防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一株防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌及其应用，所述广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌为芽胞杆菌(Bacillus sp.)WXCDD105，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年5月25日，保藏编号为CGMCC No.12496。本发明的生防菌株具有耐紫外耐干旱的特性，对番茄灰霉病和叶霉病的防治效果较强，能够抑制多种农作物枯萎病菌、玉米茎基腐病菌、水稻立枯病菌、刺五加根腐病菌、黄瓜褐斑病菌、黄瓜炭疽病菌、玉米大斑病菌、番茄斑枯病菌、葵花菌核病菌、草莓灰霉病菌、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、链格孢等真菌病害，并且对番茄种子和幼苗具有促生长作用，还能改善果实品质，降低腐烂率。CGMCC No.1249620160525
【专利说明】
防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌及其 应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一株对番茄灰霉病和叶霉病等具有较强拮抗作 用的芽胞杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 番茄灰霉病和叶霉病是一类发病率高、传播速度快的植物病害，特别是在保护地 更为严重，已成为番茄栽培期间的主要病害，严重影响番茄的产量和品质。目前，在番茄灰 霉病和叶霉病防治过程中仍以化学农药为主。化学农药在植物病害控制方面虽然发挥了巨 大的作用，但其弊端也日益突出。长期大量使用化学农药会使病菌抗药性增强。此外，在杀 死病菌的同时也会威胁到有益微生物、破坏农业生态系统、危害人类健康。因此，具备低污 染、低残留，对人类健康安全等优点的生物防治受到人们广泛的关注，并在实践应用中发挥 着越来越重要的作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一株防治番茄灰霉病及叶霉病效果极好，并具有抑菌谱广、 生防持效期长、促进植物生长、改善果实品质、耐紫外耐干旱等特性的广谱抗病促生抗逆芽 胞杆菌及其应用。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0005] -株防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌，它为芽胞杆菌 (Bacillus sp. )WXCDD 105，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年5月25日，保藏编 号为CGMCC No.12496。
[0006] 芽胞杆菌(Bacillus sp.)WXCDD105形态特性:革兰氏染色阳性，有芽胞产生，芽胞 中生、椭圆形、胞囊不膨大。接种在LB固体培养基上，菌落呈乳白色、扁平、表面粗糙、边缘不 整齐。在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
[0007] 芽胞杆菌(Bacillus sp.)WXCDD105生理生化特性:好氧型细菌，发酵型产酸，其 中：甲基红反应、V. P.试验呈阴性，硝酸盐还原反应、淀粉水解、接触酶反应、明胶液化、柠檬 酸盐利用试验呈阳性。生长温度范围4-37Γ，最适生长温度是30°C。
[0008] 芽胞杆菌（Bacillus sp. )WXCDD105分子生物学鉴定结果：将菌株WXCDD105的 16SrDNA序列提交到NCBI的GenBanK数据库中并进行Blast比对，比对结果发现与其同源性 较高的菌株均属于芽胞杆菌属(Bacillus sp.)。由构建出的系统发育树可看出，与其在同 一个分支上的几种菌株均属于芽抱杆菌，其中与Bacillus subtilis subsp.inaquosorum (八1?腸1000021)和83(311118丨6911丨16118丨8(4￥1'001000043)相似性均为99.93%。通过形态观 察、生理生化特性鉴定和16SrDNA序列分析，初步将菌株WX⑶D105鉴定为芽胞杆菌Bacillus sp. 〇
[0009] 本发明的芽胞杆菌(Bacillus sp.)WXCDD105对番茄灰霉病菌和叶霉病菌菌丝生 长抑制作用明显，对灰霉病菌及叶霉病菌菌丝生长量的抑制率分别为98.2%、95.7%。 [0010] 本发明的芽胞杆菌(Bacillus sp.)WXCDD105对番茄灰霉病和叶霉病的温室盆栽 效果表明，先接种生防细菌后接种病原菌的防治效果灰霉病可达60.61%，叶霉病可达 65.58% ;先接种病原菌后接种生防菌的防治效果灰霉病可达47.88 %，叶霉病可达 54.17%〇
[0011]本发明的芽胞杆菌(Bacillus sp.)WXCDD105能够有效地抑制黄瓜枯萎病菌、甜瓜 枯萎病菌、玉米茎基腐病菌、尖孢镰刀菌、西瓜枯萎病菌、水稻立枯病菌、刺五加根腐病菌、 番茄枯萎病菌、黄瓜褐斑病菌、草莓灰霉病菌、黄瓜炭疽病菌、番茄斑枯病菌、玉米大斑病 菌、葵花菌核病菌、链格孢等病原真菌的生长，多数病原菌抑菌效果达85%以上，抑菌谱较 广，抑菌作用较强并具有溶菌作用，持效期较长。
[0012] 本发明的芽胞杆菌(Bacillus sp.)WXCDD105菌悬液对番茄种子胚根的生长具有 促进作用。不同浓度的菌悬液及不同处理时间对番茄种子胚根生长量的影响最高为CK的 3.35倍，最低为CK的2倍，其中在稀释10倍菌悬液中浸泡3h时，胚根最长。稀释10倍的菌悬液 对幼苗生长有明显的促生作用。处理组增加了番茄幼苗的平均鲜重和干重，番茄幼苗的平 均株高、茎粗、根长与对照相比分别增加了 25.33%、17.5%、10.7%。
[0013] 本发明的枯草芽胞杆菌芽胞杆菌(Bacillus sp.)WXCDD105具有改善果实品质的 作用。经生防细菌处理的番茄果实腐烂率约为30%，而CK对照组的腐烂率达56%，生防细菌 具有较好的贮藏防腐作用。由生防细菌处理过的番茄果实失重率明显低于对照组。贮藏第 15d，WXCDD105、CKX和CK对照组的的硬度分别比第0d下降了 18.5 %、28.6 %和42.9 %，生防 细菌处理的果实相对于对照组硬度较高。贮藏结束时可溶性固形物、可滴定酸含量没有显 著差别。
[0014] 本发明的芽胞杆菌(Bacillus sp.)WXCDD105能够在30°C培养箱中进行干燥培养 长达90天。不同人工模拟的干旱处理条件下，菌数变化幅度不大，相比之下对照菌株在不同 人工模拟干旱条件下菌数变化明显。经过10-180min不同时间段紫外线照射处理过的细菌 液放置LB培养基上培养48h，均可正常生长。180min紫外照射的处理组与对照组相比，菌数 几乎不变，抑菌活性也几乎保持一致。
[0015] 本发明的芽胞杆菌(Bacillus sp.)WXCDD105能够产生噬铁素、蛋白酶等多种抗菌 物质。
[0016] 本发明的芽胞杆菌WX⑶D105具有如下优点：
[0017] 1、与普通的生防菌株相比，具有优良的特性，皿内平均仿效均能达到95%以上，并 通过盆栽试验验证了生防细菌对番茄灰霉病和叶霉病的防治效果。
[0018] 2、对番茄灰霉病和叶霉病的防治效果较强，并且能够抑制多种农作物枯萎病菌、 玉米茎基腐病菌、水稻立枯病菌、刺五加根腐病菌、黄瓜褐斑病菌、黄瓜炭疽病菌、玉米大斑 病菌、番茄斑枯病菌、葵花菌核病菌、草莓灰霉病菌、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、链格孢等真 菌病害，并且对其中的多种病害具有溶菌作用，抑菌谱较广，持效性较强。
[0019] 3、对番茄种子和幼苗具有促生长作用，还能改善果实品质，降低腐烂率。
[0020] 4、具有耐紫外耐干旱的特性，并且制备方法简单，成本低廉，是一株性能优良的生 防菌株，具有良好的开发应用前景。
[0021] 保藏信息：
[0022] 分类命名：芽胞杆菌(Bacillus sp·);
[0023] 保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);
[0024] 保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
[0025] 保藏日期：2016年5月25日；
[0026] 保藏编号：CGMCC No.12496。
【附图说明】
[0027]图1为菌株WX⑶D105的筛选结果，a为对番茄灰霉病的抑制作用，b为对番茄叶霉病 的抑制作用；
[0028] 图2为菌株WX⑶D105的菌落形态；
[0029] 图3为菌株WX⑶D105的发育树；
[0030] 图4为生防细菌对灰霉病菌菌丝生长量的抑制作用；
[0031 ]图5为生防细菌对叶霉病菌菌丝生长量的抑制作用；
[0032]图6为不同浓度的WX⑶D105菌悬液及不同处理时间对番茄种子胚根生长量的影 响，其中CK、0-5分别表示水、原菌液、稀释10倍菌悬液、稀释102菌悬液、稀释103菌悬液、稀释 1〇4菌悬液、稀释1〇5菌悬液；
[0033]图7为生防细菌对番茄果实腐烂率的影响；
[0034]图8为生防细菌处理对番茄果实失重率的影响；
[0035] 图9为生防细菌对番茄果实贮藏品质的影响；
[0036] 图10为生防细菌的耐旱性测定；
[0037] 图11为耐旱性菌数测定(原菌液稀释107);
[0038]图12为耐旱性抑菌活性测定；
[0039]图13为抑菌物质的检测；
[0040]图14为WXCDD105的抑菌效果图，其中a-p分别表示草莓灰霉病、黄瓜褐斑病玉米茎 基腐病、葵花菌核病、水稻立枯病、刺五加根腐病、链格孢、番茄斑枯病、黄瓜炭疽病、玉米大 斑病、轮枝镰刀菌、尖孢镰刀菌、西瓜枯萎病、番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、甜瓜枯萎病；
[0041 ]图15为WX⑶D105菌悬液的抑菌效果图，其中a-h分别表示西瓜枯萎病、尖孢镰刀 菌、番茄斑枯病、番茄枯萎病、葵花菌核病、水稻立枯病、轮枝镰刀菌、玉米茎基腐。
【具体实施方式】
[0042]下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本 发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖 在本发明的保护范围中。
[0043]本发明提供的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌为芽胞杆菌(Bacillus sp.)WX⑶D105， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年5月25日，保藏编号为CGMCC No. 12496。
[0044] -、生防细菌的筛选鉴定
[0045] 采用载玻片点样稀释法、平板划线分离法从植物的根际土中分离纯化得到 WXCDD105菌株，再以番茄灰霉病和叶霉病为指示菌，采用双层纸环法进行筛选，即可获得生 防菌株，见图1。
[0046]对菌株进行形态、培养特性和生理生化特性鉴定，具体步骤如下：将生防菌 WXCDD105分别在平板上划线，于30°C恒温培养48h观察单菌落特征。在显微镜下观察营养体 和芽胞的形状、大小和生长情况，见图2。从葡萄糖氧化发酵试验、淀粉水解试验、接触酶试 验、好氧或厌氧性试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、柠檬酸盐利用试验、甲基红反应试 验、V. P.试验鉴定菌株WX⑶D105的生理生化特性。
[0047]对菌株进行鉴定：取lmL菌液离心收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒 (TIANGEN BIOTECH)提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用通用引物进行16SrDNA进行 PCR扩增，16SrDNA PCR扩增产物鉴定，利用胶回收试剂盒将含目的DNA的琼脂糖凝胶进行胶 回收，将PCR回收后产物交由华大科技进行测序，把测序得到的16SrDNA基因序列在NCBI数 据库中用Blast进行分析，并与已报道的序列进行同源性比对。由构建出的系统发育树（图 3)可看出，与其在同一个分支上的几种菌株均属于芽孢杆菌，其中与Bacillus subtil is subsp · inaquosorum(AMXN01000021)和Bacllus tequilensis(AYT001000043)相似性均为 99.93%。通过形态观察、生理生化特性鉴定和16SrDNA序列分析，初步将WX⑶D105菌株鉴定 为芽胞杆菌Bacillus sp·。
[0048]二、生防细菌对番茄灰霉病菌和叶霉病菌菌丝生长的抑制作用
[0049] 按照2% (V/V)接种量将WX⑶D105生防细菌接入于50mL PDA液体培养液中，分别接 种一块直径7mm的灰霉病菌和叶霉病菌，对照组不接病菌，28 °C、120r/min培养7d，用纱布过 滤收集菌丝，烘干称重，每个处理3次重复。结果表明：生防菌WX⑶D105对番茄灰霉病菌和叶 霉病菌菌丝生长均有显著抑制作用，对灰霉病菌及叶霉病菌菌丝生长量的抑制率分别为 98.2%、95.7%，见表1及图4、图5。
[0050] 三、生防细菌对番茄灰霉病和叶霉病的温室防效测定
[0051] 番茄品种为东农713,用清水浸泡后催芽，将催芽的番茄种子播种在花盆中，每盆5 粒，每个处理5盆。分别喷洒新培养的灰霉病菌和叶霉病菌制成的孢子悬液于番茄叶片上。 先接生防菌后接病原菌处理组:将生防菌液500倍稀释液喷施番茄叶片，Id后再分别喷洒灰 霉病菌和叶霉病菌孢子。先接病原菌后接生防菌处理组:喷施病原菌Id后再喷洒生防菌500 倍稀释液。各处理接种后，25°C保湿培养，在接种后15d观察发病情况。依照下列标准调查叶 片受害级别，按公式(1)、（2)计算病情指数和防治效果。分级方法如下：
[0052] 〇级:无病斑；
[0053] 1级:病斑面积占整个叶面积5%以下；
[0054] 3级:病斑面积占整个叶面积6%_10% ;
[0055] 5级:病斑面积占整个叶面积11 %_20% ;
[0056] 7级:病斑面积占整个叶面积21 %_40% ;
[0057] 9级:病斑面积占整个叶面积40%以上。
[0058]
[0059]
[0060] 结果表明：先接种生防细菌后接种病原菌的防治效果灰霉病可达60.61 %，叶霉病 可达65.58 %。先接种病原菌后接种生防菌的防治效果灰霉病可达47.88,叶霉病可达 54.17%，见表2、表3。先接种生防细菌后接种病原菌的防治效果高于先接种病原菌后接种 生防囷。
[0061] 四、生防细菌的抑菌谱测定
[0062] 采用菌丝生长速率方法测定四种生防菌对16种植物病原真菌的抑菌活性，实验组 取100yL菌液涂布于PDA平板上，对照组取100yL无菌水涂布于TOA平板上，在平板中心接种 病原菌块(直径8mm)，每个病菌3次重复，28°C培养7d，测定菌落直径，计算抑菌率。抑菌率= (对照组病菌菌落净生长量一实验组病菌菌落净生长量）/对照组病菌菌落净生长量X 100%;菌落净生长量=培养7d后菌落生长直径-原菌饼直径。结果表明该菌株对16种病原 真菌均具有很好的抑制效果，对多数病菌均能达到85%以上，说明该菌株抑菌谱广，见表4、 图14〇
[0063]五、生防细菌抑菌作用的测定
[0064] 采用平板对峙培养法测定抑菌作用，取直径8_的病原菌饼置于平板中间，在菌饼 两侧相等距离的位置(2cm)放置两层空心滤纸环，实验组滴加50yL WXCDD105的原菌液，对 照组为无菌水，每个病菌3次重复，28°C培养，分别于对峙培养7d(此时对照组均长满板)和 30d后测定病原菌菌落直径（即两滤纸环直线距离内的病原菌直径），计算两者差值，即溶菌 距离。溶菌距离=对峙培养7 d的病原菌直径-对峙培养3 0 d的病原菌直径。结果表明 WXCDD105菌株的抑菌作用较强，对多种病害具有溶菌作用。说明该菌株具有良好的生防特 效，持效性强，见表5、图15。
[0065] 六、生防细菌对番茄种子的促生试验
[0066] 番茄种子消毒处理后，在装有10ml未稀释菌悬液、稀释10倍菌悬液、稀释102倍菌 悬液、稀释1〇3倍菌悬液、稀释1〇4倍菌悬液、稀释1〇5倍菌悬液和无菌水的试管中，分别放入 250粒番茄种子，在上述不同浓度下浸泡3h、10h、24h后取出，将每个处理组的番茄种子整齐 摆在铺有滤纸的无菌培养皿中，每个培养皿随机放入25粒番茄种子，然后分别加入3ml无菌 水，置于28°C培养箱中培养，定时定量补充无菌水。每个处理组三次重复，记录发芽番茄种 子的胚根长。由对番茄种子的促生试验结果得出的，用稀释10倍的菌悬液将种子浸泡3h时 具有较好的促生作用。用稀释10倍的WX⑶D105菌悬液和无菌水浸泡番茄种子3h，然后播种 于无菌土花盆中，每盆播种15粒，每处理重复3次。播种后30d分别测定其株高、茎粗、根长及 植株的鲜干重、干重，植株干重于80°C烘干后称量。
[0067]结果表明：生防细菌WX⑶D105菌悬液对番茄种子生长具有促进作用。不同浓度的 WXCDD105菌悬液及不同处理时间对番茄种子胚根生长量的影响最高为CK的3.35倍，最低为 C K的2倍，其中在稀释10倍菌悬液中浸泡3 h时，胚根最长。对番茄幼苗的促生作用中， WXCDD105菌株处理组增加了番茄幼苗的平均鲜重和干重，番茄幼苗的平均株高、茎粗、根长 与对照相比分别增加了25.33%、17.5%、10.7%，见图6和表6。
[0068]七、生防细菌对采后番茄果实生理品质的影响测定
[0069]挑选新鲜饱满、色泽鲜艳、大小成熟度一致、无机械损伤和病害的市售小番茄果实 用于试验，将果实用无菌水清洗后晾干，并进行标号称重，再分别放入浓度为1 X 108cfu/mL 的WX⑶D105细菌菌悬液中浸泡4min，取出后自然晾干，放入保鲜袋中并于室温下贮藏，以 15d为贮藏周期，每隔3d对番茄果实的腐烂情况进行观察，并称重计算番茄果实的失重率。 贮藏期结束时取样对果实的硬度、可溶性固形物、可滴定酸含量进行测定。试验以无菌水浸 泡为阴性对照、本实验室保存的生防细菌X作为阳性对照，每组果实30个，试验重复三次。
[0070] 番茄果实腐烂率调查:腐烂率的调查按公式(3)进行计算：
[0071]
[0072] 失重率:番茄果实失重率按照公式(4)进行计算：
[0073]
[0074] 使度：取畨茄采买最大夏牷处的位置削去采皮，开用调零后的GY-4果实硬度计缓 慢插入果肉，记录读数。
[0075] 可溶性固形物:将手持折光仪用去离子水调零，将番茄果实打浆后取10g用纱布过 滤挤出汁液2-3滴于折光平面，记录读数。
[0076] 可滴定酸含量:称取10g番茄果实置于研钵中，研磨后转移到100mL容量瓶中，再将 冲洗研钵的蒸馏水，一并转入容量瓶中，再用蒸馏水定容至刻度线，摇匀。静止30min后过 滤。吸取20mL滤液转入三角瓶中，加入2-3滴酸酞溶液，用标定好的NaOH溶液进行滴定，至溶 液初显粉色，，并在30s内不褪色为滴定终点，记录NaOH溶液的用量。试验以蒸馏水为空白滴 定，重复二次。
[0077]计算公式：
[0078]
[0079] 式中：Vc-样品提取液总体积，mL;
[0080] Vs-滴定时所取滤液的体积，mL;
[0081 ] c 一 NaOH 滴定液的浓度，mol/L;
[0082] V!-滴定滤液消耗的NaOH溶液体积，mL;
[0083] Vo-滴定蒸馏水时所消耗NaOH溶液的体积，mL;
[0084] m-样品质量，g;
[0085] f-折算系数，g/mmol(番前果实的折算系数按苹果酸进行计算，即0.067)。
[0086]结果表明：生防菌WX⑶D105对番茄果实营养品质没有产生不良的影响。经生防细 菌处理的番茄果实腐烂率约为30%，而CK对照组的腐烂率达56%，生防细菌具有较好的贮 藏防腐作用，见图7。由生防细菌处理过的番茄果实失重率明显低于对照组，见图8。贮藏第 15d，WXCDD105、X和CK对照组的硬度分别比第0d下降了 18.5%、28.6%和42.9%，生防细菌 处理的果实相对于对照组硬度较高。贮藏结束时可溶性固形物、可滴定酸含量没有显著差 另IJ，见图9。
[0087] 八、生防细菌耐干旱和耐紫外的研究
[0088] 耐干旱：取WXCDD105单菌落转接于10mL LB液体培养基中，30°C，180r/min震荡培 养24h，将培养液分别稀释ΠΓ1，然后取50yL稀释菌液至已灭好的试管中，用棉花塞塞好。放 置30 °C培养箱中培养，每个隔10天检测一次菌落是否有存活。重复3次。结果表明:WXCDD105 菌株干旱培养90天依然有存活，见表7。
[0089] 利用聚乙二醇6000(PEG6000)人工模拟干旱条件。将适量的PEG加入LB液体培养基 中，使最终浓度(w/v)分别为0%、5%、10%、15%、20%、25%和30%，分装于试管中，每管 1〇1111，用脱脂棉塞封口。按照2%的接种量接种供试菌株后，至于37°(：，20(^/1^11的摇床震荡 培养48h测定活菌数并测定0D_。重复3次。结果表明：在不同的人工模拟干旱条件下菌数没 有太大差别。但对照组菌株不同处理条件下差别明显。说明WXCDD105菌株具有耐干旱的特 性。见图10。
[0090] 耐紫外照射:取WXCDD105种子液2%接种于10mL LB液体培养基中，30°C，180r/min 震荡培养24h，将培养液分别稀释ΚΓ1，然后取50yL稀释菌液至已灭好的载玻片上(每株菌准 备18块载玻片），用涂布棒将菌液摊开，吹干后开始紫外照射，隔lOmin加50yL无菌水至载玻 片上，搅匀，用移液器取l〇yL至已倒好LB的平板上，再隔lOmin换下一个载玻片操作同上，直 至180min。重复三次。结果表明：经过10-180min不同时间段紫外线照射处理过的细菌液放 置LB培养基上培养48h，均可正常生长，见表8。
[0091] 取1乂0)0105种子液2%接种于1〇11^1^液体培养基中，30°(：，18(^/111丨11震荡培养 24h，将培养液放置在紫外灯下照射180min后采用平板稀释法测定计算活菌数，并以黄瓜枯 萎病为指示菌，采用平板对峙法测定抑菌活性。以在自然光下，其他培养条件均相同的培养 液做对照。重复3次，结果表明：紫外照射处理组菌浓度为1.35 X 101()Cfu/mL，对照组菌浓度 为1.47 X 101()Cfu/mL，处理组和对照组菌数几乎不变;处理组抑菌距离为4.62mm，对照组抑 菌距离为4.36mm，抑菌活性前后也几乎一致，见表9和图11、12。
[0092]九、抑菌物质的检测：
[0093]蛋白酶检测：将菌株接种在蛋白酶检测培养基平板上（脱脂奶粉1 %，牛肉膏 〇. 3 %，蛋白胨1 %，氯化钠0.5 % )，10 °C培养3d_7d，观察有无酶解圈。
[0094]噬铁素检测：将菌株接种CAS-平板(噬铁素检测培养基:A液:a、60.5mg CAS(酪天 青S)溶于50mL去离子水;b、10mL三价铁溶液;c、72.9mg HDTMA溶于40mL去离子水。上述a、b、 c三个溶液混合定容至100mL，pH 7 · 0 A: lOOOmL ΝΑ培养基，用12g50 % (W/V)的NaOH溶液将 培养基pH调至6.8。使用时，A液和B液混合。），10 °C培养3-7d，观察有无酶解圈。结果表明： WX⑶D105菌株产生蛋白酶及噬铁素。见图13。
[0095]表1生防细菌对菌丝生长量的抑制作用
[0096]
[0097] 表2生防细菌对番茄灰霉病温室防效
[0098]
[0099] 表3生防菌对番茄叶霉病温室防效
[0100]
[0101] 表4 WXCDD105的抑菌谱(8.4X108cfu/mL)
[0102]
[0103]
[0104] 注:纯生长量=菌落平均直径-菌饼直径
[0105] 抑制率（％) = (对照组菌落纯生长量-实验组菌落纯生长量)/对照组纯生长量X 100%
[0106] 表5 WX⑶D105的抑菌作用
[0107]
[0108]
[0109] 注:原菌饼直径8mm
[0110] 表6生防细菌对番茄幼苗的促生作用
[0111]
[0112] 表7菌株WX⑶D105耐干旱研究结果
[0113]
[0114] 注："+"表示有细菌生长；表示无细菌生长
[0115] 表8菌株WX⑶D105耐紫外研究结果
[0116]
[0117] 注："+"表示有细菌生长；表示无细菌生长
[0118] 表9菌株WX⑶D105耐紫外计数结果
[0119]
【主权项】
1. 一株防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌，其分类命名为芽胞杆 菌(Bacillus sp·)，保藏编号为CGMCC No. 12496。2. 如权利要求1所述的防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌用于防 治番茄灰霉病菌和叶霉病菌。3. 如权利要求1所述的防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌用于抑 制病原真菌的生长。4. 如权利要求3所述的防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌用于抑 制病原真菌的生长，其特征在于所述病原真菌为黄瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、玉米茎基腐 病菌、尖孢镰刀菌、西瓜枯萎病菌、水稻立枯病菌、刺五加根腐病菌、番茄枯萎病菌、黄瓜褐 斑病菌、草莓灰霉病菌、黄瓜炭疽病菌、番茄斑枯病菌、玉米大斑病菌、葵花菌核病菌或链格 孢。5. 如权利要求1所述的防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌用于促 进番前种子胚根生长。6. 如权利要求1所述的防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌用于促 进番茄幼苗生长。7. 如权利要求1所述的防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌用于改 善番茄果实品质。8. 如权利要求1所述的防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌用于耐 干旱和耐紫外。
【文档编号】A01P21/00GK105838656SQ201610423582
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】王傲雪, 石玉莹, 陈秀玲, 王窦逗, 奚启新, 王迎春
【申请人】东北农业大学