干海参线粒体的提取与纯化技术的制作方法
【专利摘要】一种干海参线粒体的提取与纯化技术，其制备方法是：以干海参为原料，采用优化后的溴化十六烷基三甲基铵法提取其线粒体，通过A260/A280值、琼脂糖凝胶电泳和PCR检测，对所得线粒溶液进行定量，定性分析和综合比较，为干海参的分子生物学研究提供了一套迅速、经济和可靠的技术方案。
【专利说明】
干海参线粒体的提取与纯化技术
技术领域
[0001]本发明涉及的是一种干海参线粒体的提取与纯化技术。
【背景技术】
[0002]海参属于棘皮动物门。海参不仅是海产之美味佳肴，而且是名贵的滋补中药材。在《本草纲目》、《中国药用动物志》等药学著作上均有记载。临床用于肾虚阳萎、便秘、贫血、胃溃疡、糖尿病、肿瘤等疾病的防治。近年来，海参的开发研究日益受到重视。从组织细胞中成功地提取DNA，是进行一切有关分子遗传学和分子生物学研究的前提。虽然文献中已所道了许多动植物DNA提取的方法。但是研究中我们仍需要根据材料的不同情况进行DNA提取方法的改进及筛选比较。最近，我们在对干海参进行分子标志的研究时发现，由于干海参已被加工处理过，且富含多肽、海参酸性粘多糖、海参甙、硫酸软骨素、胶原蛋白等多种物质。使得DNA埋在这种黏稠胶状物通过反复试验，我们探索出一种迅速、简便、经济的分离纯化干海参线粒体的方法，应用该法可有效去除干海参中的各种杂质，得到高纯度、高得率的总DNA。可进行PCR扩增，为干海参的进一步研究奠定技术基础。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种干海参线粒体的提取与纯化技术。
[0004]本发明的目的是这样实现的:取实验材料为仿刺参和大西洋海参的干参制品，以少煮多泡的原则浸发开，立即使用或置于-80°C超低温冰箱保存备用；线粒体提取纯化方法:(I)称取0.3g海参体壁，冲洗干净，用无菌纸吸干，切碎或置液氮研碎；(2)将样品放于600μ1Γ的蛋白酶水解液中；(3)样品迅速置于65°C水溶2h以上，若溶解不完全，则可过夜处理，直至样品完全溶解；(4)冷却至室温后，加入等体积的氯仿一异戊醇轻柔颠倒；(5)室温10000r/min，离心1min,收集上清液；(6)重复以上两个步骤几次，至有机相和水相之间无变性蛋白质；(7)取上清液加入等体积的沉淀缓冲液，保温于65°C，30min;(8)以氯仿一异戊醇抽提几次，至有机相和水相之间无杂质；(9)收集上清液，加等体积的异丙醇轻柔颠倒，13000r/min。可得到白色沉淀；(10)沉淀用70%的乙醇清洗两次，空气干燥后，用ΙΟΟμΙΤΕ缓冲液溶解，4°C保存备用。
【具体实施方式】
[0005]取实验材料为仿刺参和大西洋海参的干参制品，以少煮多泡的原则浸发开，立即使用或置于-80°C超低温冰箱保存备用；
线粒体提取纯化方法:
(1)称取0.3g海参体壁，冲洗干净，用无菌纸吸干，切碎或置液氮研碎；
(2)将样品放于600μ?Γ的蛋白酶水解液中；
(3)样品迅速置于65°C水溶2h以上，若溶解不完全，则可过夜处理，直至样品完全溶解；(4)冷却至室温后，加入等体积的氯仿一异戊醇轻柔颠倒；
(5)室温10000r/min，离心1min,收集上清液；
(6)重复以上两个步骤几次，至有机相和水相之间无变性蛋白质；
(7)取上清液加入等体积的沉淀缓冲液，保温于65°C，30min;
(8)以氯仿一异戊醇抽提几次，至有机相和水相之间无杂质；
(9)收集上清液，加等体积的异丙醇轻柔颠倒，13000r/min。可得到白色沉淀；
(10)沉淀用70%的乙醇清洗两次，空气干燥后，用ΙΟΟμΙΤΕ缓冲液溶解，4°C保存备用。
【主权项】
1.一种干海参线粒体的提取与纯化技术，其制备方法如下:取实验材料为仿刺参和大西洋海参的干参制品，以少煮多泡的原则浸发开，立即使用或置于-80°C超低温冰箱保存备用；线粒体提取纯化方法:(I)称取0.3g海参体壁，冲洗干净，用无菌纸吸干，切碎或置液氮研碎；(2)将样品放于600μ1Γ的蛋白酶水解液中；(3)样品迅速置于65°C水溶2h以上，若溶解不完全，则可过夜处理，直至样品完全溶解；(4)冷却至室温后，加入等体积的氯仿一异戊醇轻柔颠倒；(5)室温10000r/min，离心1min,收集上清液；(6)重复以上两个步骤几次，至有机相和水相之间无变性蛋白质；(7)取上清液加入等体积的沉淀缓冲液，保温于65°C，30min ;(8)以氯仿一异戊醇抽提几次，至有机相和水相之间无杂质；(9)收集上清液，加等体积的异丙醇轻柔颠倒，13000r/min ;可得到白色沉淀；(10)沉淀用70%的乙醇清洗两次，空气干燥后，用ΙΟΟμΙΤΕ缓冲液溶解，4°C保存备用。
【文档编号】C12N5/07GK105838660SQ201510014649
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月13日
【发明人】王跃进
【申请人】郑州国手生物科技有限公司