一种从发酵液中高效提取γ-聚谷氨酸的工艺的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种从发酵液中高效提取γ?聚谷氨酸的工艺，利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)选择性沉淀发酵液中的γ?PGA，然后将沉淀物在一定浓度的NaCl溶液中解离溶解、醇析、固液分离以及干燥等操作得到纯度较高的γ?PGA。相对于现有技术，该工艺不仅可以提高了γ?PGA提取效率和产品纯度，还可大量减少用于醇析的有机溶剂，使生产成本大大降低，具有良好的应用前景。
【专利说明】
-种从发酵液中高效提取丫-聚谷氨酸的工艺
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其设及一种从发酵液中高效提取T-聚谷氨酸的工 乙。
【背景技术】
[0002] 丫-聚谷氨酸(pol厂丫 -glutamic acid,简称丫 -PGA)是由心谷氨酸和D-谷氨酸经 过Y -酷胺键结合形成的一种多肤分子，是一种水溶性高分子氨基酸聚合物。由于丫 -PGA具 有生物可降解性、良好生物相容性、保水性、对人体无毒害及对环境无污染等独特的物理、 化学和生物学性质，使得丫-PGA广泛应用于农业、食品、医药、化妆品工艺W及环保等多个 领域。
[0003] 目前，从高粘度发酵液中提取分离丫-PGA的方法主要有S种:有机溶剂沉淀法(一 般使用醇析法）、化学沉淀法和膜分离沉淀法。有机溶剂沉淀是指利用离屯、或凝聚菌体的方 法除去发酵液中的菌体，在上清液中加入低级醇类（如甲醇、乙醇、异丙醇等）可沉淀得到 丫-PGA，经冷冻干燥得到淡黄色色胶状物。化学沉淀是用饱和CuS〇4、化Cl溶液代替低级醇 类盐析沉淀丫 -PGA。对高粘度的发酵液还可采取膜分离沉淀法。首次醇析或盐析制得的丫 -PGA粗品颜色一般为黄色，需将其溶解于蒸馈水中后，再次进行精滤、脱色、除盐等处理，经 低压冻干后，才可得白色丫-PGA精制品。由于化学沉淀法和膜分离沉淀法的提取工艺繁复、 提取成本高而且纯度低，因此目前最常用的方法是有机溶剂沉淀法。有机溶剂沉淀法(醇析 法）同样存在很多问题。因为丫-PGA发酵液很粘稠，进行预处理去除杂质需要适当稀释才能 顺利操作。当发酵液中丫-PGA浓度较低时，不仅醇析效果不好，丫-PGA回收率很低，而且消 耗大量有机溶剂。大量有机溶剂的使用不仅增加生产成本，而且带来较大安全隐患。为了减 少溶剂消耗，发酵液预处理后一般进行超滤浓缩，但超滤过程丫 -PGA损失很大，且超滤膜容 易被污染，处理效率变低。分离纯化困难W及提取回收率低下是丫-PGA生产成本居高不下 的重要原因。
[0004] 有鉴于此，在丫 -PGA的工业生产上亟需一套经济可行的分离纯化工艺。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于：针对现有技术的不足，而提供一种从发酵液中高效提取丫-PGA的新工艺，W提高丫-PGA的产量、纯度W及降低生产成本。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0007] -种从发酵液中高效提取丫-聚谷氨酸的工艺，包括W下步骤：
[000引步骤(1):将微生物发酵得到的丫-PGA发酵液通过孔径为1~50WI1滤袋W及孔径为 0.25~Iwii的微孔过滤器过滤，或于高速离屯、机中离屯、分离，除去发酵液中大量的不溶性发 酵残余营养物和菌体；
[0009]步骤(2):在步骤（1)离屯、后的发酵液中加入S氯乙酸调节抑值为3~5,去除发酵 液中的杂蛋白；
[0010] 步骤(3):在步骤(2)发酵液中加入I~30g/L娃藻±吸附发酵液中的残余菌体，过 滤或离屯、分离出不溶物，再加入0.5~20g/L活性炭吸附发酵液中的色素和其它杂质，经过 滤或离屯、分离获取上清液；
[0011] 步骤(4):在步骤(3)处理后的发酵液中取样，即在步骤(3)中的上清液取样，测量 及估算发酵液中丫-PGA的含量；
[0012]步骤(5):根据步骤(4)测算的发酵液中丫-PGA的含量，加入丫-PGA的含量的1~5 倍的CTAB，用化0田容液调节抑值为7~13，混合揽拌1~12h，使得CTAB与发酵液中丫 -PGA充 分反应，然后离屯、分离得到不溶性CTAB/ 丫 -PGA复合物；
[OOU]步骤(6):将步骤(5)收集得到的CTAB/ 丫 -PGA复合物置于NaCl溶液中，调节抑值为 6~9，解离1~12h，得到含有丫 -PGA的澄清溶液；
[0014] 步骤（7):于步骤（6) 丫-PGA澄清溶液中加入丫-PGA澄清溶液体积的2~5倍的乙 醇，在溫度为4~10°C的条件下冷却静置12~2地，离屯、得沉淀物，然后将沉淀物冷冻干燥得 到高纯度的丫 -PGA白色结晶。
[0015] 需要说明的是，在碱性条件下，CTAB与丫-PGA形成了不能解离的离子化合物沉淀 下来，而在pH 6~8的中性条件及高离子强度(离子强度>150mmol/L)的溶液中，运种离子 化合物又会重新解离溶解，也就是说，CTAB具有从低离子强度溶液中选择性沉淀丫 -PGA的 特点。
[0016] 作为所述的从发酵液中高效提取丫-聚谷氨酸工艺的一种改进，所述步骤(1)中的 T -PGA发酵液为通过微生物液体发酵获得的T -PGA发酵液。
[0017] 作为所述的从发酵液中高效提取丫-聚谷氨酸工艺的一种改进，所述步骤(1)中的 T -PGA发酵液为在微生物固体发酵得到的含T -PGA的固体基质中加入固体基质体积的8~ 12倍的蒸馈水进行揽拌浸提0.5~化后，通过100目筛网过滤去渣获得的丫 -PGA浸提液。
[0018] 作为所述的从发酵液中高效提取丫 -聚谷氨酸的工艺的一种改进，所述步骤（1)中 的离屯、分离，转速为5000~1500化pm,离屯、时间为5~30min。
[0019] 作为所述的从发酵液中高效提取丫 -聚谷氨酸的工艺的一种改进，所述步骤(3)中 的过滤是通过孔径为1-50WI1的滤袋W及孔径为0.25-1M1的微孔过滤器过滤。。
[0020] 作为所述的从发酵液中高效提取丫 -聚谷氨酸的工艺的一种改进，所述步骤(3)中 的离屯、分离，转速为5000~1500化pm,离屯、时间为5~30min。
[0021] 作为所述的从发酵液中高效提取丫 -聚谷氨酸的工艺的一种改进，所述步骤(6)中 的NaCl溶液的浓度为0.1~1. Omol/L。
[0022] 作为所述的从发酵液中高效提取丫 -聚谷氨酸的工艺的一种改进，所述步骤(7)中 的乙醇的浓度大于95%。
[0023] 作为所述的从发酵液中高效提取丫 -聚谷氨酸的工艺的一种改进，所述步骤(7)中 的冷冻干燥是指在压强为10化~30化的高真空度下升华干燥至环境溫度，1~化后，在压强 为15化~30化、溫度低于40 °C下，干燥4~1 Oh。
[0024] 作为所述的从发酵液中高效提取丫 -聚谷氨酸的工艺的一种改进，所述步骤(7)中 的丫 -PGA白色结晶为Na-型丫 -PGA和H-型丫 -PGA的混合物。
[0025] 本发明的有益效果在于:本发明利用CTAB与发酵液中的丫-PGA在适当条件下发生 化学反应，形成不溶性离子化合物，然后通过固液分离收集沉淀，将沉淀溶于一定浓度的 化Cl溶液中，再加入3~5倍的有机溶剂(低级醇)于该溶液中，经过解离溶解、醇析、固液分 离W及干燥等操作得到纯度较高的丫-PGA。相对于现有技术，该工艺由于利用CTAB选择性 沉淀丫 -PGA较完全的特点，达到了高效浓缩丫 -PGA并去除杂质的目的，不仅提高了丫 -PGA 提取效率和产品纯度，还大量减少了用于醇析的有机溶剂，使生产成本大大降低，具有良好 的应用前景。
【具体实施方式】
[0026] 下面将结合【具体实施方式】对本发明及其有益效果作进一步详细说明，但是，本发 明的【具体实施方式】并不局限于此。
[0027] 实施例1
[00%] -种从发酵液中高效提取丫-聚谷氨酸的工艺，包括W下步骤：
[0029] 步骤（1):将10化微生物发酵得到的丫-PGA发酵液于转速为SOOOrpm离屯、分离机中 离屯、30min，分离除去发酵液中大量的不溶性发酵残余营养物和菌体；
[0030] 步骤(2):在步骤(1)离屯、后的发酵液中加入S氯乙酸调节抑为3,去除发酵液中的 杂蛋白，同时降低发酵液的黏度，便于后续的纯化处理；
[0031] 步骤(3):在每升步骤(2)发酵液中加入20g/L娃藻±吸附发酵液中的残余菌体，过 滤或离屯、分离去不溶物，再加入5g/L活性炭吸附发酵液中的色素和其他杂质，在转速为 500化pm的离屯、机中离屯、30min，分离获取上清液；
[0032] 步骤(4):在步骤(3)处理后的发酵液中取样，测定发酵液中丫-PGA的含量；
[0033] 步骤(5):根据步骤(4)测算的发酵液中丫 -PGA的含量，加入丫 -PGA的含量的2倍的 CTAB，加入化OH调节抑为10，混合揽拌4h使得CTAB与发酵液中丫 -PGA充分反应，然后在转速 为5000巧m的离屯、机中离屯、30min，分离得到不溶性CTAB/ 丫 -PGA复合物；
[0034] 步骤(6):将步骤(5川欠集得到的CTAB/丫-PGA复合物置于浓度为0.6mol/L的化Cl 溶液中，调节pH值为7，解离化，得到含有T -PGA的澄清溶液；
[0035] 步骤(7):于步骤(6) 丫 -PGA澄清溶液中加入丫 -PGA澄清溶液体积的4倍的无水乙 醇，在溫度为4°C的条件下冷却静置12h，在转速为SOOOrpm的离屯、机中离屯、30min，分离得沉 淀物，然后将沉淀物冷冻干燥，得到丫 -PGA白色结晶。
[0036] 实施例2
[0037] -种从发酵液中高效提取丫-聚谷氨酸的工艺，包括W下步骤：
[0038] 步骤（1):将微生物固体发酵得到的含T-PGA的固体基质IOkg加10倍体积的蒸馈 水于40°C揽拌浸提化，浸提液先通过100目筛网过滤去渣，滤液再分别通过扣m孔径滤袋过 滤和0.5WI1微孔过滤器过滤，收集浸提液。
[0039] 步骤(2):在步骤(1)浸提液中加入S氯乙酸调节pH值为4;
[0040] 步骤(3):在步骤(2)浸提液中加入lOg/L娃藻±和8邑凡活性炭吸附发酵液中的色 素和其他杂质，在转速为1000化pm的离屯、机中离屯、25min，分离获取上清液；
[0041] 步骤(4):在步骤(3)处理后的浸提液中取样，测定浸提液中丫-PGA的含量；
[0042] 步骤(5):根据步骤(4)测算的浸提液中丫 -PGA的含量，加入丫 -PGA的含量的4倍的 CTAB，加入化OH调节抑值为11，混合揽拌化使得CTAB与浸提液中丫 -PGA充分反应，然后在转 速为1000化pm的离屯、机中离屯、25min，分离得到不溶性CTAB/ 丫 -PGA复合物；
[0043] 步骤(6):将步骤(5川欠集得到的CTAB/丫-PGA复合物置于浓度为0.5mol/L的化Cl 溶液中，调节pH值为6.0，解离化，得到含有T -PGA的澄清溶液；
[0044] 步骤(7):于步骤(6) 丫 -PGA澄清溶液中加入丫 -PGA澄清溶液体积的3倍的无水乙 醇，在溫度为4°C的条件下冷却静置15h，在转速为100(K)rpm的离屯、机中离屯、25min，分离得 沉淀物，然后将沉淀物冷冻干燥，得到丫 -PGA白色结晶。
[0045] 对比例1~2
[0046] 与实施例1~2不同的是:对比例1~2采用乙醇法对预处理后的发酵液中的丫-PGA 进行提取。
[0047] 实验结果
[004引对实施例1~2和对比例1~2中提取产物复溶后的浊度、蛋白质含量及丫 -PGA含量 进行测定，测定结果如表1所示。
[0049] 表1 CTAB法与乙醇法对发酵液中丫-PGA的提取效果 [(K)加 ]
[0051] 经娃藻±、活性炭预处理后的发酵液中的杂菌、色素及杂蛋白已经得到较好的去 除，能够大量减少CTAB和丫 -PGA沉淀过程中裹夹的杂质。由表1可见，乙醇法和CTAB法提取 产物溶解后，乙醇法对发酵液中丫 -PGA的回收水平仅有54 %左右，色素(浊度0D660)及蛋白 质含量较高。而CTAB法的回收水平则高于80%，色素及蛋白质含量较乙醇法显著降低。因 此，CTAB法在对发酵液中丫 -PGA的提取效果上，回收率和纯度都远优于乙醇法。
[0052] 根据上述说明书的掲示和启发，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方 式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上述的【具体实施方式】，凡是本领域技术人员在 本发明的基础上所作出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。此 夕h尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但运些术语只是为了方便说明。
【主权项】
1. 一种从发酵液中高效提取γ-聚谷氨酸的工艺，其特征在于，包括以下步骤： 步骤（1):将微生物发酵得到的γ -PGA发酵液通过孔径为1~50μπι滤袋以及孔径为0.25 ~Ιμπι的微孔过滤器过滤，或于高速离心机中离心分离，除去发酵液中大量的不溶性发酵残 余营养物和菌体； 步骤(2):在步骤（1)离心后的发酵液中加入三氯乙酸调节pH值为3~5,去除发酵液中 的杂蛋白； 步骤(3):在步骤(2)发酵液中加入1~30g/L硅藻土吸附发酵液中的残余菌体，过滤或 离心分离出不溶物，再加入0.5~20g/L活性炭吸附发酵液中的色素和其它杂质，经过滤或 离心分离获取上清液； 步骤(4):在步骤(3)处理后的发酵液中取样，即在步骤(3)中的上清液取样，测量及估 算发酵液中γ-PGA的含量； 步骤(5):根据步骤⑷测算的发酵液中γ-PGA的含量，加入γ-PGA的含量的1~5倍的 CTAB，用NaOH溶液调节pH值为7~13，混合搅拌1~12h，使得CTAB与发酵液中γ -PGA充分反 应，然后离心分离得到不溶性CTAB/ γ -PGA复合物； 步骤(6):将步骤(5)收集得到的CTAB/ γ -PGA复合物置于NaCl溶液中，调节pH值为6~ 9,解离1~12h，得到含有γ -PGA的澄清溶液； 步骤(7):于步骤(6) γ -PGA澄清溶液中加入γ -PGA澄清溶液体积的2~5倍的乙醇，在 温度为4~10°C的条件下冷却静置12~24h，离心得沉淀物，然后将沉淀物冷冻干燥得到高 纯度的γ -PGA白色结晶。2. 根据权利要求1所述的从发酵液中高效提取γ-聚谷氨酸的工艺，其特征在于，所述 步骤(1)中的γ -PGA发酵液为通过微生物液体发酵获得的γ -PGA发酵液。3. 根据权利要求1所述的从发酵液中高效提取γ-聚谷氨酸的工艺，其特征在于，所述 步骤(1)中的γ -PGA发酵液为在微生物固体发酵得到的含γ -PGA的固体基质中加入固体基 质体积的8~12倍的蒸馏水进行搅拌浸提0.5~2h后，通过100目筛网过滤去渣获得的γ-PGA浸提液。4. 根据权利要求1所述的从发酵液中高效提取γ-聚谷氨酸的工艺，其特征在于，所述 步骤(1)中的离心分离，转速为5000~15000rpm，离心时间为5~30min。5. 根据权利要求1所述的从发酵液中高效提取γ-聚谷氨酸的工艺，其特征在于，所述 步骤(3)中的过滤是通过孔径为1_50μπι的滤袋以及孔径为0.25-1μπι的微孔过滤器过滤。6. 根据权利要求1所述的从发酵液中高效提取γ-聚谷氨酸的工艺，其特征在于，所述 步骤(3)中的离心分离，转速为5000~15000rpm，离心时间为5~30min。7. 根据权利要求1所述的从发酵液中高效提取γ-聚谷氨酸的工艺，其特征在于，所述 步骤(6)中的NaCl溶液的浓度为0.1~1 .Omol/L。8. 根据权利要求1所述的从发酵液中高效提取的工艺，其特征在于:所述步骤(7)中的 乙醇的浓度大于95%。9. 根据权利要求1所述的从发酵液中高效提取的工艺，其特征在于:所述步骤(7)中的 冷冻干燥为在压强为l〇Pa~30Pa的高真空度下升华干燥至环境温度，1~5h后，在压强为 15Pa~30Pa、温度低于40°C下，干燥4~10h。10. 根据权利要求1所述的从发酵液中高效提取γ-聚谷氨酸的工艺，其特征在于，所述
【文档编号】C08G69/10GK105837815SQ201610329177
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】邹水洋, 张树友, 贾梦影, 李燕琴
【申请人】东莞理工学院