一种防治花生病害的放线菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种防治花生病害的放线菌及其应用，菌株LX14的命名为淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2014年1月22日，保藏编号为CGMCCNo.8806。本发明从土壤中分离筛选出代谢物淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)，对花生真菌抑制作用强，应用于防治花生冠腐病菌、花生疮痂病、花生根腐病和花生白绢病，对花生病害的防治具有重要意义，在植物病害生物防治中所起到的作用非常重要，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径，具有良好的开发应用前景。CGMCC NO. 880620140122
【专利说明】
一种防治花生病害的放线菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种防治花生病害的放线菌，即淡紫灰链 霉菌（Streptomyces lavendulae)及其应用。
【背景技术】
[0002] 生物防治是指利用有利生物防治植物病害的各种措施。我们所利用的主要是有益 微生物，有益微生物又称拮抗微生物或者生防菌。生防菌的种类繁多，生产上广泛应用的有 生防真菌、生防细菌、放线菌、病毒等。真菌主要有木霉菌、毛壳菌、酵母菌、淡紫拟青霉菌、 厚壁孢子轮枝菌及菌根真菌等；细菌主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌等促进植物生长菌 (PGPR)、放射性土壤农杆菌和巴氏杆菌等；放线菌主要有链霉菌及其变种；病毒的弱毒株 系;病原菌的无致病力突变菌株。我们现在通常用到的大多是生防真菌和生防细菌，这是我 们现代意义上的生物防治。传统意义上的生物防治通常是利用生物的天敌防治或者利用作 物对病虫害的抗性防治以及耕作防治、不育昆虫防治和遗传防治等。但是这些方法作用的 范围非常有限并且作用效果也会慢慢的随着病害虫的进化而失去作用。更重要的是在土壤 中存在的微生物真菌是不能被抑制的。于是，美国国家科学院1987年将生物防治的定义扩 大为:利用自然的或经过改造的生物，基因或基因产物来减少有害生物的作用，使其有益于 生物如作物，树木，动物益虫及微生物。目前被广泛接受的生物防治的定义是:利用有益微 生物杀灭或降低病原生物的数量以控制植物病害发生、发展的一类措施。因此，如何探究生 防菌对植作物的良好作用，具有重要的现实意义。
[0003] 放线菌(Actinomycete)是原核生物的一个类群。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝 纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5~1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸 收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据;气生菌丝，叠生于营养菌丝 上，又称二级菌丝。线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70% 是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、和纤维素 酶等）、维生素(B12)和有机酸等。弗兰克菌属(Frankia)为非豆科木本植物根瘤中有固氮能 力的内共生菌。此外，放线菌还可用于留体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少 数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，放线菌与人类关系密切，在医 药工业上有重要意义。放线菌中放线菌中应用最多的是链霉菌及其变种，已有许多的成型 制剂应用于生产上，如井岗霉素、内疗素、768、S-921、农抗120等，可用于防治杨树腐烂病 菌、葡萄孢菌、黄瓜黑星病菌、辣椒疫病菌、棉花黄萎病菌、立枯丝核菌及番茄早疫病菌、灰 霉病菌、甘蓝黑腐病菌和白菜软腐病菌。今后应在明确其有效成分的基础上，开发高效价的 菌剂。我们主要研究一下放线菌对花生病菌的抑制作用。
[0004] 当前对花生病害的防治主要通过种植抗性品种和化学防治来控制，但有害生物抗 性问题日益严重，且化学农药残留造成严重的危害，如造成残毒、污染环境，对人体健康、生 态环境造成了很大的威胁，不利于花生种植产业生产的可持续发展。因此寻找一种经济、安 全、有效的防治措施是当务之急。放线菌广泛存在于不同的自然生态环境里，土壤是放线 菌习居的良好场所。许多放线菌能够产生抗生素，具有良好的抑制植物病原菌生长和促进 植物生长作用。因此，如何从土壤中分离到一种抑制花生真菌的放线菌，并对该菌株对花生 真菌的抑菌作用做进一步研究，研究其该菌株的应用为微生物源农药的进一步研制和开发 提供开阔应用前景。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中存在的有害生物抗性问题日益严重，且化学农药残留造成严重的 危害，如造成残毒、污染环境的问题，本发明的目的在于提供一种防治花生病害的放线菌， 其具有显著的抑制花生真菌的作用，及在生物防治农药中的应用。
[0006] 本发明采取的技术方案为：
[0007] -种防治花生病害的放线菌，放线菌为菌株LX14,其命名为淡紫灰链霉菌 (Streptomyces lavendulae)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，：保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日：2014年1月22日，保藏编号为 CGMCCNo.8806〇
[0008] 进一步的，所述菌株应用于防治花生冠腐病菌、花生疮痂病、花生根腐病和花生白 絹病。
[0009] 进一步的，所述菌株用于制备防治花生冠腐病菌、花生疮痂病、花生根腐病和花生 白絹病的制剂。
[0010] 本发明的有益效果为：
[0011 ] 1、本发明从土壤中分离筛选出代谢物淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)， 对花生主要病害均有防治作用，对多种病原真菌具有拮抗作用，尤其对花生真菌抑制作用 强，对花生病害的防治具有重要意义，在植物病害生物防治中所起到的作用非常重要； [0012] 2、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)的菌株培养条件简单，容易保存，易 于工业化生产，该菌株可应用于植物真菌病害的防治，为农用杀菌剂的开发增添了新的途 径，具有良好的开发应用前景。
【附图说明】
[0013] 图1为菌株LX14的菌落形态图；
[0014] 图2为菌株LX14的16srDNA的PCR产物扩增结果图；
[0015]图3为菌株LX14GenBank数据库中相关属种构建的以16SrDNA序列为基础的系统发 育树；
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图进一步说明本发明。
[0017] 探究放线菌LX14分离纯化以及对花生真菌抑制情况
[0018] 1.实验原理
[0019] 高氏1号是一种能够培养放线菌的培养基，当稀释在之后的土壤在高氏1号培养基 上进行平面涂布之后能够分离到单菌落，从而粗略分离到可能是放线菌的单菌落。然后，经 过电泳大小测定，16srDNA的序列测定。PDA培养基是一种既能够培养细菌又能培养真菌的 培养基。我们用roA培养基同时培养花生真菌和放线菌来探究放线菌对花生冠腐病菌、花生 疮痂病、花生根腐病和花生白絹病的抑制。
[0020] 2.材料及方法
[0021] 2.1试验材料
[0022] 2.1.1土壤的来源及稀释处理
[0023] 土壤取自山东花生研究所（山东省莱西市）的试验田。取5g花生土壤蒸馏水进行溶 解，溶解之后取l〇〇ul溶解的土壤上清液菌液于1.5ml的EP管中，取900ul蒸馏水于上面的EP 管中，对菌液稀释十倍。取稀释上述稀释十倍的菌液l〇〇ul于第二个EP管中，再取900ul的蒸 馏水于其中，对其稀释100倍，同理再对其稀释1000倍。分别编上序号为1、2、3。
[0024] 2.1.2培养基
[0025]分离培养基:高氏1号培养基.
[0026] 真菌培养基:PDA培养基
[0027]放线菌形态鉴定所用培养基:为国际链霉菌计划（ISP)所指定的7种培养基，即甘 油天冬素琼脂培养基（ISP-2)、无机盐淀粉琼脂培养基（ISP-3)、酵母精麦芽糖精琼脂培养 基（ISP-4)、燕麦粉琼脂培养基（ISP-5)、高氏合成1号培养基、察氏（Czapck)培养基和马铃 薯浸汁培养基(PDA)。
[0028] 2.1.3试验真菌
[0029] 山东花生研究所分离的的花生冠腐病菌、花生疮痂病菌、花生根腐病菌和花生茎 腐病囷。
[0030] 2.2实验方法
[0031](一)放线菌分离:取上述稀释的菌液1、2、3号分别涂到三个高氏培养基上，利用平 面涂板的方法进行均匀涂板，并编号A、B、C。于28°C恒温培养箱中倒置培养2-3天。
[0032](二)观察在高氏培养基上的菌落形态种类，分别挑取不同的单菌落于高氏1号培 养基上进行划线培养，并于28 °C的恒温培养箱中培养2-3天。
[0033](三)形态学鉴定:将筛选出来的放线菌接种于国际链霉菌计划（ISP)所指定的7种 培养基上，在28 °C下培养7d后，观察并记录菌落的整体形态、气生菌丝和基生菌丝的颜色、 可溶性色素的有无及其颜色。
[0034](四）分别挑取分离出来的菌加入到有高氏1号液体培养基的1.5ml的EP管于28 °C 的恒温摇床上进行培养2-3天。
[0035](五)对活化的菌液进行电泳测定，并对其进行16srDNA序列测序选取对植物真菌 病害具有拮抗活性的细菌菌株，挑取10个相同的菌落做重复，进行基因组DNA的提取，其提 取方法主要参照TIANGEN TIANamp BACTERia DNA Kit试剂盒说明书进行，并略加修改，步 骤如下：
[0036] (1)取细菌培养液lmL，10000rpm离心lmin，尽量吸净上清；
[0037] (2)向菌体沉淀中加入200yL缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮；
[0038] (3)加入 4yLRNAase (100mg/mL)溶液，震荡 15s，室温放置 5min;
[0039] (4)向管中加入20yL蛋白酶K溶液，混匀；
[0040] (5)加入220yL缓冲液GB，震荡15s，70 °C放置10min，简短离心以去除管盖内壁的水 珠；
[0041 ] (6)加入220yL无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以 去除管盖内壁的水珠；
[0042] (7)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱GB3中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；
[0043] (8)向吸附柱CB3中放入500yL缓冲液GD(使用前检查是否加收入无水乙醇）， 12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；
[0044] (9)向吸附柱CB3中放入700yL漂洗液PW(使用前检查是否加收入无水乙醇）， 12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；
[0045] (10)向吸附柱CB3中放入500yL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱 CB3中放入收集管中；
[0046] (11)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于 室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
[0047] (12)将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200yL 洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20 °C保存。 [0048](六)PCR与序列测定
[0049] (1)提取的DNA参照TaKaRa公司的 16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit 试剂盒说明书进行PCR扩增，其中正向引物为:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，反向引物为： 3 ' -CGCTTACCTTGTTACGACTT-5 ' 1CR扩增条件如下：94°C预变性5min; 94°C变性lmin; 53 °C 退 火lmin;72°C延伸90s;72°C后延伸5min，共30个循环。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳分 离，EB 染色后置于 3UVTMTrans i 1 luminator (UVP，USA)下进行观察。
[0050] (2)根据预先设计的引物与预期扩增片段大小，结合Marker，目的片段在紫外灯下 切割下来，用回收试剂盒Silica Bead DNA GelExtraction Kit进行DNA的回收。16srDNA序 列测定由宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定。通过BLAST程序将测定的序列与 GenBank(NCBI，网站http: //blast .ncbi .nlm.nih · gov/Blast · cgi)中的序列比较，然后从 GenBank中获得和试验菌株序列相近种、属的16srDNA序列进行确定。
[0051] (七)于PDA上接种花生冠腐病菌、花生疮痂病菌、花生根腐病菌和花生白絹病菌， 并根据真菌的生长状况进行对上述分离到的放线菌进行接种，探究观察放线菌对这几种花 生真菌的抑制情况。
[0052](八)发酵大量培养放线菌，并对试验田进行喷洒。
[0053] 3.结果与分析
[0054] 3.1
[0055]通过划线平板的培养方法我们观察到放线菌的形态特征:放线菌总的特征介于霉 菌和细菌之间。一般圆形、光平或有许多皱褶，光学显微镜下观察，菌落周围具辐射状菌放 线菌丝。单个菌落不大，半径在〇 · 2mm-0 · 5mm之间，一般呈白色，在特许条件下还会成黄色。 链霉菌的菌落是这一类型的代表。链霉菌菌丝较细，生长缓慢，分枝多而且相互缠绕，故形 成的菌落质地致密、表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，菌落较小而不蔓延；营养菌 丝长在培养基内，所以菌落与培养基结合较紧，不易挑起或挑起后不易破碎：当气生菌丝尚 未分化成孢子丝以前，幼龄菌落与细菌的菌落很相似，光滑或如发状缠结。有时气生菌丝呈 同心环状，当孢子丝产生大量孢子并布满整个菌落表面后，才形成絮状、粉状或颗粒状的典 型的放线菌菌落;有些种类的孢子含有色素，使菌落有面或背面呈现不同颜色，带有泥腥 味。如图1所示。
[0056] 3.2生理生化鉴定结果
[0057] LX14菌株的生理生化鉴定结果见表1 [0058] 表1活性菌株LX14的生理生化特征
[0059]
[0060]注："+"表示反应结果为阳性；"一"表示反应结果为阴性。
[0061 ] 3.3 16srDNA 序列分析
[0062] 以菌株的基因组DNA为模板，利用TaKaRa公司的16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒对LX14菌株的16srDNA序列进行PCR扩增，扩增结果见图2。 通过电泳检测发现LX14菌株和KC1菌株6srDNA片段大小约为1500bp，片段大小与试剂盒预 期设计相符。PCR产物纯化回收后直接进行序列测定。测定序列结果表明LX14菌株的 16srDNA片段共有1459nt碱基对组成。利用NCBI网站上的BLAST程序对该序列进行序列比 对，获得已定名的与之相似的属、种的相关信息，比对结果显示该活性菌株的16srDNA序列 与GenBank基因库中链霉菌属的Streptomyces lavendulae的16srDNA序列高度同源，同源 率达99%。构建发育树和同源性分析结果显示（图3)，菌株LX14与链霉菌的Streptomyces lavendulae (AccessionNo :NR_115620)单独构成一个分支，进化上的距离最近，反映出它们 之间亲缘关系最近，运用DANMAN软件分析得到二者同源性为94.5%。结合传统的生理生化 特性鉴定以及16SrDNA序列分析的结果，将菌株LX14归为链霉菌属的Streptomyces lavendulae。
[0063] 菌株LX14的16S rDNA核苷酸全序列如下所示：
[0064] 16sF)
[0065] ATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGC CCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATCACTCCTGCCTGCATGGGCGGGGGTCGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATG AGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGAC CGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAG CCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTG ACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG GGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCCCGGGG CTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGA AATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCG TGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACG TCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGA CGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACA CCGGAAACGGCCAGAGATGGTCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTG AGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTC ACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGC ACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTC GGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACG TTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTG GGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGG ATCACCTCCTTTCT(16sR)
[0066] 3.4对真菌病害抑制作用
[0067] 3.4.1真菌的培养
[0068] 在无菌操作台中将花生冠腐病、花生疮痂病、花生根腐病、花生白絹病菌用镊子取 约0· 5cm*0· 5cm的正方形小块接种至PDA培养基中，于28°C温室中倒置培养3天。
[0069] 3.2接种细菌
[0070]待真菌长至约占培养皿1/3大小时在距离真菌l-2cm处接种实施例2菌株，继续放 置28摄氏度温室培养2-3天，观察真菌生长状况。
[0071] 抑菌率=[(对照真菌生长半径-处理真菌生长半径）/对照真菌生长半径]X 100%〇
[0072] 通过平板对峙法，试验试验结果表明LX14对花生冠腐病、疮痂病、根腐病和白絹病 的菌丝均有明显抑制作用(表1、2、3、4)。
[0073]表1 LX14与花生冠腐病的对峙实验结果(三批实验，每次三个重复）
[0074]
[0075]表2 LX14与花生疮痂病的对峙实验结果(三批实验，每次三个重复）
[0076]
[0077]
[0078]表3 LX14与花生根腐病的对峙实验结果(三批实验，每次三个重复） 「00791
[0080] 表4 LX14与花生白絹病的对峙实验结果(三批实验，每次三个重复）
[0081]
[0082] 3.5LX14菌株田间防治花生病害试验
[0083] 4.1菌株发酵液制备将实施例2菌株活化后接入高氏1号液体培养基，置于28度摇 床中180r/min震荡培养3d。高氏1号液体培养基配方为:胰蛋白胨lOg/Ι酵母提取物5g/L和 氯化钠 5g/L;
[0084] 4.2分别在播种期、播种后10d、20d利用LX14发酵液灌根，设置50 %多菌灵800倍液 和清水两个对照。花生冠腐病于花生出苗后开始调查，至始花期结束。花生疮痂病、花生根 腐病、花生白絹病菌于花生收获前l〇d进行调查。
[0085] 病株率=发病株数/总株数X 100%
[0086]病情指数=Σ (发病级代表值X各级病株数）X 100/(调查总株数X最高级发病代 表值）
[0087]防治效果=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]X 100%
[0088]用LX14菌株处理花生菌株，田间试验均表明对花生冠腐病、疮痂病、根腐病和白絹 病均有明显防治效果(表5、6、7、8)。
[0089]表5菌株LX14田间对花生冠腐病的防治效果
[0090]
[0091] 表6菌株LX14田间对花生疮痂病的防治效果
[0092]
[0093]
[0094]表7菌株LX14田间对花生根腐病的防治效果
[0095]
[0096] 表8菌株LX14田间对花生白絹病的防治效果
[0097]
[0098] 本实验通过分离纯化放线菌LX14并对其大量发酵之后对试验田的花生进行喷洒， 以达到促进花生抵抗花生真菌的危害并提高产量的目的。正是放线菌LX14的喷洒才能抑制 花生种植地的多种真菌的生长，从而进一步帮助花生生长。
[0099] 以上所述并非是对本发明的限制，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明实质范围的前提下，还可以做出若干变化、改型、添加或替换，这些改进 和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种防治花生病害的放线菌：放线菌为菌株LX14,其命名为淡紫灰链霉菌 (Streptomyces lavendulae)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏日：2014年1月22日，保藏编号为CGMCCNo.8806。2. 根据权利要求1所述防治花生病害的放线菌，其特征在于，所述菌株应用于防治花生 冠腐病菌、花生疮痂病、花生根腐病和花生白絹病。3. 根据权利要求1所述防治花生病害的放线菌，其特征在于，所述菌株用于制备防治花 生冠腐病菌、花生疮痂病、花生根腐病和花生白絹病的制剂。
【文档编号】C12N1/20GK105838642SQ201610281129
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】迟玉成, 吴菊香, 许曼琳, 王磊, 张天培, 王宝亮, 张竹青, 孙旭亮
【申请人】山东省花生研究所