一种分泌cpiv3抗体的杂交瘤细胞株及elisa试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学领域，涉及一种分泌CPIV3抗体的杂交瘤细胞株及ELISA试剂盒。本发明使用的山羊副流感病毒3型CPIV3 免疫原是从临床分离的CPIV3 JS2013毒株，从建立的分泌 CPIV3 单克隆抗体的杂交瘤细胞库中筛选出一株杂交瘤细胞 2E6。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有阻断作用，应用于CPIV3 阻断ELISA试剂盒。本发明的CPIV3 阻断ELISA试剂盒可特异性检测CPIV3 感染或者免疫山羊后产生的抗体。收集212份山羊临床血清样品，分别用上述建立的阻断ELISA方法和中和实验检测血清中CPIV3抗体。阻断ELISA结果与中和实验相比，符合率为98.8%。CCTCC NO ：C20162720160201
【专利说明】
一种分泌CP IV3抗体的杂交瘤细胞株及EL ISA试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及一种分泌CPIV3抗体的杂交瘤细胞株及ELISA试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 副流感病毒3型(Parainfluenza virus type 3，PIV3)属于副黏病毒科呼吸道病 毒属，是有囊膜的单股负链RNA病毒，该属病毒包括人副流感病毒1型和3型(HPIV1，HPIV3)， 牛副流感病毒3型(BPIV3)等。该属成员是引起人和动物呼吸道疾病的重要病原。本实验室 于2013年底首次报道从江苏等地发生呼吸道疾病羊群中发现新型PIV3,遗传进化分析明显 不同于HPIV3及BPIV3,将其命名为山羊副流感病毒3型(CPIV3)。流行病学调查表明CPIV3在 羊群较为普遍，造成发病引起较大损失。
[0003] PIV3有6种结构蛋白，分别为1?^、圆和1^，其中圆蛋白和?蛋白是？1￥3的主要保 护性抗原。HPIV3HN蛋白对病毒吸附宿主细胞表面起辅助作用，与宿主细胞表面的唾液酸受 体亲和性较高，通过与分布在宿主细胞表面的唾液酸受体结合，把病毒牢牢结合在宿主细 胞表面。HPIV3HN蛋白表面存在至少6个抗原表位，有3个中和性抗原表位。HN蛋白作为PIV3 的一种中和抗原，具有很高的种属特异性，与其他副黏病毒科成员的基因组进行比较，发现 它们之间的同源性很小或者根本没有同源性。
[0004] 自从Kohler和Milstein 1975年建立了单克隆抗体技术以来，单克隆抗体作为检 测以及治疗动物疫病的一种工具，使疫病防制技术发生了一次革新。单克隆抗体较以往的 多克隆抗体有如下的优点：（1)针对的抗原表位是单一且特异的；（2)可以被无限量的生产。 单克隆抗体在动物疫病诊断中，可以更加容易识别和鉴定病原的特性。利用单克隆抗体建 立的阻断ELISA检测方法，在动物传染病的监测和预防方面发挥着越来越重要的作用。目前 国内外尚无针对山羊副流感病毒（CPIV3)抗体的高通量检测方法，本发明旨在建立检测 CPIV3抗体的阻断ELISA检测试剂盒，为临床检测和相关研究奠定基础。
【发明内容】
[0005] 技术问题
[0006] 本发明的目的是提供一种分泌具有阻断作用的CPIV3单克隆抗体的杂交瘤细胞 株。杂交瘤细胞株的建立是用分离纯化的CPIV3JS2013株为抗原，免疫BALB/c小鼠，利用淋 巴细胞杂交瘤技术建立分泌CPIV3特异单克隆抗体的杂交瘤细胞库，通过筛选而获得。利用 筛选的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，建立一种灵敏、高通量的检测CPIV3抗体的阻断 ELISA试剂盒。
[0007] 技术方案
[0008] 本发明的目的通过如下技术方案实现：
[0009] 一种分泌CPIV3单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株2E6于2016年2月1日保 藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201627， 分类命名杂交瘤细胞株2E6。
[0010] 用所述杂交瘤细胞株2E6制备的单克隆抗体，所述单克隆抗体制备方法为，将杂交 瘤细胞2E6株注射到BALB/c小鼠腹腔，制备单克隆抗体腹水，离心并收集上清液，灭活补 体，过滤除菌，稀释，分装，-70 °C低温冻存。
[0011] 用所述杂交瘤细胞2E6株制备的CPIV3单克隆抗体。所述的单克隆抗体可在CPIV3 阻断ELISA试剂盒中得到应用。
[0012] 所述CPIV3阻断ELISA试剂盒可特异性检测CPIV3感染和免疫后产生的抗体，该试 剂盒系将超离浓缩的CPIV3 (JS2013)病毒包被的酶标板，单克隆抗体2E6，标准阴、阳性对照 血清，酶标二抗，底物及终止液组合成。
[0013] 有益效果：
[0014] CPIV3是国内新发现的病毒，感染山羊后引起呼吸道症状，目前国内外没有相关的 ELISA检测方法。
[0015] 1.本发明使用的CPIV3免疫原是从临床分离的CPIV3 JS2013毒株，从建立的分泌 CPIV3单克隆抗体的杂交瘤细胞库中筛选出一株杂交瘤细胞2E6。
[0016] 2.本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有阻断作用，应用于CPIV3阻断 ELISA试剂盒。
[0017] 3.本发明的CPIV3阻断ELISA试剂盒可特异性检测CPIV3感染或者免疫山羊后产生 的抗体。收集212份山羊临床血清样品，分别用上述建立的阻断ELISA方法和中和实验检测 血清中CPIV3抗体。阻断ELISA结果与中和实验相比，符合率为98.8%。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0019] -、单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
[0020] 1.抗原的制备：将CPIV3病毒（JS2013) (Yang L,Li W,Mao L，et al .Analysis on the complete genome of anovel caprine parainfluenza virus 3. Infect Genet Evol. 2016,38:29-34.)感染MDBK细胞，接毒4d待细胞出现病变后收获病毒，10，000rpm离心 30min，去细胞碎片;上清经40，000g超速离心2h，弃上清，沉淀用适量PBS过夜溶解。
[0021] 2.免疫Balb/c小鼠：将超离病毒皮下多点注射免疫Balb/c小鼠 ，一共免疫3次，每 次免疫间隔2周，首免使用100ul超离病毒与等量完全弗氏佐剂混合免疫，后两次均使用100 ul超离病毒与等量的不完全弗氏佐剂混合免疫;第三次免疫2周后采血，检测小鼠的免疫血 清效价，选取效价>106的小鼠，细胞融合前4d加强免疫一次，100ul超离病毒腹腔注射。 [0022] 3.细胞融合:细胞融合采取PEG细胞融合方法。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫 的Balb/c小鼠脾脏细胞按1: 5的比例充分混匀，2000rpm 25°C离心5min，弃上清，再加入适 量的无血清RPMI-1640培养基重悬，2000rpm 25°C离心5min以清洗细胞，弃上清，轻击管底， 使细胞松散均匀，置37°C水浴预热，lmin中加入0.8ml提前在37°C水浴中预热的PEG2000,边 加边振荡。加完后继续振荡lmin，然后在5min内按照l、2、3、3、3ml/min分别加入12ml预热至 37 °C的无血清RPMI-1640培养基，37 °C静置10min，2000rpm25°C离心5min，弃上清，加入含 15%FBS和HAT的RPMI-1640培养基重悬，分装到已铺有饲养细胞的96孔板中，于5%C02培养 箱培养。期间观察孔中细胞情况，待融合7d后，细胞生长至96孔板孔底面积1/10~1/5时，取 上清进行抗体检测。
[0023] 4.杂交瘤细胞的筛选：以0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液为包被液，以400倍稀释 的超离病毒为包被抗原包被酶标板，l〇〇ul/孔，4°C过夜。PBST洗涤3次，拍干;将融合细胞上 清，1:1000稀释的Balb/c免疫小鼠阳性血清以及1:1000稀释的小鼠阴性血清加入相应的孔 内，100ul/孔，37 °C作用lh，PBST洗涤3次，拍干;加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP) 标记的羊抗鼠 IgG，100ul/孔，37°C孵育lh，PBST洗涤3次，拍干。加入底物TMB，100ul/孔，室 温避光显色lOmin;每孔加入50ul 2mol/L硫酸终止反应。酶标仪测定酶标板OD45〇nm值，P为各 检测孔的0D··值，N为阴性血清的0D··值，当阴性血清OD450·值< 0 · 1且阳性血清0D··值 与阴性血清〇D45Qnm的比值2 2.1，即阴、阳性对照均成立的前提下，以P/N 2 2.1判定为阳性孔 的判定标准判定检测孔的阴阳性。隔2d后再检测一次，选择两次检测结果均为阳性的杂交 瘤细胞株进行亚克隆。
[0024] 5.杂交瘤细胞的克隆化:将筛选出的阳性孔细胞株用台盼蓝染色，计数，用含15 % FBS的RPMI-1640培养基稀释成100个细胞/10mL培养基，将稀释后的细胞悬液加入提前铺有 饲养细胞的96孔板，每孔100uL，置37°C，5 %C02培养箱中培养，期间观察细胞株，待生长至 96孔板孔底面积1/10~1/5时，按照之前建立的间接ELISA方法及时进行ELISA检测。记录单 克隆细胞的阳性孔，并进行同样的亚克隆3次以上，直至克隆后所有的克隆细胞株上清检测 均为阳性且各孔检测的〇D45Qnm值较接近。将克隆化的CPIV3特异单克隆抗体杂交瘤细胞株进 行扩大培养，冻存。
[0025] 7 .腹水的制备:将灭菌的液体石蜡腹腔注射10~12周龄的Balb/c小鼠（购自扬州 大学比较医学实验中心），0.3mL/只，7d后，将杂交瘤细胞株2E6注射入小鼠腹腔，每只0.2mL (2X106~3X106个杂交瘤细胞）。7~10d后收取腹部明显鼓起的小鼠的腹水，3000rpm离心 20min，收集上清，分装，标记并保存至-20 °C备用。
[0026] 二、阻断ELISA试剂盒的建立
[0027] 1.通过优化抗原包被浓度，待检血清稀释度，单克隆抗体2E6和羊抗鼠 IgG二抗(北 京全式金生物技术有限公司）的工作浓度，以及待检血清、单克隆抗体2E6、HRP-羊抗鼠 IgG (武汉博士德)和底物TMB的作用时间，最终完成CPIV3特异性单克隆抗体2E6的阻断ELISA检 测方法的建立和试剂盒的组装。
[0028] 2.抗原包被浓度和单克隆抗体2E6工作浓度的优化:按照矩阵法进行，以0.05mol/ L pH9.6碳酸盐缓冲液为包被液，分别以300、400、500、600、700、800倍稀释的超离全病毒作 为包被抗原，4°C过夜包被酶标板(CostarhPBST洗涤3次后加入0.5%BSA置37°C培养箱封 闭2h，PBST洗涤3次，拍干，分别加入CPIV3阳性和阴性血清，50uL/孔。37 °C作用lh，取出酶标 板，PBST洗涤3次，拍干，依次加入500、600、700、800、900、1000倍稀释的单克隆抗体2E6，每 个稀释度重复一次，取其平均值，计算各条件下的PI值，选择阴性血清〇D45Qnm值接近1、PI值 最大的反应条件作为最佳反应条件。结果如下：最佳抗原包被浓度为1:400稀释;单克隆抗 体2E6的最佳工作浓度为1:900稀释(表1)。
[0029]表1抗原包被浓度和单克隆抗体2E6工作浓度的选择
[0030]
[0032] 3.血清稀释度和作用时间的优化:按照上述的最佳包被浓度包被酶标板，PBST洗 涤3次后加入0.5 % BSA置37 °C培养箱封闭2h，PBST洗涤3次，拍干，分别加入1:1、1:2、1:4、1: 5、1:8、1:10倍稀释的CPIV3阳性和阴性血清，50uL/孔，每个稀释度重复一次，置37 °C培养 箱，分别在孵育30min、45min、60min时取出相应的酶标条，PBST洗涤3次，拍干，同时加入单 克隆抗体后继续作用。计算各条件下的PI值，取重复孔平均值，选择阴性血清〇D45Qnm值接近 1、PI值大且前两个结果相近时作用时间最短的反应条件作为最佳反应条件。结果如下:反 应条件中国血清稀释度为1:4-1:5;血清作用时间为30-45min，结果均较好(表2)。
[0033] 表2血清稀释度和作用时间的优化
[0034]
[0035] 4.单克隆抗体的作用时间优化:按照上述的条件包被酶标板，封闭，加入血清，作 用30min后，PBST洗涤3次，拍干，加入1:900倍稀释的单克隆抗体2E6,置37°C培养箱，分别在 孵育30min，45min，60min时取出相应的酶标条，PBST洗涤3次，拍干，3个时间点的酶标条同 时加入酶标二抗后继续作用。每个时间点重复一次，计算各条件下的PI值，取重复孔平均 值，选择阴性血清〇D45Qnm值接近1、PI值最大且前两个结果相近时作用时间最短的反应条件 作为最佳反应条件。结果如下:单克隆抗体2E6的最佳作用时间为30min(表3)。
[0036]表3单克隆抗体2E6的作用时间优化
[0037]
[0039] 5.酶标二抗的工作浓度优化:按照前述的最佳反应条件依次包被酶标板，封闭，加 入血清，单克隆抗体，37°C作用30min后取出酶标板，PBST洗涤3次，拍干，分别加入1:3000， 1:4000，1:5000倍稀释的酶标二抗HRP-羊抗鼠 IgG，50uL/孔，每个稀释度重复一次，计算各 条件下的PI值，取重复孔平均值，选择阴性血清〇D45Qr?值接近1、PI值最大的反应条件作为最 佳反应条件。结果如下:酶标二抗HRP-羊抗鼠 IgG的最佳工作浓度为1:4000(表4)。
[0040] 表4酶标二抗的工作浓度优化
[0041]
[0042] 6.酶标二抗的作用时间优化:按照前述最佳反应条件依次进行，加入酶标二抗后， 置37 °C培养箱，分别在孵育30min，45min，60min时取出相应的酶标条，PBST洗涤3次，拍干，3 个时间点的酶标条同时加入底物TMB后显色。每个时间点重复一次，计算各条件下的PI值， 取重复孔平均值，选择阴性血清〇D45Qnm值接近1、PI值最大且前两个结果相近时作用时间最 短的反应条件作为最佳反应条件。结果如下：酶标二抗HRP-羊抗鼠 IgG的最佳作用时间为 30min(表5)。
[0043]表5酶标二抗作用时间优化
[0044]
[0045] 7 .底物作用时间优化:按照前述最佳反应条件依次进行，加入底物TMB，50uL/孔， 室温避光作用。分别在作用5min，8min，12min时取下相应的酶标条，加入2M H2S〇4，25uL/孔 终止反应。每个时间点重复一次，计算各条件下的PI值，取重复孔平均值，选择阴性血清 0D45Qnm值接近1、PI值最大且前两个结果相近时作用时间最短的反应条件作为最佳反应条 件。结果如下:底物最佳作用时间为12min(表6)。
[0046] 表6底物作用时间优化
[0047]
[0048] 8.阻断ELISA临界值的确定：用阻断ELISA检测确定的CPIV3抗体阴性山羊血清，计 算其阻断率，经统计学分析，通过与中和实验结果进行比较，进行特异性和敏感性分析，以 PI 2 35%时判定血清样品为抗体阳性，PI < 35%时判定血清样品为抗体阴性。
[0049] 实施例：
[0050] 收集212份山羊临床血清样品，分别用上述建立的阻断ELISA方法和中和实验检测 血清中CPIV3抗体。阻断ELISA结果与中和实验相比，符合率为98.8%。
【主权项】
1. 一种分泌山羊副流感病毒3型CPIV3抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株2E6株于 2016年2月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编 号为 CCTCC NO :C201627。2. 用权利要求1所述杂交瘤细胞株2E6制备的单克隆抗体。3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其制备方法为，将杂交瘤细胞2E6株注射到BALB/ c小鼠腹腔，制备单克隆抗体腹水，离心并收集上清液，灭活补体，过滤除菌，稀释，分装，-70 °C低温冻存。4. 用权利要求1所述杂交瘤细胞株2E6制备的CPIV3阻断ELISA试剂盒。5. 用权利要求2或3所述的单克隆抗体制备的CPIV3阻断ELISA试剂盒。6. 根据权利要求4所述的CPIV3阻断ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒系将超离浓缩 的CPIV3 JS2013株包被的酶标板，单克隆抗体2E6，标准阴、阳性对照血清，酶标二抗，底物 及终止液组合成。7. 根据权利要求5所述的CPIV3阻断ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒系将超离浓缩 的CPIV3 JS2013株包被的酶标板，单克隆抗体2E6，标准阴、阳性对照血清，酶标二抗，底物 及终止液组合成。
【文档编号】G01N33/577GK105838678SQ201610222623
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】毛立, 李文良, 江杰元, 杨蕾蕾, 郝飞, 李基棕, 张纹纹, 周天赐
【申请人】江苏省农业科学院