解淀粉芽孢杆菌hcs及其在甘蔗生产上的应用
【专利摘要】本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens ）HCS，已于2012年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.6591。本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens ）HCS的用途是其在甘蔗生产中的应用，通过组培苗假植、大田定植以及种茎浸种试验表明，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens ）HCS对甘蔗根部病害有很好的抑制作用，对甘蔗生根、生长有较好的促生根和促生长作用；表明该菌株是一株在防治甘蔗生产上具有潜在意义的生防菌株。CGMCC NO.659120120919
【专利说明】
解淀粉芽抱杆菌HCS及其在甘薦生产上的应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体设及一种解淀粉芽抱杆菌HCS及其在甘薦生产 上的应用，该菌株可广谱防治植物不同类型病害及其在甘薦组培苗假植、定植过程中促进 甘薦生根、生长和甘薦种茎种植时促进生根、增加分葉及提高产量。
【背景技术】
[0002] 化学农药是防治植物病害的重要资源，但由于过多、错误使用，有导致农药残毒、 环境污染和生态破坏之弊。急需寻找一种能替代的、更安全有效的防治方法。尽管很多生防 制剂已被证实具有防治作用，但仅有少数几种应用于生产，大部分仍处于研究和探索阶段。 而已应用于生产的生防制剂，每种生防制剂一般只能防治少数几种类型的病害，不具有广 谱防治能力，促进植物生长的效果不明显。
[0003] 甘薦（Saccharum Officinarum L.)是我国最主要的糖料作物，也是世界主要能源 作物，甘薦糖产量占我国食糖总产量的90% W上。甘薦是无性繁殖作物，也是多年宿根栽 培作物，多年种植尤其是宿根种植易遭一些病原物的反复侵染和危害。早在20世纪70年代 末，己西等国就开始对甘薦健康种苗进行研究，80年代中期，健康种苗生产已获成功，并在 甘薦生产上推广使用。国内的许莉萍等在90年代开始通过组织培养和蔽芽培养的方法培 育甘薦健康种苗，W去除甘薦花叶病和宿根矮化病，能够提高甘薦产量15%W上，薦糖份含 量提高0.5%W上。目前，甘薦组培苗生产是利用适宜的人工培养基及光照、溫度等人工条件 下，通过诱导出愈伤组织、不定芽、不定根等培养步骤，最后形成完整的植株，其幼苗根系吸 收能力不强，抗逆性较差，假植成活率只有70%左右，有时甚至低于50%，大多都是因为 瓶苗单一植株生根数少、二级根系不发达、假植后由于根部病害及不能适应外界环境而死 亡。虽然假植苗成活率受各种因素影响，但保证苗的根系健康及发达程度是最为重要的。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种解淀粉芽抱杆菌HCS及其在甘薦生 产上的应用，该菌株可用于防治甘薦根部病害，并能有效地促进甘薦生长、生根，保证根系 健康和发达。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一株解淀粉芽抱杆菌菌株，命名为解淀粉芽抱杆菌(BaciIlus amyIoliquefaciens) 肥S，已于2012年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，地址:北 京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏编号:CGMCC NO.6591。
[0006] 本发明所提供的解淀粉芽抱杆菌(Baci Ilus amyIoIiquefaciens)HCS菌株，分离 自我国海南省薦区的甘薦根际上壤，经形态学、培养性状、常规生理生化和16S rDNA序列鉴 定，该菌株为解淀粉芽抱杆菌(BaciIlus amyIoliquefaciens)的一个新菌株，命名为解淀 粉芽抱杆菌(8日。;111118日11171〇11911日化。1日]13)肥5。
[0007] 本发明所提供的解淀粉芽抱杆菌(BaciIlus amyIoliquefaciens)肥S的基本生物 学特性为:菌落圆形、淡褐色、菌落中央颜色略深、隆起、表面光滑;菌体形态杆状、端圆；革 兰氏阳性，产生芽抱，周生鞭毛、具运动性，抱子囊不膨胀，芽抱卵圆形。
[000引本发明的解淀粉芽抱杆菌（BaciIlus amyIoIiquefaciens化CS菌株的培养方式 为： 1) 固体培养:把菌株接种于LB固体培养基上，在37°C恒溫培养箱中培养24小时； 2) 液体培养:把菌株接种于LB液体培养基中，在37°C溫度下，转速17化pm的摇床上培养 36小时。
[0009]本发明提供了解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens WCS在甘薦生产 中的应用。
[0010]具体的，指解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amylolique化Ciens )肥S在甘薦防病、促 生根、促生长中的应用，如:其在甘薦组培苗假植、定植过程中促进甘薦生根、生长和甘薦种 茎种植时促进生根、增加分葉及提高产量等方面。
[0011] -种在甘薦生产中防病、促生根、促生长的生物制剂，其活性成分为前述的保藏编 号为CGMCC NO.6591的解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )肥S。^本发明所 提供的解淀粉芽抱杆菌(8日(3；[11118日11171011911日'日(31日]18；)肥5为活性成分的生物制剂也属 本发明的保护范围。需要的时候，该制剂可W包含生物制剂制备的常用载体和辅料。
[00切本发明通过组培苗假植试验发现：解淀粉芽抱杆菌（B a C i 1 1 U S amyloliquefaciens化CS对抑制假植时的根部病害，促进假植苗生根和生长均有很好的效 果，防治根部病害的防效可达100%，且经处理过的假植苗的根须发达、巧壮且平均高度比对 照局3cm左右。
[0013] 本发明通过组培苗移栽定植试验发现:处理过的组培苗根系发达，平均分葉数比 对照提高了 25%左右。
[0014] 本发明用不同稀释倍数的HCS菌悬液浸泡甘薦种茎后种植，40天后的调查结果发 现：出苗率比对照高出30%，且根部须根正常，没有发现在对照根部须根上的坏死斑块，平均 高度比对照高出IOcm左右，表明其具有防治根部病害及促生根、促生长的功效。
[0015] 综上，本发明通过对薦区甘薦根际±壤中微生物的筛选分离，获得解淀粉芽抱杆 菌（8日(3；[11118日11171011911日'日(31日]13)肥5，通过组培苗假植、定植及种茎浸泡等不同试验的 研究，结果表明：解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens WCS可W有效防治甘薦 生产时的根部病害，并能够有效促进甘薦生根和促进甘薦生长。表明解淀粉芽抱杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens )肥S是一株在甘薦生产上具有潜在应用价值的生防菌株。
[0016] 本发明由国家自然科学基金(31471555)、海南省自然科学基金(314120)及国家现 代农业甘薦产业技术体系提供资金支持。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。W下实施例用于 说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常 按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0018] 实施例1植物病原真菌括抗菌株的筛选及其鉴定 菌株筛选:称取5克根际±壤(我国海南省临高县皇桐镇甘薦基地甘薦植株的根际± 壤），放入有100mL无菌水的S角瓶中，在摇床上剧烈振荡30min后，静置15min。取Iml稀释至 1 (T4、ICT5、1 (T6浓度梯度，从各浓度梯度悬浮液中取0.1 ml，用无菌涂棒涂于LB培养基(配方 为:每升含有蛋白腺IOg，酵母粉5g，化Cl IOg，琼脂粉12g，抑7.0~7.2)平板上，37°C恒溫培 养箱倒置培养，连续观察3天，挑取菌落形态不同的菌株再次划线纯化保存备用。在倒好的 PDA平板表面涂布甘薦根腐病菌抱子，在超净工作台内惊干后，用无菌牙签点接筛选纯化后 的菌株进行对時培养，筛选抑菌作用最强(抑菌活性最强）的菌株，结果得到一株对甘薦根 腐病菌有很强括抗作用的菌株，将该菌株命名为解淀粉芽抱杆菌（Baci Ilus amyloliquefaciens )HCS。已于2012年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中屯、，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号:CGMCC No.6591。
[0019] 菌株的基本生物学特性:菌落圆形、淡褐色、菌落中央颜色略深、隆起、表面光滑； 菌体形态杆状、端圆；革兰氏阳性，产生芽抱，周生鞭毛、具运动性，抱子囊不膨胀，芽抱卵圆 形。
[0020] 菌株16S rDNA保守序列的测定：将筛选得到的解淀粉芽抱杆菌（Baci Ilus amy 101 iquef aci enS化CS菌株的基因组DNA为模板，W细菌16S rDNA序列通用引物Po、Ps作 为引物，PCR扩增出约1.化b左右的产物片段，测序结果表明扩增出的序列长度为1516个碱 基(见序列表）；将该序列通过互联网比对（http: / /丽W. ncbi.nlm. nih. gov/blast/B last, cgi)，扩增的片段序列与解淀粉芽抱杆菌的16S rDNA部分序列的同源性达99%W 上，确定该菌株归属为解淀粉芽抱杆菌(BaciIlus amyloliquefaciens)。
[0021] 实施例2解淀粉芽抱杆菌(Bacillus am^olique化ciens)肥S对假植组培苗的防 病、促生根及生长的研究 W解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )肥S为菌种培养得到生物制剂（W 下为重量百分比）： 1.固体培养:将处于保藏状态的解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens ) 肥S接种于固体培养基（1%膜蛋白腺，0.5%酵母提取物，l%NaCl，1.2%琼脂粉，pH7.0.)中，于 37 °C培养箱中培养1天，使菌株活化。
[0022] 2、液体培养:将活化的解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )肥S接种 于装有液体培养基（1%膜蛋白腺，0.5%酵母提取物，l%NaCl，pH7.0.)的SOOmlS角瓶中，每瓶 装200ml，在37°C下，转速17化pm的摇床上培养36h，得到液态生物制剂，并将其稀释至1〇-1、 i(T2、i(r3、i(r4、i(r5、i(r 6、i(rM；：个浓度梯度，获得相应的生物制剂菌悬液。
[0023] 穴盘假植组培苗:将相对统一的组培苗定植穴盘，用上述不同浓度梯度的生物制 剂菌悬液作为压根水诱入，W清水诱入作为对照。试验共设8个处理，每个处理重复4次，每 个重复为32穴(棵）。处理1至处理7分别用10^、10^、10^、10^、10^、10^、10可农度梯度的生 物制剂菌悬液作为压根水诱入，处理8为清水对照。7天之后再次诱入上述不同浓度梯度的 生物制剂菌悬液和清水，其余管理相同。
[0024] 30天后进行调查，观察根部发病情况，计数发根数量，测量株高。结果表明（见表 1)，用生物制剂菌悬液处理的处理7的组培苗根部有少许黑斑，清水对照的处理8的根部黑 斑数超过了50%，其它处理均表现为根部须根洁白，无黑斑。同时计数的发根数量表明：处理 3至处理7、W及清水对照的处理8的发根数均多于处理1和处理2,可能较高的菌悬液浓度抑 制了根的生长。株高的测定结果显示:处理5最高，其次为处理4、处理6和处理7,清水对照与 处理3相当，处理I、处理2最低。通过分析可知:在穴盘假植组培苗时，用度为1(T5的生物制剂 菌悬液处理时可W同时达到防病，促生根和生长的作用。
[0025]表1穴盘假植苗30天后的调查结果
[00%] 实施例3解淀粉芽抱杆菌(Bacillus am^olique化ciens)肥S对定植组培苗的防 病、促生根及生长的研究 本试验利用实验室在基地生产的常规假植苗30天后大田移栽时进行，试验设4个处理， 处理1至处理4分别为浓度为l(T3、l(r4、l(r5的生物制剂菌悬液W及清水对照，每个处理重复 4次，每个重复1000株。【具体实施方式】为，定植后立即诱入不同浓度梯度的生物制剂菌悬液 和清水作为定根水，其余所有管理相同。
[0027] 50天后进行调查。结果表明（见表2)，用不同浓度生物制剂菌悬液处理的定植苗的 须根数明显多于清水对照，用浓度1(T3的生物制剂菌悬液处理的株高明显高于i(T4、i(r 5处 理W及清水对照处理。而通过每重复挖出10棵(丛)对根部病害发生情况的调查结果表明： 只有用浓度1(T3的生物制剂菌悬液处理的根部无明显黑色病斑，清水处理的根部黑色病斑 达309似上。调查所有分葉情况表明，用浓度1(T 3的生物制剂菌悬液处理的分葉数最多，比清 水对照高26.39〇/〇。
[002引表2穴盘假植苗定植大田50天的调查结果
[00巧]实施例4解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens化CS对种茎种植的防 病、促生根及生长的研究 用清水和不同浓度梯度的生物制剂菌悬液通过浸泡甘薦种茎后种植，40天后进行相关 调查。试验设4个处理，处理1至处理4分别为分别为浓度为l(T2、l(r3、l(r4的生物制剂菌悬液 W及清水对照，每个处理重复4次，每个重复1000段双芽种茎。
[0030]结果表明（见表3):用浓度1(T2的生物制剂菌悬液处理的出苗率比清水对照处理的 出苗率高出30%，且根部须根正常，没有发现清水对照根部须根上出现的坏死斑块，平均高 度比清水对照高出IOcm左右，表明其具有防治根部病害及促生根、生长的功效。
[00311 亲3釉S爲施]釉枯40手民的固杏结里
[0032] 综上所述:解淀粉芽抱杆菌(Bacillus am^olique化ciens )肥S是一株来自甘薦 根际的菌株，它与植物根部关系密切，且对许多±传植物病原物具有较好的抑制作用、兼顾 促进植物生根和植物生长，重新施入环境中也不会导致环境污染，具有很好的开发前景。
[0033] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一株解淀粉芽孢杆菌菌株，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) HCS，已于2012年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编 号：CGMCC N0.6591。2. 权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )HCS在甘鹿生产 中的应用。3. 权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens )HCS在甘鹿防 病、促生根、促生长中的应用。4. 一种在甘蔗生产中防病、促生根、促生长的生物制剂，其活性成分为权利要求1所述 的保藏编号为CGMCC N0.6591 的解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )HCS。
【文档编号】C12R1/07GK105838649SQ201610328203
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】熊国如, 赵更峰, 蔡文伟, 武媛丽, 伍苏然, 张树珍, 杨本鹏
【申请人】中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南医学院