融合;
[0016] d)经过多轮筛选获得分泌识别m6A单分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;
[0017] e)通过在小鼠体内接种上述杂交瘤细胞生产腹水抗体,将腹水进行纯化,得到所 述的抗m6A单克隆抗体。
[0018] 较优的,所述的步骤b中将成功获得的KLH-m6A复合物同免疫佐剂混合。
[0019] 较优的,所述的步骤c中免疫小鼠为鼠龄8~12周的雌性BALB/c健康小鼠;取免疫 小鼠的脾脏细胞同小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)细胞进行融合。
[0020] 较优的,所述的步骤d中采用倍比稀释技术制备单克隆细胞株,经多轮点杂交技术 筛选出高特异性、高亲和力的单克隆抗体细胞株,作为抗m6A单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0021] 较优的,所述的步骤e中扩大培养杂交瘤细胞至106个,接种小鼠腹腔,生产腹水抗 体,将腹水应用IgG抗体纯化试剂盒纯化获得抗m6A线性表位的单克隆抗体。
[0022] 本发明的第五方面,提供上述用于制备抗m6A单克隆抗体的蛋白-核苷偶联复合物 在制备用于检测RNA甲基化的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
[0023] 本发明的第六方面,提供上述抗m6A单克隆抗体在制备用于检测RNA甲基化的免疫 检测试剂或试剂盒中的应用。
[0024] 本发明的第七方面,提供上述杂交瘤细胞株在制备用于检测RNA甲基化的免疫检 测试剂或试剂盒中的应用。
[0025]较优的,上述的免疫检测试剂或试剂盒为点杂交、Northern Blot或免疫共沉淀等 的试剂或试剂盒。
[0026]较优的,上述的免疫检测试剂或试剂盒是检测不同器官组织、不同发育阶段器官 组织及肿瘤组织中RNA甲基化程度的试剂或试剂盒。所述的肿瘤为肝癌。
[0027]本发明优点在于:
[0028]本发明提供一种抗RNA表观遗传修饰m6A的具有高特异性、高亲和力的单克隆抗 体,该单克隆抗体是一种免疫球蛋白,可特异性识别吸附在硝酸纤维素膜上的变性状态下 的m6A分子,实现准确、灵敏地检测RNA的甲基化水平及m6A在RNA转录物的分布,可用于研究 RNA甲基化修饰对人类器官发育和肿瘤发生等生理及病理过程的调控作用,对基因表达的 转录后调控机制及相关疾病的研究具有十分重大的意义。
[0029] 生物材料样品的保藏信息:
[0030] 保藏单位:中国典型培养物保藏中心(CCTCC)
[0031] 地址:中国湖北省武汉市武汉大学 [0032] 保藏日期:2016年1月22日
[0033] 保藏编号:CCTCC N〇:C201619
[0034] 分类命名:杂交瘤细胞株RME
【附图说明】
[0035] 图1是点杂交检测图,其中A是普通细胞培养上清与m6A结合的点;B是杂交瘤细胞 株培养上清与m6A结合的点。
[0036] 图2是Northern Blot检测图,其中1、2、3条带分别是肝癌组织RNA抽提物、LM3细胞 RNA抽提物和7701细胞RNA抽提物与杂交瘤细胞培养上清结合的图,4是空白对照。
【具体实施方式】
[0037]下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0038]实施例1 .m6A偶联复合物的制备:
[0039]本发明将抗原m6A与钥孔血蓝蛋白KLH偶联,以偶联物作为免疫原,增强小分子m6A 的免疫原性。本发明使用商品化偶联试剂盒(ReadiLink? KLH Conjugation kit,AAT BioquestK')进行偶联,具体操作步骤如下:
[0040] 1 ·准备 KLH-m6A 连接
[00411 1)用200ul的ddH20来溶解KLH(禁忌漩涡振荡和加热)。
[0042] 2)称取2mg的m6A,用450ul的偶联缓冲液(conjugation bufferrong)溶解。
[0043] 3)将200ul的KLH溶液和450ul的m6A进行混合,成为KLH-m6A混合液。
[0044] 4)用1ml的ddH20溶解EDC,取50ul加入KLH-m6A混合液,迅速并轻柔混匀,然后室温 孵育2h。
[0045] 2.将KLH_m6A进行去盐离子纯化
[0046] 1)用10ml的ddH2〇来稀释纯化缓冲液(Purification Buffer Salts)。
[0047] 2)扭下去盐离子柱的底座,松开盖子,将柱子放在收集管中。
[0048] 3)l,000g离心2分钟,弃储存液。
[0049] 4)加 lml的纯化缓冲液(Purification Buffer Salts),1,000g离心2分钟,弃滤液 再重复三次。
[0050] 5)将离心柱置于新的收集管,小心地将室温孵育2h后的样品加入去盐离子柱的中 心,1,000g离心2分钟。
[00511 6)收集样本于1.5ml EP管,-20度储存。
[0052]实施例2.抗m6A的单克隆抗体的制备和纯化 [0053] 1.抗原混合液的制备
[0054] 取25ul的m6A偶联复合物,加入25ul的生理盐水进行,成为50ul的抗原稀释液,与 50ul的佐剂迅速混合,即100ul的抗原混合液(此为每只BABL/C小鼠的免疫用量)。
[0055] 2.免疫动物
[0056] 本发明所用免疫动物为BALB/c小鼠,免疫佐剂为KX0210041,购自北京博奥龙免疫 技术有限公司。
[0057] 1)腿部肌肉注射免疫BABL/C小鼠(100ul/只)。
[0058] 2)每隔一个月进行重复免疫,免疫三次。
[0059] 3.单克隆抗体的制备和纯化
[0060] 将成功获得的抗原混合免疫鼠龄为8~12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采取小鼠 快速免疫方式,将3只小鼠的脾脏混合进行融合。
[0061] 免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,融合后的细胞经 过适当稀释,分置于96孔培养板中培养,培养10-14天进行ELISA检测,挑选0D值高的孔中的 细胞进行有限稀释法亚克隆。
[0062]具体方法如下:
[0063] 1)将有限稀释的细胞培养至96孔板中,待克隆生长到全孔的1/6时,标记单克隆及 多克隆,对单克隆进行ELISA检测。
[0064] 2)ELISA检测后将0D值最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚 克隆,此过程重复数次,直至阳性孔比率为100%,即认为此为单克隆。即通常认为的建株成 功的细胞株。
[0065] 3)将筛选得到的阳性单克隆扩大培养,细胞数按1-2 X106/管进行冻存。同时收集 细胞安排腹水制备。
[0066] 4)细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水,10-14天收集腹水,ELISA检测腹水是否 制备成功。
[0067] 5)腹水完成后采用Protein G柱纯化腹水。
[0068]实施例3.抗m6A的单克隆抗体的鉴定及检测应用 [0069] 1.单克隆抗体的点杂交检测应用:
[0070]分别将m6A核苷溶液和KLH蛋白溶液点样于硝酸纤维素膜上,待溶液吸干,加封闭 液于室温封闭至少lh;PBST洗液洗膜5次,用所制备的单克隆抗体作为一抗,4°C孵育过夜。 孵育结束后用PBST洗液洗膜5次,抗体稀释液稀释HRP标记的抗小鼠二抗,孵育lh,PBST洗液 洗膜5次。用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒进行显色,结果如图1所示。
[0071] 结果表明该单克隆抗体能较为特异性地识别m6A,而不识别载体蛋白KLH。
[0072] 2.单克隆抗体的Northern Blot检测应用:
[0073] 变性的小鼠肝癌组织RNA、LM3细胞RNA和7701细胞RNA进行琼脂糖电泳;通过虹吸 将RNA转移至尼龙膜上;紫外灯下交联;含10 %脱脂奶粉的PBS封闭lh; PBST洗液洗膜5次,用 所制备的单克隆抗体作为一抗,4°C孵育过夜。孵育结束后用PBST洗液洗膜5次,抗体稀释液 稀释HRP标记的抗小鼠二抗,孵育lh,PBST洗液洗膜5次。用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒 进行显色,结果如图2所示。
[0074] 结果表明单克隆抗体可用于分析组织和细胞来源的RNA中m6A的分布。
[0075]以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述 实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的 变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 一种用于制备抗m6A单克隆抗体的蛋白-核巧偶联复合物,包括核巧及其偶联的载体 蛋白,其中核巧是m6A,其化学结构如下式所示;其中偶联的载体蛋白是钥孔血蓝蛋白,其氨 基酸序列如SEQ ID NO: 1所示;2. -种抗m6A单克隆抗体,是由保藏编号为CCTCC N〇:C201619的杂交瘤细胞株分泌产 生。3. -种杂交瘤细胞株,其保藏编号为CCTCC No: C201619。4. 一种如权利要求2所述的抗m6A单克隆抗体的制备方法,其特征在于,包括W下步骤: a) 合成如权利要求1所述的蛋白-核巧偶联复合物; b) 将上述复合物作为免疫原免疫小鼠; C)获取免疫小鼠的脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞融合; d) 经过多轮筛选获得分泌识别m6A单分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞株; e) 通过在小鼠体内接种上述杂交瘤细胞生产腹水抗体,将腹水进行纯化,得到所述的 抗m6A单克隆抗体。5. -种如权利要求1所述的用于制备抗m6A单克隆抗体的蛋白-核巧偶联复合物在制备 用于检测RNA甲基化的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。6. -种如权利要求2所述的抗m6A单克隆抗体在制备用于检测RNA甲基化的免疫检测试 剂或试剂盒中的应用。7. -种如权利要求3所述的杂交瘤细胞株在制备用于检测RNA甲基化的免疫检测试剂 或试剂盒中的应用。8. 如权利要求5-7任一所述的应用,其特征在于,所述的免疫检测试剂或试剂盒为点杂 交、Ncxrthern Blot或免疫共沉淀的试剂或试剂盒。
【文档编号】G01N33/53GK105837684SQ201610296488
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】孙树汉, 王芳, 朱怡卿, 刘岩, 马金召, 黄金凤, 袁继行, 杨富, 薛赓
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
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