一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法
一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法。该方法先用壳聚糖和甲壳素的混合物吸附分离得到乌司他丁粗品，然后将粗品与海藻酸盐混合后依次进行超滤、阴离子交接树脂纯化、超滤，最后将超滤后得到的截留液冷冻干燥，得到乌司他丁纯品。由本申请提供的基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法，缩短了纯化工艺，乌司他丁的收率和纯度高，其中，乌司他丁的收率达到87％；比活力达到4900IU/mg蛋白。
【专利说明】
一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方 法。
【背景技术】
[0002] 乌司他丁系从男性尿中分离纯化出的一种酸性糖蛋白。据文献报道，其是由143个 氨基酸组成，在第10位丝氨酸和45位天冬氨酸上有糖链，结构表面含有大量非极性疏水基 团，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸等。乌司他丁的分子量经HPLC法测定为60~70KD，经 SDS-PAGE测定为40~50KD，等电点位于2-3之间。
[0003] 由于结构中的两个活性功能区均具有很广的抑酶谱，所以能同时抑制胰蛋白酶、 磷脂酶A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种水解酶的活性;而且，乌司他丁分解形成的低分 子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用。乌司他丁不仅是一种广谱的蛋白酶抑制剂，还 具有抑制心肌抑制因子的产生、改善休克时的循环状态、稳定溶酶体膜、抑制炎症介质的释 放等功能。大量临床试验结果显示，乌司他丁在治疗急性胰腺炎、辅助治疗休克、改善手术 刺激引起的免疫功能下降、尤其是减少体外循环并发症等方面有重要的作用，加上其本身 来源于人体，无免疫原性，安全性高。
[0004] 但由于尿液中乌司他丁的含量较少，其分离及纯化工艺成为制约其应用的关键因 素。
[0005] 关于乌司他丁的分离及纯化方法，国内报道较少。经检索，已公开的中国专利申请 文献仅21篇。由青岛康原药业有限公司公开的中国专利申请CN2015108204251《一种树脂再 生提高柱效纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁复溶性的药物组合物》和 CN2014108077092《一种树脂再生提高柱效乌司他丁的方法及含有乌司他丁的药物组合物》 均利用阴离子交换柱、亲和层析柱及超滤相结合的方法对乌司他丁粗品进行纯化的方法。
【申请人】在之前的专利文献CN2006100002002《纯化的乌司他丁及其制备方法和含有该乌司 他丁的药物组合物》中采用阴离子交换柱、超滤和金属螯合柱、疏水柱和凝胶柱结合对乌司 他丁粗品进行纯化。
[0006] 上述公开的乌司他丁的纯化方法均采用多次树脂柱进行纯化。但对于一定体积的 尿液，纯化工艺越复杂，在一定程度上可以提高乌司他丁的纯度，而乌司他丁的收率却受到 影响。如何协调乌司他丁的纯化工艺与其收率及纯度的关系，成为科研人员亟待解决的问 题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供一种基于阴离子交换树脂 纯化乌司他丁的方法，以在保证乌司他丁的纯度和收率的同时，减化其纯化工艺，达到节约 成本、减少时间和人力成本的目的。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明提供了一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的 方法，其具体步骤如下：
[0009] 1)取澄清尿液，调节pH至6-6.5，加入硅胶，搅拌，过滤，得滤液，调节滤液pH至3-5， 继续向滤液中加入壳聚糖-甲壳素混合物，搅拌至吸附完全，依次用氨水洗脱、硫酸铵盐析， 静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
[0010] 2)向乌司他丁粗品中加入pH=5-5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，向溶液 中加入海藻酸盐，搅拌，静置，离心，得下层沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH 至6-6.5,超滤，得截留液1;
[0011] 3)调节截留液1的pH=6-6.5,将其上阴离子交换树脂，然后用pH=6-6.5的磷酸盐 缓冲液和〇. 8-2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗脱液1;
[0012] 4)将洗脱液1超滤，得截留液2;
[0013] 5)将截留液27令冻干燥，即得纯乌司他丁。
[0014]优选地，本发明提供的基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法，其具体步骤如 下：
[0015] 1)取澄清尿液，调节pH至6-6.5，以每t尿液加入8-12kg硅胶的比例加入硅胶，搅 拌，过滤，得滤液，调节滤液pH至3-5,继续向滤液中以每t尿液加入8-12kg壳聚糖-甲壳素混 合物的比例加入壳聚糖-甲壳素混合物，搅拌至吸附完全，依次用氨水洗脱、硫酸铵盐析，静 置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
[0016] 2)向乌司他丁粗品中加入pH=5-5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，继续向 溶液中以乌司他丁粗品：海藻酸盐=1: (〇. 〇 1-0.03)的比例加入海藻酸盐，搅拌，静置，离 心，得下层沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH至6-6.5，超滤得截留液1;其中， 超滤的条件为:压力为〇 · 2-0 · 6MPa、温度为4-30°C、截留分子量为5 X 104-7 X 104;
[0017] 3)调节截留液1的pH至6-6.5，将其以8〇-12〇111171^11的速度通过阴离子交换树脂， 然后用pH=6-6.5的磷酸盐缓冲液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗脱液1;
[0018] 4)将洗脱液1在压力为0.1-0.5MPa、温度为4-30°C、截留分子量为3 X104的条件下 超滤，得截留液2;
[0019] 5)将截留液27令冻干燥，即得纯乌司他丁。
[0020] 优选地，步骤1)所述壳聚糖与甲壳素的质量比为(3-8):1，所述壳聚糖的脱乙酰度 大于95%，分子量为8万-15万；
[0021] 优选地，超滤所用的超滤膜为聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纤维素膜、醋酸纤维素膜、 聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一种或至少两种的复合膜；
[0022]进一步优选为聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的复合膜。
[0023]优选地，所述超滤膜的结构为中空纤维式、平板式、管式和卷式中的一种;进一步 优选为内压式中空纤维超滤膜。
[0024] 优选地，步骤2)中所述的海藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钾，分子量为2万-5万。
[0025] 优选地，步骤3)中所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠或磷酸氢二钾缓冲液。
[0026] 优选地，步骤3)中所述的阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂与弱碱性阴离 子交换树脂的混合物；
[0027] 进一步优选地，强碱性阴离子交换树脂为Amberlite IRA400、Amberlite IRA402、 Amberlite IRA900和Amberlite IRA910中的至少一种；
[0028] 弱喊性阴离子交换树脂为Amberlite IRA93、Amberlite IRA94、Amberlite IRA68 和Amberlite IRA63中的至少一种。
[0029] 进一步优选地，强碱性阴离子交换树脂与弱碱性阴离子交换树脂质量比为(3-10) :1〇
[0030] 优选地，步骤4)中截留液2的体积为洗脱液1体积的1/10-1/20。
[0031] 其中，步骤1)中操作"氨水洗脱、硫酸铵盐析、静置、沉淀、干燥"按本领域常规技术 手段进行。
[0032] 超滤过程中每隔2-3小时对滤膜进行反洗。
[0033] 与现有技术相比，本申请所提供的基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法具有 如下优点：
[0034] (1)利用壳聚糖与甲壳素的混合物进行吸附，提高了乌司他丁的收率。
[0035] (2)利用海藻酸盐与酸性糖蛋白（乌司他丁）的静电吸附作用，增大超滤膜的截留 分子量，同时可除去与乌司他丁分子量较接近的杂质分子，提高了超滤的精确度。
[0036] (3)本申请采用强、弱阴离子交换树脂混合的方法，与单独采用一种树脂相比，提 高了产物的纯化效率。
[0037] (4)本申请纯化工艺简单，且乌司他丁的比活力高达到4900IU/mg蛋白（1个IU的定 义为：以BAEE为底物，在25度时，每分钟使△ A253增加0.001所需的乌司他丁的量）；收率高达 87%〇
【具体实施方式】
[0038]下面结合实施例对本发明做进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的， 而不限制本发明的范围和实质。
[0039] 实施例1
[0040] 1)取It澄清尿液，调节pH至6,加入12kg硅胶，搅拌，过滤，得滤液，调节滤液pH至3， 继续向滤液中加入8kg壳聚糖-甲壳素混合物(壳聚糖：甲壳素= 3:1)，搅拌至吸附完全，依 次氨水洗脱、硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
[0041 ] 2)向乌司他丁粗品中加入pH= 5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，继续向溶液 中以乌司他丁粗品:海藻酸钠= 1:0.01的比例加入海藻酸钠(分子量为2万），搅拌，静置，离 心，得下层沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH=6,超滤得截留液1;其中，超滤 的压力为0 · 2MPa、温度为30°C、截留分子量为5 X 104;
[0042] 3)调节截留液1的pH=6,将其以80mL/min的速度通过阴离子交换树脂(Amberlite IRA400:Amberlite IRA63质量比为 10:1)，然后用pH=6的NaH2P〇4-Na2HP〇4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗脱液1，
[0043] 4)将洗脱液1在压力为O.IMPa的条件下，用截留分子量为3X104的超滤膜超滤得 截留液2,其中，截留液2为截留液体积的1/20，
[0044] 5)将截留液2冷冻干燥，所得白色固体粉末即为乌司他丁纯品。
[0045] 其中，本实施例所用超滤膜为聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的复合膜(聚醚砜膜和醋 酸纤维素膜的活化层同向设置），膜结构为内压式中空纤维超滤膜;超滤膜的具体结构参数 及超滤具体工艺采用本领域常规技术手段。
[0046] 实施例2
[0047] 1)取It澄清尿液，调节pH至6.5,加入12kg硅胶，搅拌，过滤，得滤液，调节滤液pH至 5,继续向滤液中加入12kg壳聚糖-甲壳素混合物(壳聚糖：甲壳素= 8:1)，搅拌至吸附完全， 依次氨水洗脱、硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
[0048] 2)向乌司他丁粗品中加入pH= 5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，继续向溶 液中以乌司他丁粗品：海藻酸钠=1:0.03的比例加入海藻酸钠(分子量为5万），搅拌，静置， 离心，得下层沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH = 6.5，超滤得截留液1;其中， 超滤的压力为〇. 2MPa、温度为30°C、截留分子量为5 X 104;
[0049] 3)调节截留液1的pH = 6,将其以120mL/min的速度通过阴离子交换树脂 (Amberlite IRA400:Amberlite IRA402:Amberlite IRA63质量比5:5:1)，然后用pH = 6的 NaH2P〇4_Na2HP〇4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗脱液1，
[0050] 4)将洗脱液1在压力为O.IMPa的条件下，用截留分子量为3X104的超滤膜超滤得 截留液2,其中，截留液2为截留液体积的1/10，
[0051] 5)将截留液2冷冻干燥，所得白色固体粉末即为乌司他丁纯品。
[0052]其中，本实施例所用超滤膜为聚偏氟乙烯膜，具体结构参数及超滤具体工艺同实 施例1。
[0053] 实施例3
[0054] 1)取It澄清尿液，调节pH至6.5,加入12kg硅胶，搅拌，过滤，得滤液，调节滤液pH至 5,继续向滤液中加入12kg壳聚糖-甲壳素混合物(壳聚糖：甲壳素= 5:1)，搅拌至吸附完全， 依次氨水洗脱、硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
[0055] 2)向乌司他丁粗品中加入pH= 5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，继续向溶 液中以乌司他丁粗品：海藻酸钠=1:0.01的比例加入海藻酸钠(分子量为2万），搅拌，静置， 离心，得下层沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH=6,超滤得截留液1;其中，超 滤的压力为〇. 5MPa、温度为25°C、截留分子量为7 X 104;
[0056] 3)调节截留液1的pH=6,将其以120mL/min的速度通过阴离子交换树脂Amberlite IRA400，然后用pH=6的NaH2P〇4_Na2HP〇4缓冲液和lmol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗 脱液1，
[0057] 4)将洗脱液1在压力为O.IMPa的条件下，用截留分子量为3 X104的超滤膜超滤得 截留液2,其中，截留液2为截留液体积的1/10，
[0058] 5)将截留液2冷冻干燥，所得白色固体粉末即为乌司他丁纯品。
[0059] 其中，本实施例所用超滤膜为聚偏氟乙烯膜，具体结构参数及超滤具体工艺同实 施例1。
[0060] 实施例4
[0061] 1)取It澄清尿液，调节pH至6,加入8kg甲壳素，搅拌至吸附完全，依次氨水洗脱、硫 酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
[0062] 2)向乌司他丁粗品中加入pH=5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，得混合液1;
[0063] 调节混合液1的pH = 6,将其以120mL/min的速度通过阴离子交换树脂Amberlite IRA400，然后用pH=6的NaH2P〇4_Na2HP〇4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗 脱液1;
[0064] 3)将洗脱液1浓缩至原体积的1/30,以120mL/min的速度通过阴离子交换树脂 Amber 1 ite IRA63，然后用pH = 6的NaH2P〇4-Na2HP〇4缓冲液和2mo 1/L NaCl的混合溶液进行 洗脱，得洗脱液2;
[0065] 4)将洗脱液2在压力为0 . IMPa的条件下，用截留分子量为3 X 104的超滤膜超滤得 截留液2,其中，截留液2为截留液体积的1/20;
[0066] 5)将截留液2冷冻干燥，所得淡黄色固体粉末即为乌司他丁纯品。
[0067] 实施例5:结果表征：
[0068]对实施例1-4回收得到的乌司他丁纯品的收率、活性、纯度及人尿激肽原酶的含量 进行测定，具体结果如下表1。
[0069]其中，取实施例1-4制得的乌司他丁纯品采用《中国药典》（2010)乌司他丁项目下 的激肽原酶含量方法进行测定。
[0070] 表1实施例1-4分离纯化得到的乌司他丁的收率、活性、纯度及人尿激肽原酶的含 量测定结果
[0071]
[0072] 上述实施例仅作为解释本发明的目的，本发明的范围不受此限制。对本领域的技 术人员来说所做的修改是显而易见的，本发明仅受所附权利要求范围的限制。
【主权项】
1. 一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法，其具体步骤如下： 1) 取澄清尿液，调节pH至6-6.5，加入硅胶，搅拌，过滤，得滤液，调节滤液pH至3-5，继续 向滤液中加入壳聚糖-甲壳素混合物，搅拌至吸附完全，依次用氨水洗脱、硫酸铵盐析，静 置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品； 2) 向乌司他丁粗品中加入pH = 5-5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，向溶液中加 入海藻酸盐，搅拌，静置，离心，得下层沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH至6-6.5,超滤，得截留液1; 3) 调节截留液1的pH至6-6.5,将其上阴离子交换树脂，然后用pH = 6-6.5的磷酸盐缓冲 液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗脱液1; 4) 将洗脱液1超滤，得截留液2; 5) 将截留液2冷冻干燥，即得纯乌司他丁。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，该方法具体步骤如下： 1) 取澄清尿液，调节pH至6-6.5，以每t尿液加入8-12kg硅胶的比例加入硅胶，搅拌，过 滤，得滤液，调节滤液pH至3-5,继续向滤液中以每t尿液加入8-12kg壳聚糖-甲壳素混合物 的比例加入壳聚糖-甲壳素混合物，搅拌至吸附完全，依次用氨水洗脱、硫酸铵盐析，静置、 沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品； 2) 向乌司他丁粗品中加入pH = 5-5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，继续向溶液 中以乌司他丁粗品:海藻酸盐=1:(0.01-0.03)的比例加入海藻酸盐，搅拌，离心，得下层沉 淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH至6-6.5，超滤，得截留液1;超滤条件为:压力 为0.2-0.6MPa、温度为4-30 °C、截留分子量为5 X 104-7 X 104; 3) 调节截留液1的pH至6-6.5，将其以8〇-12〇111171^11的速度通过阴离子交换树脂，然后 用pH=6-6.5的磷酸盐缓冲液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗脱液1; 4) 将洗脱液1在压力为0.1-0.5MPa、温度为4-30°C、截留分子量为3 X 104的条件下超滤， 得截留液2; 5) 将截留液2冷冻干燥，即得纯乌司他丁。3. 根据权利要求1或2所述的方法，超滤所用的超滤膜为聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纤维 素膜、醋酸纤维素膜、聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一种或至少两种的复合膜;所述超滤膜的 结构为中空纤维式、平板式、管式和卷式中的一种。4. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述超滤膜为聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的复合 膜;所述超滤膜的结构为内压式中空纤维超滤膜。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤1)中所述的壳聚糖与甲壳素的质量比为 (3-8): 1，所述壳聚糖的脱乙酰度大于95%，分子量为8-15万；步骤2)中所述的海藻酸盐为 海藻酸钠或海藻酸钾，分子量为2-5万。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤3)中所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠 或磷酸氢二钾缓冲液； 步骤3)中所述的阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂与弱碱性阴离子交换树脂 的混合物。7. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述的强碱性阴离子交换树脂为Amberlite IRA400、Amberlite IRA402、Amberlite IRA900和Amberlite IRA910中的至少一种； 所述的弱喊性阴离子交换树脂为Amberlite IRA93、Amberlite IRA94、Amberlite IRA68和Amberlite IRA63中的至少一种。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述的强碱性阴离子交换树脂与弱碱性阴离 子交换树脂质量比为(3-10): 1。9. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤4)中的截留液2的体积为洗脱液1体积的 1/10-1/20。
【文档编号】C07K1/30GK105837685SQ201610323339
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】王旭, 郑少亮, 田友军, 肖益热
【申请人】广东天普生化医药股份有限公司
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法。该方法先用壳聚糖和甲壳素的混合物吸附分离得到乌司他丁粗品，然后将粗品与海藻酸盐混合后依次进行超滤、阴离子交接树脂纯化、超滤，最后将超滤后得到的截留液冷冻干燥，得到乌司他丁纯品。由本申请提供的基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法，缩短了纯化工艺，乌司他丁的收率和纯度高，其中，乌司他丁的收率达到87％；比活力达到4900IU/mg蛋白。
【专利说明】
一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方 法。
【背景技术】
[0002] 乌司他丁系从男性尿中分离纯化出的一种酸性糖蛋白。据文献报道，其是由143个 氨基酸组成，在第10位丝氨酸和45位天冬氨酸上有糖链，结构表面含有大量非极性疏水基 团，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸等。乌司他丁的分子量经HPLC法测定为60~70KD，经 SDS-PAGE测定为40~50KD，等电点位于2-3之间。
[0003] 由于结构中的两个活性功能区均具有很广的抑酶谱，所以能同时抑制胰蛋白酶、 磷脂酶A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种水解酶的活性;而且，乌司他丁分解形成的低分 子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用。乌司他丁不仅是一种广谱的蛋白酶抑制剂，还 具有抑制心肌抑制因子的产生、改善休克时的循环状态、稳定溶酶体膜、抑制炎症介质的释 放等功能。大量临床试验结果显示，乌司他丁在治疗急性胰腺炎、辅助治疗休克、改善手术 刺激引起的免疫功能下降、尤其是减少体外循环并发症等方面有重要的作用，加上其本身 来源于人体，无免疫原性，安全性高。
[0004] 但由于尿液中乌司他丁的含量较少，其分离及纯化工艺成为制约其应用的关键因 素。
[0005] 关于乌司他丁的分离及纯化方法，国内报道较少。经检索，已公开的中国专利申请 文献仅21篇。由青岛康原药业有限公司公开的中国专利申请CN2015108204251《一种树脂再 生提高柱效纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁复溶性的药物组合物》和 CN2014108077092《一种树脂再生提高柱效乌司他丁的方法及含有乌司他丁的药物组合物》 均利用阴离子交换柱、亲和层析柱及超滤相结合的方法对乌司他丁粗品进行纯化的方法。
【申请人】在之前的专利文献CN2006100002002《纯化的乌司他丁及其制备方法和含有该乌司 他丁的药物组合物》中采用阴离子交换柱、超滤和金属螯合柱、疏水柱和凝胶柱结合对乌司 他丁粗品进行纯化。
[0006] 上述公开的乌司他丁的纯化方法均采用多次树脂柱进行纯化。但对于一定体积的 尿液，纯化工艺越复杂，在一定程度上可以提高乌司他丁的纯度，而乌司他丁的收率却受到 影响。如何协调乌司他丁的纯化工艺与其收率及纯度的关系，成为科研人员亟待解决的问 题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供一种基于阴离子交换树脂 纯化乌司他丁的方法，以在保证乌司他丁的纯度和收率的同时，减化其纯化工艺，达到节约 成本、减少时间和人力成本的目的。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明提供了一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的 方法，其具体步骤如下：
[0009] 1)取澄清尿液，调节pH至6-6.5，加入硅胶，搅拌，过滤，得滤液，调节滤液pH至3-5， 继续向滤液中加入壳聚糖-甲壳素混合物，搅拌至吸附完全，依次用氨水洗脱、硫酸铵盐析， 静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
[0010] 2)向乌司他丁粗品中加入pH=5-5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，向溶液 中加入海藻酸盐，搅拌，静置，离心，得下层沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH 至6-6.5,超滤，得截留液1;
[0011] 3)调节截留液1的pH=6-6.5,将其上阴离子交换树脂，然后用pH=6-6.5的磷酸盐 缓冲液和〇. 8-2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗脱液1;
[0012] 4)将洗脱液1超滤，得截留液2;
[0013] 5)将截留液27令冻干燥，即得纯乌司他丁。
[0014]优选地，本发明提供的基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法，其具体步骤如 下：
[0015] 1)取澄清尿液，调节pH至6-6.5，以每t尿液加入8-12kg硅胶的比例加入硅胶，搅 拌，过滤，得滤液，调节滤液pH至3-5,继续向滤液中以每t尿液加入8-12kg壳聚糖-甲壳素混 合物的比例加入壳聚糖-甲壳素混合物，搅拌至吸附完全，依次用氨水洗脱、硫酸铵盐析，静 置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
[0016] 2)向乌司他丁粗品中加入pH=5-5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，继续向 溶液中以乌司他丁粗品：海藻酸盐=1: (〇. 〇 1-0.03)的比例加入海藻酸盐，搅拌，静置，离 心，得下层沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH至6-6.5，超滤得截留液1;其中， 超滤的条件为:压力为〇 · 2-0 · 6MPa、温度为4-30°C、截留分子量为5 X 104-7 X 104;
[0017] 3)调节截留液1的pH至6-6.5，将其以8〇-12〇111171^11的速度通过阴离子交换树脂， 然后用pH=6-6.5的磷酸盐缓冲液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗脱液1;
[0018] 4)将洗脱液1在压力为0.1-0.5MPa、温度为4-30°C、截留分子量为3 X104的条件下 超滤，得截留液2;
[0019] 5)将截留液27令冻干燥，即得纯乌司他丁。
[0020] 优选地，步骤1)所述壳聚糖与甲壳素的质量比为(3-8):1，所述壳聚糖的脱乙酰度 大于95%，分子量为8万-15万；
[0021] 优选地，超滤所用的超滤膜为聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纤维素膜、醋酸纤维素膜、 聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一种或至少两种的复合膜；
[0022]进一步优选为聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的复合膜。
[0023]优选地，所述超滤膜的结构为中空纤维式、平板式、管式和卷式中的一种;进一步 优选为内压式中空纤维超滤膜。
[0024] 优选地，步骤2)中所述的海藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钾，分子量为2万-5万。
[0025] 优选地，步骤3)中所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠或磷酸氢二钾缓冲液。
[0026] 优选地，步骤3)中所述的阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂与弱碱性阴离 子交换树脂的混合物；
[0027] 进一步优选地，强碱性阴离子交换树脂为Amberlite IRA400、Amberlite IRA402、 Amberlite IRA900和Amberlite IRA910中的至少一种；
[0028] 弱喊性阴离子交换树脂为Amberlite IRA93、Amberlite IRA94、Amberlite IRA68 和Amberlite IRA63中的至少一种。
[0029] 进一步优选地，强碱性阴离子交换树脂与弱碱性阴离子交换树脂质量比为(3-10) :1〇
[0030] 优选地，步骤4)中截留液2的体积为洗脱液1体积的1/10-1/20。
[0031] 其中，步骤1)中操作"氨水洗脱、硫酸铵盐析、静置、沉淀、干燥"按本领域常规技术 手段进行。
[0032] 超滤过程中每隔2-3小时对滤膜进行反洗。
[0033] 与现有技术相比，本申请所提供的基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法具有 如下优点：
[0034] (1)利用壳聚糖与甲壳素的混合物进行吸附，提高了乌司他丁的收率。
[0035] (2)利用海藻酸盐与酸性糖蛋白（乌司他丁）的静电吸附作用，增大超滤膜的截留 分子量，同时可除去与乌司他丁分子量较接近的杂质分子，提高了超滤的精确度。
[0036] (3)本申请采用强、弱阴离子交换树脂混合的方法，与单独采用一种树脂相比，提 高了产物的纯化效率。
[0037] (4)本申请纯化工艺简单，且乌司他丁的比活力高达到4900IU/mg蛋白（1个IU的定 义为：以BAEE为底物，在25度时，每分钟使△ A253增加0.001所需的乌司他丁的量）；收率高达 87%〇
【具体实施方式】
[0038]下面结合实施例对本发明做进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的， 而不限制本发明的范围和实质。
[0039] 实施例1
[0040] 1)取It澄清尿液，调节pH至6,加入12kg硅胶，搅拌，过滤，得滤液，调节滤液pH至3， 继续向滤液中加入8kg壳聚糖-甲壳素混合物(壳聚糖：甲壳素= 3:1)，搅拌至吸附完全，依 次氨水洗脱、硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
[0041 ] 2)向乌司他丁粗品中加入pH= 5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，继续向溶液 中以乌司他丁粗品:海藻酸钠= 1:0.01的比例加入海藻酸钠(分子量为2万），搅拌，静置，离 心，得下层沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH=6,超滤得截留液1;其中，超滤 的压力为0 · 2MPa、温度为30°C、截留分子量为5 X 104;
[0042] 3)调节截留液1的pH=6,将其以80mL/min的速度通过阴离子交换树脂(Amberlite IRA400:Amberlite IRA63质量比为 10:1)，然后用pH=6的NaH2P〇4-Na2HP〇4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗脱液1，
[0043] 4)将洗脱液1在压力为O.IMPa的条件下，用截留分子量为3X104的超滤膜超滤得 截留液2,其中，截留液2为截留液体积的1/20，
[0044] 5)将截留液2冷冻干燥，所得白色固体粉末即为乌司他丁纯品。
[0045] 其中，本实施例所用超滤膜为聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的复合膜(聚醚砜膜和醋 酸纤维素膜的活化层同向设置），膜结构为内压式中空纤维超滤膜;超滤膜的具体结构参数 及超滤具体工艺采用本领域常规技术手段。
[0046] 实施例2
[0047] 1)取It澄清尿液，调节pH至6.5,加入12kg硅胶，搅拌，过滤，得滤液，调节滤液pH至 5,继续向滤液中加入12kg壳聚糖-甲壳素混合物(壳聚糖：甲壳素= 8:1)，搅拌至吸附完全， 依次氨水洗脱、硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
[0048] 2)向乌司他丁粗品中加入pH= 5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，继续向溶 液中以乌司他丁粗品：海藻酸钠=1:0.03的比例加入海藻酸钠(分子量为5万），搅拌，静置， 离心，得下层沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH = 6.5，超滤得截留液1;其中， 超滤的压力为〇. 2MPa、温度为30°C、截留分子量为5 X 104;
[0049] 3)调节截留液1的pH = 6,将其以120mL/min的速度通过阴离子交换树脂 (Amberlite IRA400:Amberlite IRA402:Amberlite IRA63质量比5:5:1)，然后用pH = 6的 NaH2P〇4_Na2HP〇4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗脱液1，
[0050] 4)将洗脱液1在压力为O.IMPa的条件下，用截留分子量为3X104的超滤膜超滤得 截留液2,其中，截留液2为截留液体积的1/10，
[0051] 5)将截留液2冷冻干燥，所得白色固体粉末即为乌司他丁纯品。
[0052]其中，本实施例所用超滤膜为聚偏氟乙烯膜，具体结构参数及超滤具体工艺同实 施例1。
[0053] 实施例3
[0054] 1)取It澄清尿液，调节pH至6.5,加入12kg硅胶，搅拌，过滤，得滤液，调节滤液pH至 5,继续向滤液中加入12kg壳聚糖-甲壳素混合物(壳聚糖：甲壳素= 5:1)，搅拌至吸附完全， 依次氨水洗脱、硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
[0055] 2)向乌司他丁粗品中加入pH= 5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，继续向溶 液中以乌司他丁粗品：海藻酸钠=1:0.01的比例加入海藻酸钠(分子量为2万），搅拌，静置， 离心，得下层沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH=6,超滤得截留液1;其中，超 滤的压力为〇. 5MPa、温度为25°C、截留分子量为7 X 104;
[0056] 3)调节截留液1的pH=6,将其以120mL/min的速度通过阴离子交换树脂Amberlite IRA400，然后用pH=6的NaH2P〇4_Na2HP〇4缓冲液和lmol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗 脱液1，
[0057] 4)将洗脱液1在压力为O.IMPa的条件下，用截留分子量为3 X104的超滤膜超滤得 截留液2,其中，截留液2为截留液体积的1/10，
[0058] 5)将截留液2冷冻干燥，所得白色固体粉末即为乌司他丁纯品。
[0059] 其中，本实施例所用超滤膜为聚偏氟乙烯膜，具体结构参数及超滤具体工艺同实 施例1。
[0060] 实施例4
[0061] 1)取It澄清尿液，调节pH至6,加入8kg甲壳素，搅拌至吸附完全，依次氨水洗脱、硫 酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
[0062] 2)向乌司他丁粗品中加入pH=5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，得混合液1;
[0063] 调节混合液1的pH = 6,将其以120mL/min的速度通过阴离子交换树脂Amberlite IRA400，然后用pH=6的NaH2P〇4_Na2HP〇4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗 脱液1;
[0064] 3)将洗脱液1浓缩至原体积的1/30,以120mL/min的速度通过阴离子交换树脂 Amber 1 ite IRA63，然后用pH = 6的NaH2P〇4-Na2HP〇4缓冲液和2mo 1/L NaCl的混合溶液进行 洗脱，得洗脱液2;
[0065] 4)将洗脱液2在压力为0 . IMPa的条件下，用截留分子量为3 X 104的超滤膜超滤得 截留液2,其中，截留液2为截留液体积的1/20;
[0066] 5)将截留液2冷冻干燥，所得淡黄色固体粉末即为乌司他丁纯品。
[0067] 实施例5:结果表征：
[0068]对实施例1-4回收得到的乌司他丁纯品的收率、活性、纯度及人尿激肽原酶的含量 进行测定，具体结果如下表1。
[0069]其中，取实施例1-4制得的乌司他丁纯品采用《中国药典》（2010)乌司他丁项目下 的激肽原酶含量方法进行测定。
[0070] 表1实施例1-4分离纯化得到的乌司他丁的收率、活性、纯度及人尿激肽原酶的含 量测定结果
[0071]
[0072] 上述实施例仅作为解释本发明的目的，本发明的范围不受此限制。对本领域的技 术人员来说所做的修改是显而易见的，本发明仅受所附权利要求范围的限制。
【主权项】
1. 一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法，其具体步骤如下： 1) 取澄清尿液，调节pH至6-6.5，加入硅胶，搅拌，过滤，得滤液，调节滤液pH至3-5，继续 向滤液中加入壳聚糖-甲壳素混合物，搅拌至吸附完全，依次用氨水洗脱、硫酸铵盐析，静 置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品； 2) 向乌司他丁粗品中加入pH = 5-5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，向溶液中加 入海藻酸盐，搅拌，静置，离心，得下层沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH至6-6.5,超滤，得截留液1; 3) 调节截留液1的pH至6-6.5,将其上阴离子交换树脂，然后用pH = 6-6.5的磷酸盐缓冲 液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗脱液1; 4) 将洗脱液1超滤，得截留液2; 5) 将截留液2冷冻干燥，即得纯乌司他丁。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，该方法具体步骤如下： 1) 取澄清尿液，调节pH至6-6.5，以每t尿液加入8-12kg硅胶的比例加入硅胶，搅拌，过 滤，得滤液，调节滤液pH至3-5,继续向滤液中以每t尿液加入8-12kg壳聚糖-甲壳素混合物 的比例加入壳聚糖-甲壳素混合物，搅拌至吸附完全，依次用氨水洗脱、硫酸铵盐析，静置、 沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品； 2) 向乌司他丁粗品中加入pH = 5-5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解，继续向溶液 中以乌司他丁粗品:海藻酸盐=1:(0.01-0.03)的比例加入海藻酸盐，搅拌，离心，得下层沉 淀物1，向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH至6-6.5，超滤，得截留液1;超滤条件为:压力 为0.2-0.6MPa、温度为4-30 °C、截留分子量为5 X 104-7 X 104; 3) 调节截留液1的pH至6-6.5，将其以8〇-12〇111171^11的速度通过阴离子交换树脂，然后 用pH=6-6.5的磷酸盐缓冲液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱，得洗脱液1; 4) 将洗脱液1在压力为0.1-0.5MPa、温度为4-30°C、截留分子量为3 X 104的条件下超滤， 得截留液2; 5) 将截留液2冷冻干燥，即得纯乌司他丁。3. 根据权利要求1或2所述的方法，超滤所用的超滤膜为聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纤维 素膜、醋酸纤维素膜、聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一种或至少两种的复合膜;所述超滤膜的 结构为中空纤维式、平板式、管式和卷式中的一种。4. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述超滤膜为聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的复合 膜;所述超滤膜的结构为内压式中空纤维超滤膜。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤1)中所述的壳聚糖与甲壳素的质量比为 (3-8): 1，所述壳聚糖的脱乙酰度大于95%，分子量为8-15万；步骤2)中所述的海藻酸盐为 海藻酸钠或海藻酸钾，分子量为2-5万。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤3)中所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠 或磷酸氢二钾缓冲液； 步骤3)中所述的阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂与弱碱性阴离子交换树脂 的混合物。7. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述的强碱性阴离子交换树脂为Amberlite IRA400、Amberlite IRA402、Amberlite IRA900和Amberlite IRA910中的至少一种； 所述的弱喊性阴离子交换树脂为Amberlite IRA93、Amberlite IRA94、Amberlite IRA68和Amberlite IRA63中的至少一种。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述的强碱性阴离子交换树脂与弱碱性阴离 子交换树脂质量比为(3-10): 1。9. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤4)中的截留液2的体积为洗脱液1体积的 1/10-1/20。
【文档编号】C07K1/30GK105837685SQ201610323339
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】王旭, 郑少亮, 田友军, 肖益热
【申请人】广东天普生化医药股份有限公司
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0访客 来自[中国] 2023年10月18日 15:36怎么与天普合作，并且技术和设备怎么安装和学习
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