一种快速诱导金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速诱导金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态的方法，包括如下步骤：将金黄色葡萄球菌经超声处理，使其进入活的不可培养状态，所述超声处理的条件为：处理频率为10～30kHz,处理功率为200?400W，处理时间为15～25min，处理温度为15～25℃。本发明提供的方法，是将金黄色葡萄球菌经超声处理，使其进入活的不可培养状态。本发明的实验证明，利用超声波技术处理细菌，可促使细菌在20min快速进入活的不可培养状态；本发明的方法使金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态的诱导时间大大缩短，节约了科研成本，推动了有关活的不可培养状态细菌的研究进度。
【专利说明】
一种快速诱导金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速诱导金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态(VBNC)的方法。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus )隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，是引起细菌性食物中毒的主要病原菌之一，据统计有50-75%的金黄色葡萄球菌菌株在合适的生长条件下能够产生对恶劣环境耐受性很强的肠毒素(Staphylococcusal Enterotoxin)，对人类健康威胁很大。并且研究发现，金黄色葡萄球菌会在外界不利环境的胁迫下会进入一种活的不可培养(viable but nonculturable,VBNC)状态。处于活的不可培养状态的细菌无法在常用的培养基上正常生长繁殖，能够逃避常规检测而造成假阴性的结果，但活的不可培养状态细菌仍然具有生命体征和代谢活性，在适宜的条件下可复苏再生长，重新获得感染能力，成为危害食品安全的“隐性污染源”。
[0003]开展活的不可培养状态的金黄色葡萄球菌在形态、代谢活性、蛋白表达、基因表达等生物学特性以及形成机制等方面的研究，对于食品安全检测、有效杀灭活的不可培养状态的细菌具有重要的实际意义。然而现有的研究结果表明，获得活的不可培养状态的金黄色葡萄球菌细菌需要很长的时间，目前常用的低温结合寡营养的条件通常需要一个月以上的诱导时间才能使正常的金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态，大大增加了科研成本、限制了其科研进度。例如，公开号为CN 103525736A的中国发明专利申请文献公开了两种诱导啤酒易感乳酸菌进入“活的但不可培养” (viable but non-culturable，VBNC)状态的方法，两种诱导方法分别为，一是通过O?4°C低温储藏;二是通过啤酒环境下连续传代驯化培养。
[0004]公开号为CN105200034A的中国发明专利申请公开了一种VBNC状态沙门氏菌的诱导形成方法，其包括，将沙门氏菌悬浮于液体中，混合均匀，使其菌液浓度为17?18CFU/mL，将菌液在42°C?55°C恒温条件下超声波190?570W处理5?25min，检测是否诱导沙门氏菌进入VBNC状态。但是该方法的诱导对象为革兰氏阴性菌沙门氏菌，并不适用于金黄色葡萄球菌。
[0005 ]因此，发明一种快速诱导金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态的方法对于对该状态细菌的研究起到重要的推动作用。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种快速诱导金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态的方法，解决了现有技术中诱导时间长的技术问题。
[0007]—种快速诱导金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态的方法，包括如下步骤:将金黄色葡萄球菌经超声处理，使其进入活的不可培养状态，所述超声处理的条件为:处理频率为10?30kHz，处理功率为200-400W，处理时间为15?25min，处理温度为15?25°C。
[0008]本发明提供的方法，是将金黄色葡萄球菌经超声处理，使其进入活的不可培养状态。本发明的实验证明，利用超声波技术处理细菌，可促使细菌在20min快速进入活的不可培养状态;本发明的方法使金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态的诱导时间大大缩短，节约了科研成本，推动了有关活的不可培养状态细菌的研究进度。
[0009]本发明的诱导对象是金黄色葡萄球菌，属于革兰氏阳性菌，目前的对活的不可培养状态细菌的研究大多集中在大肠杆菌、沙门氏菌等阴性菌，革兰氏阳性菌的细胞壁，是一层厚而致密的肽聚糖和磷壁酸组成，肽聚糖的肽链之间通过5个甘氨酸交联着。革兰氏阴性菌的细胞壁则是多层结构，从内到外依次是:薄薄的肽聚糖层，脂蛋白层/周质层，磷脂层和脂多糖层;革兰氏阴性菌的肽聚糖结构也和革兰氏阳性菌的有所不同，肽链是直接交联在一起的，革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的结构不同，形成VBNC状态的机理不同。目前对于阳性菌的研究还较少，诱导方法也较单一，现有的阳性菌一般仍采用传统的低温、寡营养的诱导条件，至少需要一个月的诱导时间。
[0010]优选地，所述超声处理的条件为:处理频率为15?25kHz，处理功率为200?400W，处理时间为20?25min，处理温度为20?25°C。
[0011 ] 一种优选的技术方案，所述超声处理的条件为:处理频率为20kHz，处理功率为200W，处理时间为20min，处理温度为20°C。
[0012]另一种优选的技术方案，所述超声处理的条件为:处理频率为20kHz，处理功率为400W，处理时间为20min，处理温度为20°C。
[0013]优选地:将金黄色葡萄球菌洗涤、悬浮，得到待诱导细菌悬浮液。
[0014]进一步优选地，洗涤和悬浮均采用无菌生理盐水。
[0015]更进一步优选地，所述无菌生理盐水为质量百分含量为0.85%的NaCl水溶液。
[0016]优选地，所述金黄色葡萄球菌为处于对数期的目的细菌。
[0017]上述方法中，在超声处理后，还包括以下步骤:检测经过超声诱导处理后的金黄色葡萄球菌的活菌数和可培养菌数;其中，检测经过超声诱导处理后的金黄色葡萄球菌活菌数采用pi/croA双染法，检测经过诱导处理后的金黄色葡萄球菌可培养菌数采用平板计数法。
[0018]本发明的实验证明，本发明开发了一种快速诱导金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态的方法，利用超声波技术处理细菌，可促使细菌在20min快速进入活的不可培养状态;本发明的方法使金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态的诱导时间大大缩短，节约了科研成本，推动了有关活的不可培养状态细菌的研究进度。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0020 ]实施例1金黄色葡萄球菌活的不可培养状态的快速诱导
[0021]一超声诱导
[0022](I)细菌悬浮液制备
[0023]将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923接种于普通肉汤培养基中，37°C摇床培养至对数生长期。采用0.85% (质量百分含量)无菌生理盐水洗涤对数生长期的菌体两次，重悬，使菌体浓度约为18CFUAiL，作为待诱导菌液(细菌悬浮液)；
[0024](2)超声处理
[0025]实验组:用超声波SCIENTZ-1ID型杀菌装置对金黄色葡萄球菌悬浮液进行处理，具体步骤:将30mL细菌悬浮液装入玻璃超声管中，直径为1mm的超声探头深入液面2cm，将超声管放入20 °C水浴锅中，对菌液进行超声处理，处理频率为20kHz，处理功率为100W，处理时间为20min，得到诱导后菌液。
[0026]对照组:待诱导菌液不进行超声处理，只在20°C水浴锅中放置20min。
[0027]二检测
[0028](I)活菌数测定方法
[0029]采用PI/cFDA双染法:具体步骤:实验组和对照组的金黄色葡萄球菌与30mmol/L的PI 在冰浴中孵育 lOmin，然后与 50mmol/L 的 cFDA 在 37°C 孵育 10111丨11，4°(:、6000\8离心1011^11，用无菌生理盐水洗涤去除过量的染料，孵育完成后用流式细胞仪结合绝对计数荧光微球进行定量分析，每个样品收集20000个细菌检测。
[0030](2)可培养菌数测定方法
[0031 ] 采用平板计数法:具体步骤:参照GB 4789.2-2010方法，将诱导后菌液用0.85%无菌生理盐水进行梯度稀释，取稀释样ImL于灭菌平皿中，倒入约20mL PCA培养基摇匀，待培养基凝固后倒置于37°C培养箱中培养24h，然后记录菌落数。
[0032](3)活的不可培养状态细菌
[0033]采用上述的方法分别测定实验组和对照组的活菌数和可培养菌数，从而计算活的不培养状态菌数(活菌数一可培养菌数)。
[0034]结果如下:超声诱导后菌液的活菌数为7.831ogCFU/mL;诱导后菌液的可培养菌数为7.501og CFU/mL;进入了活的不可培养状态菌数为0.331og CFU/mL。对照组的活菌数与可培养菌数仍约为Slog CFU/mL，基本认为没有活的不可培养状态的菌。由此可见，本发明的方法在超声诱导20min时获得了一定比例的活的不可培养状态的金黄色葡萄球菌。
[0035]实施例2快速诱导较大比例金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态
[0036]一高压二氧化碳诱导
[0037](I)细菌悬浮液制备
[0038]与实施例1中的一的步骤(I)的方法相同。
[0039](2)超声诱导
[0040]与实施例1中的一的步骤(2)的方法基本相同，仅将处理功率变400W后得到诱导后菌液。
[0041 ] 二检测
[0042]与实施例1中的二的方法相同。
[0043]结果如下:超声诱导后菌液的活菌数为7.481ogCFU/mL;诱导后菌液的可培养菌数为6.961og CFU/mL;进入了活的不可培养状态菌数为0.521og CFU/mL。对照组的活菌数与可培养菌数仍约为Slog CFU/mL，基本认为没有活的不可培养状态的菌。由此可见，本发明的方法在超声诱导20min时获得了较大比例的活的不可培养状态的金黄色葡萄球菌。
[0044]本实施例同实施例1相比，获得的活的不用可培养状态的菌数更多。
[0045]对比例
[0046]按照CN105200034A中的条件进行金黄色葡萄球菌的诱导，菌液的活菌数为从81ogCFU/mL降到2.061og CFU/mL，可培养菌数将为2.041og CFU/mL;进入了活的不可培养状态菌数为0.021og CFU/mL。该处理条件在诱导过程中使活菌与可培养菌都大大降低，溶液中大部分菌的状态为死菌，违背了活的不可培养状态细菌诱导时要将活菌量维持在较高的比例。
[0047]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种快速诱导金黄色葡萄球菌进入活的不可培养状态的方法，其特征在于，包括如下步骤:将金黄色葡萄球菌经超声处理，使其进入活的不可培养状态，所述超声处理的条件为:处理频率为1?30kHz，处理功率为200-400W，处理时间为15?25min，处理温度为15?25。。。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述超声处理的条件为:处理频率为15?25kHz，处理功率为200?400W，处理时间为20?25min，处理温度为20?25°C。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述超声处理的条件为:处理频率为20kHz，处理功率为200W，处理时间为20min，处理温度为20°C。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述超声处理的条件为:处理频率为20kHz，处理功率为400W，处理时间为20min，处理温度为20°C。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述超声处理前还包括以下步骤:将金黄色葡萄球菌洗涤、悬浮，得到待诱导细菌悬浮液。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，洗涤和悬浮均采用无菌生理盐水。7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述无菌生理盐水为质量百分含量为0.85%的NaCl水溶液。8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌为处于对数期的目的细菌。
【文档编号】C12N13/00GK105838705SQ201610368998
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】丁甜, 李娇, 廖新浴, 刘东红, 叶兴乾, 陈健初, 胡亚芹, 陈士国
【申请人】浙江大学