一种产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌及其应用，属于遗传工程和发酵工程领域。本发明用来源于米根霉的苹果酸脱氢酶基因RoMDH替换PDC1，野生型酿酒酵母发酵的乙醇产量达到最大值13.55±1.062g/L，改造菌株MP乙醇产量分别为11.09±0.539g/L，较野生型下降了18.15％。在此基础上，敲除SDH2基因。经培养基优化后，MPΔS缺失株可积累琥珀酸0.698±0.0285g/L，相比之下，野生型酿酒酵母不积累琥珀酸。本发明可以有效减少碳流的损失，为构建工程酵母高效生产琥珀酸创造了条件，具有很好的工业应用价值和前景。
【专利说明】
一种产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌及其应用，属于遗传工程和发酵 工程领域。
【背景技术】
[0002] 琥?白酸（succinic acid)是一种四碳二元酸，学名为丁二酸(butanedioic acid)。 琥珀酸具有30多种重要衍生物化学制品：四氢呋喃、1，4-丁二醇、γ-丁内酯、马来酸和反丁 烯二酸等，具有巨大的市场空间。在食品行业的主要酸味剂、调味剂等，在医药行业可用于 合成镇静剂、pH调节剂、避孕药、抗癌药物等，在化学行业的主要用作离子螯合剂、表面活性 剂、清洁剂添加剂、起泡剂和润滑剂等。值得一提的是，琥珀酸作为生物可降解塑料聚丁二 酸丁二醇酯（可完全降解）的主要原料，具有广泛的应用前景。鉴于上述琥珀酸的重要应用 价值及诸多优势，美国能源部于2004年专门成立了 1，4_二羧酸组，研究琥珀酸、苹果酸和延 胡索酸的生产工艺和应用。
[0003] 目前琥珀酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。与化学合成法相比， 微生物发酵法具有很多优势：原料来源广，成本低，可再生;反应条件温和，能耗小，环境友 好。因此，微生物发酵法生产琥珀酸备受人们的关注，近年来，微生物法生产琥珀酸的研究 进展迅速。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为一种真核模式微生物，因具有:遗传 信息丰富，代谢改造操作方便;营养需求简单，分离提取工艺成本低廉;在低pH条件下(甚至 口!1〈3.0)生长良好；能够耐受高浓度的底物；被？04认证为61^3(66116^11^8 &^6(1八8 Safe)微生物，发酵产品具有安全性等优点而成为发酵生产羧酸(乳酸、丙酮酸、苹果酸、延 胡索酸、琥珀酸、酮戊二酸等)的潜在最适微生物。然而，利用酿酒酵母发酵生产琥珀酸面 临以下问题：（1)在高浓度糖及通风的条件分批发酵产生大量的乙醇，对于以羧酸为目标产 物来说，乙醇的大量积累使得碳流大量的损失；（2)琥珀酸是TCA循环中的中间代谢产物，酿 酒酵母本身不具有过量积累琥珀酸的代谢途径，需要构建琥珀酸的合成途径，但琥珀酸有 比较高的还原势，若通过TCA还原途径积累琥珀酸，需要两个还原氢，比较难积累；（3)实现 减少乙醇产生，丙酮酸得到积累后，如何使得丙酮酸进一步转化为目标产物琥珀酸，需要增 强丙酮酸羧化反应，使之转化为草酰乙酸，进入TCA循环，进而转化为琥珀酸，这一策略琥珀 酸广量提尚的关键。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌，为 代谢工程改造酿酒酵母高效生产琥珀酸打下基础。
[0005] 所述工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，用苹果酸脱氢酶基因替换了乙醇代谢途径 中的丙酮酸脱羧酶基因 PDC1，在此基础上，敲除了琥珀酸代谢途径中的琥珀酸脱氢酶基因 SDH2。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，所述苹果酸脱氢酶基因来源于米根霉。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述琥珀酸脱氢酶基因 SDH2的核苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1C，购自 EUROSCARF(http://web·uni-frankfurt·de/fbl5/mikro/euroscarf/data/cen·html);其 基因型为：MATa;ura3-52; trpl-289; leu2-3，112;his3 Δ 1 ;MAL2-8C; SUC2〇
[0009] 本发明要解决的第二个技术问题是提供构建所述酿酒酵母基因工程菌的的方法， 将序列如SEQ ID _.5所示的？0(：1替换敲除盒，以及50!12敲除盒，分别转化酿酒酵母 CEN. PK2-1C，构建得到产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌。
[0010] 所述SDH2敲除盒是以质粒pUG27为模板，以SEQIDN0.3、SEQIDN0.4所示引物进 行PCR扩增得到的。
[0011] 所述pUG27质粒的构建方法参见"Guldener U,Heck S,Fielder T，et al .A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.Nucleic AcidsRes，1996,24(13):2519-2524^lP"GuoqiangXu，QiangHua，etal.Regulation ofthiamine synthesis in Saccharomyces cerevisiae for improved pyruvate production. Yeast，2012，29:209-217"。
[0012] 本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种应用所述酿酒酵母基因工程菌发 酵生产羧酸的方法。
[0013] 所述羧酸包括乳酸、丙酮酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤:将30°C、220rpm下培养24h 的基因工程菌种子以5%的接种量转入发酵培养基于30°C、220rpm条件下培养96h。
[0015] 种子培养基为Yro培养基:葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
[0016] 发酵培养基：无氨基酵母氮源1.78凡、（顺4)230458/1、葡萄糖2(^/1，添加碳酸钙 5g/L〇
[0017] 采用酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌株时，发酵培养基中还需添加亮氨酸100mg/L、 色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿啼啶20mg/L。
[0018] 本发明用苹果酸脱氢酶基因 RoMDH替换PDC1，野生型酿酒酵母发酵的乙醇产量达 到最大值13.55±1.0628/1，改造菌株的乙醇产量为11.09±0.5398/1，较野生型下降了 18.15%。在此基础上，敲除SDH2基因，经培养基优化后，双基因缺少的酿酒酵母基因工程菌 可积累琥珀酸〇. 698 ± 0.0285g/L，相比之下，野生型酿酒酵母不积累琥珀酸。本发明可以有 效减少碳流的损失，并实现琥珀酸的积累，所得基因工程菌可用于构建其他羧酸高产菌株。
【附图说明】
[0019] 图1 roci的替换表达敲除盒，大小为2724bp
[0020] 图2 SDH2敲除盒，大小为1544bp。
[0021] 图3 PDC1基因敲除或者替换对乙醇发酵的影响。（a)菌体生长；（b)葡萄糖利用； (c)丙酮酸；（d)副产物乙醇。
[0022]图4 SDH2基因缺失对琥珀酸发酵的影响。（a)菌体生长；（b)葡萄糖利用；（c)琥珀 酸；（d)副产物乙醇。
【具体实施方式】
[0023] 高效液相色谱测定乙醇、残糖含量的方法:发酵液中乙醇和残糖含量的测定采用 高效液相色谱仪(HPLC)检测。发酵液经处理且上清液经0.22μπι微孔滤膜过滤后，利用RID (示差折光检测器)进行检测，液相色谱方法如下:色谱柱:BIO-RAD有机酸柱;柱温:35°C ;流 动相：0.0275%(v/v)稀硫酸，经0.2 2μηι滤膜过滤并除气；流速：0.6mL/mi η;检测时间： 25min;进样量：20yL。
[0024] 生物量的测定方法(Bio-Rid核酸仪）：用0.1M HC1稀释适当的倍数，设定波长为 600nm，取200yU则定其吸光值。
[0025]乙醇的测定方法(HPLC法）：高效液相色谱仪为美国Waters公司产品，型号为1515， 色谱柱为Aminex HPX-87H column(Bio-Rad)。乙醇用RID检测器。
[0026] 种子培养基组成:葡萄糖2%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，去离子水定容，pH自然， 高压灭菌（115°C，20min)。
[0027] 发酵培养基组成:无氨基酵母氮源3.4g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖40g/L，按要求分别 添加亮氨酸l〇〇mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿啼啶20mg/L。添加碳酸^Sg/L，装液 量为 40mL/250mL。
[0028] 实施例1低产乙醇及积累琥珀酸酿酒酵母工程菌的构建
[0029] 在野生型基础上用源于米根霉的苹果酸脱氢酶基因 RoMDH替换了丙酮酸脱羧酶基 因 roci。在此基础上，敲除琥珀酸代谢途径中的关键酶基因 SDH2。
[0030] 1、菌株和质粒
[0031 ]酿酒酵母（S · cerevisiae)CEN. PK2-1C购自欧洲EUROSCARF(http://web·uni- frankfurt · de/fbl5/mikro/euroscarf/data/cen · html)，其基因型为MATa; ura3_52; trpl- 289;leu2-3，112;his3A 1;MAL2-8G;SUC2。敲除盒模板 pUG27 质粒(包含 HIS3 标记基因 ）、Cre 表达质粒pSH47(用来标记回收）的构建方法参见文献"Guldener U，Heck S，Fielder T，et al.A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast [J].Nucleic Acids Res,1996,24(13):2519_2524"和"Guoqiang Xu,Qiang Hua，et al.Regulation of thiamine synthesis in Saccharomyces cerevisiae for improved pyruvate production.Yeast,2012,29:209-217" 〇
[0032] 2、基因敲除盒的构建
[0033] 以质粒ST+RoMDH+TDHt+HIS为模板，以MP-F、MP-R引物进行PCR扩增，获得序列如 SEQ ID勵.5所示的用1?)!1替换1^(：1的!115敲除盒，其部分序列与待敲除基因1^(：1编码区上 下游同源的DNA片段，其核酸电泳图如图1泳道1和2所示。以质粒pUG27为模板，以SDH2-F、 SDH2-R引物进行PCR扩增，获得SDH2的敲除盒，其核酸电泳图如图2泳道1所示。所用到的引 物序列如表1:
[0034] 表1.用RoMDH替换敲除H)C1基因及敲除SDH2所用到的引物
[0035]
[0036] 3、转化
[0037] 用LiAc方法将PDC1替换敲除盒转化酿酒酵母CEN.PK2-1C，涂布SD-HIS平板，得到 的阳性转化子提基因组进行PCR验证，正确的转化子保菌，即为pdcl单基因缺失株CEN.PK2- 1CMP。并用质粒pSH47将HIS标记去除。在此基础上，将SDH2基因敲除盒转化到酿酒酵母 CEN. PK2-1CMP，涂布SD-HIS平板，得到的阳性转化子提基因组进行PCR验证，正确的转化子 保菌，即为sdh2基因缺失株。通过改造代谢途径，得到可减少乙醇积累的酿酒酵母工程菌。
[0038] 实施例2发酵法产琥珀酸
[0039] 将30°C、220rpm下培养24h的基因工程菌种子以起始0D6Q() = 0.2的接种量转入发酵 培养基于30°C、220rpm条件下培养96h，每隔一定的时间段取样测0D，同时取样lmL离心保存 用来测乙醇和琥珀酸的产量。
[0040]细胞生物量的测定方法：
[0041 ]取一定量的菌悬液置于1.5mL EP中，加适量的0.1M的稀盐酸溶解菌悬液中的碳酸 钙并同时稀释到合适倍数，涡旋混匀，用Bio-Rid核酸仪，于600nm处比色测0D值。
[0042]乙醇和琥珀酸含量的测定方法(HPLC法）：
[0043] 将每个时间点的发酵液12000rpm离心2min，取上清500yL，用三氯乙酸等倍处理， 于4°C放置3h以上，沉降蛋白。然后用0.22μπι的亲水膜过滤后，得到的样品进行HPLC分析。
[0044] 对照菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C在36h时积累乙醇达 13.55土 1.062g/L，用RoMDH替换PDC1后，乙醇产量下降到11.09 ± 0.539g/L，较改造前下降了 18.15 %。在此基础上，SDH2敲除后，琥珀酸产量达到0.698 ±0.0285g/L，而敲除前，酵母菌 株是不积累琥珀酸的。
[0045] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，以酿酒酵母为出发菌株，用苹果 酸脱氢酶基因替换了乙醇代谢途径中的丙酮酸脱羧酶基因 roci，并敲除了琥珀酸代谢途径 中的琥珀酸脱氢酶基因 SDH2。2. 根据权利要求1所述的一种产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述苹果 酸脱氢酶基因来源于米根霉。3. 根据权利要求1所述的一种产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述琥珀 酸脱氢酶基因 SDH2的核苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。4. 根据权利要求1所述的一种产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述酿酒 酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1C;其基因型为:MATa;ura3-52; trpl-289; leu2-3，112 ;his3 Δ 1; MAL2-8c；SUC2〇5. -种构建权利要求1-4任一所述的酿酒酵母基因工程菌的的方法，其特征在于，将序 列如SEQ ID N0.5所示的PDC1替换敲除盒，以及SDH2敲除盒，分别转化酿酒酵母CEN.PK2-1C，构建得到产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌。6. -种应用权利要求1-4任一所述酿酒酵母基因工程菌发酵生产羧酸的方法，其特征 在于，所述羧酸包括乳酸、丙酮酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、酮戊二酸。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤:将30 °C、220rpm下培养24h 的基因工程菌种子以5%的接种量转入发酵培养基于30°C、220rpm条件下培养96h;发酵培 养基:无氨基酵母氮源1.78/1、（順4) 23〇458/1、葡萄糖2(^/1，添加碳酸钙58/1。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，采用酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌株 时，发酵培养基中还需添加亮氨酸l〇〇mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿啼啶20mg/L。9. 权利要求1-4任一所述酿酒酵母基因工程菌在构建羧酸高产菌株中的应用。
【文档编号】C12N15/81GK105838632SQ201610333309
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】徐国强, 蒋伶活, 苏珂, 李佳雨, 刘维瑾, 范欧洋, 赵祯
【申请人】江南大学