一种新型高活力蒜氨酸酶及其制备方法

一种新型高活力蒜氨酸酶及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种新型高活力蒜氨酸酶及其制备方法，其技术方案是利用随机突变技术改造来源于大蒜鳞茎的野生型蒜氨酸酶基因，得到高活力的蒜氨酸酶突变体基因，即新型高活力蒜氨酸酶基因，然后将新型高活力蒜氨酸酶基因分别在枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统(包括毕赤酵母游离表达系统和毕赤酵母细胞表面展示系统)中表达，得到产高活力蒜氨酸酶的重组菌株，发酵表达后，检测高活力蒜氨酸酶的比酶活较野生型蒜氨酸酶提高50％。
【专利说明】
一种新型高活力蒜氨酸酶及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及通过易错PCR技术体外定向进化构建的比酶活提 高的新型蒜氨酸酶突变体，具体地说涉及到基因的随机突变和重组DNA技术，尤其是一种新 型高活力蒜氨酸酶及其制备方法。 技术背景
[0002] 蒜氨酸酶又称烷基半胱氨酸亚砜酶、C-S酶等(E. C. 4.4.1.4)，1949年由Sto 11和 Seeback首先发现。它有二聚体、三聚体、四聚体等形式。不同的植物蛋白聚合形式是不同 的，如大蒜(Aliiium sativum)的蒜氨酸酶为二聚体，而洋葱(Aliiium cepa)的则为四聚 体。
[0003] 国外学者已经从洋葱、韭菜、熊葱及大蒜中得到编码蒜氨酸酶的基因，但所报道的 基因序列、蛋白分子质量及生化性质有诸多分歧。Rabinkov等克隆的大#示鱗莖#示氣酸酶基 因长达2200bp，为翻译后剪切前未成熟酶(precursor alliinase)的全长基因序列。该蒜氨 酸酶只存在于大蒜鳞茎及叶中，而不存在于大蒜根中，但其根中具有很高的酶活性，由此推 断大蒜根部含有蒜氨酸酶的同工酶。2000年，Lancaster等从洋葱根中纯化了一种新型蒜氨 酸酶，得到了编码洋葱根蒜氨酸酶蛋白的cDNA，阐述了其结构与功能。
[0004] 1998年，Weik等研究了蒜氨酸酶在大肠杆菌、酿酒酵母及毕赤酵母中重组表达，获 得了重组蒜氨酸酶。2010年，来庆勤等克隆得到蒜氨酸酶基因，并在大肠杆菌中进行了表 达，获得了重组蛋白包涵体，经蛋白复性，重组蒜氨酸酶比活力高于Weik的报道。但与经植 物化学方法直接从大蒜中提取的样品相比尚不理想。2010年，吴晓莉等根据GenBank登录的 蒜氨酸酶序列设计引物，通过RT-PCR技术在国内首次克隆登录了我国浙江大蒜鳞茎蒜氨酸 酶基因。浙江蒜氨酸酶比GenBank登录的大蒜蒜氨酸酶序列多了3个碱基，有9个位点发生突 变。并将目的基因成功构建到pPICZaC毕赤酵母表达载体上。重组蒜氨酸酶具有酶活性，酶 比活力为(82.09 ± 3.89)U/mg，低于提取的天然蒜氨酸酶。
[0005] 大蒜在医药和保健方面的作用已得到普遍的认可，因而蒜氨酸酶的作用就显得尤 为重要。目前国内外生产的大蒜片剂和胶囊达到30种以上，从大蒜中分别提取蒜氨酸和蒜 氨酸酶，利用蒜氨酸和蒜氨酸酶生产复合胶囊或注射针剂。因此，开展DNA分子重组技术构 建蒜氨酸酶表达系统生产蒜氨酸酶，以及利用随机突变提高酶活性和稳定性这些方面的研 究，就成为提高蒜类药品药效的行之有效的途径，并将为蒜类药品和保健品的开发与应用 提供更广阔的空间。
[0006] 酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略。利用分 子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突 变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特 殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的结构酶。 其中，易错PCR是指在扩增目的基因的同时，利用Taq酶不具备3'-5'校对功能，同时改变反 应体系中Mn2+、Mg2+和各种dNTP的浓度，以一定的频率向目的基因随机引入碱基错配，导致 目的基因发生随机突变。然而，经一次突变的基因一般很难获得满意的结果，由此又发展出 连续易错PCR(Sequential Error-prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的产物作为下一 次PCR扩增的模板，连续反复地进行易错，使每一次获得的小突变不断进行积累而产生重要 的有益突变。因此，具有独有的优势。
[0007] 枯草芽孢杆属于革兰氏阳性菌。枯草芽孢杆菌表达系统有以下优点：1、能够高效 地分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病 性，不产生任何内毒素；3、芽孢杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并具有生长迅 速，对营养无特殊要求的优点;4密码子偏爱性不明显;5发酵简单，枯草芽孢杆菌是好氧菌， 无需厌氧发酵设备，对培养基无特殊要求，发酵结束后，简单地分离发酵液和细菌菌体，即 可进入目的蛋白的纯化回收阶段;6具有抗逆性，可生产多种耐热性酶制剂。
[0008] 毕赤酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速。毕赤酵 母表达系统用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。毕赤酵母表 达系统具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基 化修饰，性质较原核表达系统表达的蛋白质更加稳定，毕赤酵母表达系统具有两种表达形 式，包括毕赤酵母游离表达系统和毕赤酵母细胞表面展示系统。毕赤酵母游离表达系统表 达的外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工 和糖基化修饰，性质较原核表达系统表达的蛋白质更加稳定，某些酵母表达系统具有外分 泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，易于纯化，而毕赤酵母细胞表面展 示系统除具有外源基因的翻译后加工能力和蛋白的折叠加工及适度糖基化的优点外，经该 系统得到的全细胞催化剂还可以重复利用从而降低生产成本。毕赤酵母表达系统已成为现 代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因比较理想的工具。

【发明内容】

[0009] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种新型高活力蒜氨酸酶突变 体基因，本发明使用易错PCR技术，对野生型蒜氨酸酶进行随机突变，得到新型高活力蒜氨 酸酶(Glu225Val、Glu267Phe)，新型高活力蒜氨酸酶的比酶活比野生型蒜氨酸酶的比酶活 提尚了50%。
[0010] 本发明的目的是采用以下技术方案完成的：
[0011] 一种新型高活力蒜氨酸酶突变体基因，其基因序列为SEQ ID N0:5。
[0012] -种新型高活力蒜氨酸酶突变体基因的构建方法，将大蒜鳞茎野生型蒜氨酸酶基 因进彳丁随机突变，第674位喊基A-T，第799位喊基G-T，第800位喊基A-T，第801位喊基A- C，得到新型高活力蒜氨酸酶突变体基因；所述大蒜鳞茎野生型蒜氨酸酶基因序列为SEQ ID N0:3〇
[0013] -种新型高活力蒜氨酸酶突变体，通过如序列3所示的核苷酸序列编码的野生型 蒜氨酸酶氨基酸序列中，第225位的氨基酸Glu替换为Val和第267位的氨基酸Glu替换为 Phe，得到如序列6所示的氨基酸序列。
[0014] -种新型高活力蒜氨酸酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
[0015] ⑴通过易错PCR随机突变大蒜鳞茎的野生型蒜氨酸酶基因，第674位碱基A-T，第 799位碱基G-T，第800位碱基A-T，第801位碱基A-C，得到新型高活力蒜氨酸酶突变体编 码基因；
[0016] ⑵将所述的新型高活力蒜氨酸酶突变体编码基因酶切、连接到表达或展示载体， 得到携带高活力蒜氨酸酶突变体编码基因重组载体；
[0017] ⑶将重组载体转化至宿主细胞，得到重组菌株；
[0018] ⑷表达所述的重组菌株，纯化获得如SEQ ID N0:6所示的新型高活力蒜氨酸酶。
[0019] -种含有上述基因的表达载体以及宿主细胞。
[0020] 而且，所述的表达载体为PBSA43、所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600。
[0021]而且，所述的表达载体为PPIC9K、所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115。
[0022] 而且，所述的展示载体为pPIC9K-Flo、所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115。
[0023]本发明的独特之处有如下几点：
[0024] 1、本发明中新型高活力蒜氨酸酶基因在枯草芽孢杆菌表达系统和毕赤酵母表达 系统中进行了表达，分别得到枯草芽孢杆菌新型高活力蒜氨酸酶重组菌株和毕赤酵母新型 高活力蒜氨酸酶重组菌株(包括毕赤酵母新型高活力蒜氨酸酶游离表达重组菌株和毕赤酵 母细胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶重组菌株）。重组菌株发酵后，经过相应的处理可得新 型高活力蒜氨酸酶催化剂。
[0025] 2、本发明使用易错PCR技术，对野生型蒜氨酸酶进行随机突变，得到新型高活力蒜 氨酸酶(Glu225Val、Glu267Phe)，新型高活力蒜氨酸酶的比酶活比野生型蒜氨酸酶的比酶 活提尚了 50 %。
[0026] 3、本发明中枯草芽孢杆菌新型高活力蒜氨酸酶重组菌发酵后蒜氨酸酶的比酶活 可达到（105.34± 1.73)U/mg，毕赤酵母游离表达新型高活力蒜氨酸酶重组菌的比酶活可达 (173.72±2.89)U/mg，毕赤酵母细胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶全细胞催化剂的比酶活 可达（196.47±4.93)U/(g ·干细胞）。
[0027] 4、本发明采用酵母表面展示系统，将蒜氨酸酶展示于酵母表面，酵母细胞既作为 酶的生产者，又可以充当固定化酶中的载体，免去了酶的纯化和固定等操作，简化了生产环 节，降低了生产成本。
【附图说明】
[0028]图1为本发明蒜氨酸酶成熟肽基因的PCR扩增电泳图，其中:M为DNA Marker，l为蒜 氨酸酶成熟肽基因；
[0029] 图2为本发明重组质粒pBSA43-alliinasem酶切验证图，其中：M为DNA Marker，l为 pBSA43_al 1 i inasem 经 BamHI 和 Hindll I 双酶切；
[0030] 图3为本发明重组质粒pPIC9K-alliinasem酶切验证图，其中：M为DNA Marker，l为 pPIC9K_al 1 i inasem 经 EcoRI 和 Not I 双酶切；
[0031] 图4为本发明重组质粒pPIC9K-Fl〇-alliinasem酶切验证图，其中：M为DNA Marker，1 为pPIC9K_Fl〇-al 1 i inasem 经 SnaBI 和EcoRI双酶切；
[0032] 图5为丙酮酸标准曲线；
[0033] 图6为以FeS〇4为标准物质绘制标准曲线；
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施 例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0035] 本发明实现的目的技术路线如下
[0036]取新鲜大蒜鳞茎于液氮中研碎，按照Trizol试剂说明书进行总RNA的提取并进行 RT-PCR。以合成的cDNA第一链为模板，设计引物，扩增野生型蒜氨酸酶基因序列（如SEQ ID N0:3所示）。将其与pET28a载体连接后通过易错PCR进行随机突变，获得新型高活力蒜氨酸 酶基因（如SEQ ID N0:5所示），构建重组载体并在枯草芽孢杆菌WB600及毕赤酵母GS115中 成功表达，得到产新型高活力蒜氨酸酶的重组菌株，进一步通过发酵提取工艺获得高活力 的新型蒜氨酸酶。
[0037]在本发明中采用如下定义：
[0038] 1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
[0039]使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认 IUPAC命名法。
[0040] 2、新型蒜氨酸酶突变体的标识
[0041] 采用"原始氨基酸位置替换的氨基酸"来表示新型蒜氨酸酶突变体中突变的氨基 酸。如Glu225Val，表示位置225的氨基酸由亲本蒜氨酸酶的Glu替换成Val，位置的编号对应 于SEQ ID N0:4中蒜氨酸酶的氨基酸序列编号。
[0042] 在本发明中，aliiinase表示野生型蒜氨酸酶的原始氨基酸序列（如SEQ ID N0:4 所示），alliinasem表示新型蒜氨酸酶的突变氨基酸序列（如SEQ ID N0:6所示）。
[0043]
[0044] 用于表达所述的新型蒜氨酸酶突变体的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600,表达载 体为 PBSA43;
[0045] 用于表达所述的新型蒜氨酸酶突变体的宿主细胞为毕赤酵母GS115,表达载体为 PPIC9K；
[0046] 用于表达所述的新型蒜氨酸酶突变体的宿主细胞为毕赤酵母GS115,展示载体为 pPIC9K-Flo；
[0047] 实施例1
[0048] 野生型蒜氨酸酶成熟肽基因的获得
[0049] 1、取新鲜大蒜鳞茎于液氮中研碎，按照Trizol试剂说明书进行总RNA的提取并进 行RT-PCR。
[0050] 2、以合成的cDNA第一链为模板，根据Genbank序列号S73324.1登录的蒜氨酸酶序 列，在其0RF框上下游设计一对引物，分别引入限制性酶切位点BamH I、Hindm。设计本发明 的蒜氨酸酶成熟肽基因的扩增引物如下：
[0051 ]上游引物PI (SEQ ID N0 · 1): 5 ' -CGCGGATCCATGATCTGCCTAGTGATTTTGACATG-3 '
[0054]
[0052] 下游引物P2(SEQ ID NO· 2):5，-CCCAAGCTTTTAAATGAAAGGACGACGGGAG-3，[0053] 其扩增的反应条件为：
[0055]
[0056] 扩增条件为：95°C预变性5min;95°C变性3〇8,60°(：退火4〇8,72°(：延伸11^113〇8反应 30个循环;72°C延伸lOmin。PCR扩增产物经0.8 %琼脂糖凝胶电泳，得到1422bp的条带（图 1)，用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到本发明的野生型蒜氨酸酶成熟肽基因 alliinase，测序后见序列3。
[0057] 实施例2
[0058]新型高活力蒜氨酸酶基因的获得。
[0059] 1、将重组质粒化转入大肠杆菌DH5a中，经BamH I、Hindm双酶切验证，野生型蒜氨 酸酶基因已成功克隆到pET28a载体上。
[0060] 2、随机突变
[0061] (1)基于易错PCR技术进行随机突变，构建新型高活力蒜氨酸酶，设计引物如下：
[0062] 上游引物PI (SEQ ID N0 · 1): 5 ' -CGCGGATCCATGATCTGCCTAGTGATTTTGACATG-3 '
[0063] 下游引物P2(SEQ ID NO· 2):5，-CCCAAGCTTTTAAATGAAAGGACGACGGGAG-3，
[0064] 在易错PCR反应体系中，以P1和P2作为上下游引物，以野生型蒜氨酸酶成熟肽基因 为模板，进行易错PCR。
[0065]其扩增的反应条件为：
[0066]
[0067]
[0068] 扩增条件为：95°C预变性5min;95°C变性3〇8,60°(：退火4〇8,72°(：延伸11^113〇8反应 30个循环；72°C延伸lOmin。
[0069] (2)将新型高活力蒜氨酸酶突变体基因（alliinasem)克隆入表达载体pET28a中， 转化大肠杆菌BL21(DE3)，接种于每孔含200yL LB液体培养基(含30yg/mL的Kan)的96孔细 胞培养板中，于37°C条件下200r/min摇床培养，当OD600达到0.6，向每个孔中加入IPTG(终浓 度lmmol/L)，在16°C下诱导16h，将培养物分别进行以下3种处理方式：（1)反复冻融3次(-80 °C，15min;37°C，15min;0°C，15min); (2)加入溶菌酶（200μg/ml，30min); (3)热处理（100°C 沸水浴，20min)，然后在4000r/min下离心10min来去除沉淀，将上清转移到另一块96孔板中 检测其酶活力。
[0070] (3)酶活力检测 [0071]①酶活力定义
[0072]蒜氨酸酶每催化1分子蒜氨酸发生反应会产生2分子丙酮酸，因此可通过测定丙酮 酸的浓度来推算酶活。因此本发明酶活的定义为:在35°C条件下，蒜氨酸酶催化蒜氨酸的反 应，每分钟产生Uig丙酮酸定义为1个活力单位(U)。
[0073]②丙酮酸浓度与光吸收值标准曲线的绘制
[0074]丙酮酸能够与2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙，后者在碱性溶 液中呈樱红色，在波长520nm处测定吸光值。配置不同浓度的丙酮酸溶液，各取lmL，加入lmL 0.1 % 2，4-二硝基苯肼充分摇匀，再加入2mLl. 5mol/LNa0H摇匀，静置lOmin显色，用752紫外 分光光度计在520nm处测定吸光值。绘制丙酮酸浓度与光吸收值的标准曲线。
[0075] 丙酮酸标准曲线如图5所示，求得回归方程为Y = 0.0244X+0.0167,相关系数为R2 =0.9990ο
[0076]③新型蒜氨酸酶酶活的测定方法及步骤
[0077]以丙酮酸法测定酶活性。配制3mmol/L的蒜氨酸底物。收集发酵产物，加入l.OmL底 物，30°C下反应5min，加入1.5mL10 %三氯乙酸终止反应。再加入0.5mL0.1 % 2，4-二硝基苯 胼，充分混匀，加入7mL0.5mol/LNaOH溶液摇匀显色，520nm波长测定吸光值。根据吸收值算 出丙酮酸总浓度及酶活力。用Folin-酚法测定溶液中蒜氨酸酶蛋白质量。求出所测样品中 蒜氨酸酶的比活力。
[0078]④新型蒜氨酸酶酶活的测定
[0079] 测定原始蒜氨酸酶和突变后新型高活力蒜氨酸酶的比酶活，突变后蒜氨酸酶的比 酶活比突变前提高了 50 %。
[0080] 比酶活定义:单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来 表不。
[0081] (4)序列测定
[0082] 测序(北京华大生物工程公司）结果表明，此时扩增得到Glu225Val、Glu267Phe的 新型高活力蒜氨酸酶基因 alii inasem，见序列5。
[0083] 实施例3
[0084]枯草芽孢杆菌新型高活力蒜氨酸酶重组菌的构建 [0085] 1、表达载体pBSA43的构建
[0086] pBSA43是以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的 芽孢杆菌组成型启动子P43,以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号 序列sacB而获得。它带有Amp1基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记； 同时也具有KF基因，可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标 记。
[0087] 2、新型高活力蒜氨酸酶表达载体pBSA43-alliinasem的构建
[0088] 将经易错PCR构建获得的新型高活力蒜氨酸酶基因经BamHI和Hindlll双酶切后与 同样双酶切的枯草芽孢杆菌表达载体PBSA43连接，构建重组质粒pBSA43-alliinasem。将 pBSA43-al 1 i inasem转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验 证并测序，确定构建获得重组菌株JM109/pBSA43-al 1 i inasem。
[0089] 3、表达载体pBSA43_al 1 i inasem转化枯草芽抱杆菌WB600
[0090] 在60yL感受态细胞中加入lyL(50ngAiL)pBSA43-alliinasem混匀并转移到冰冷的 电转化杯（1mm)中，冰浴1-1 · 5min后，电击一次(25yF，200 Ω，4 · 5-5 · 0ms)。电击完毕之后，立 即加入lmL复苏培养基(LB+0.5mo 1/L山梨醇+0.38mo 1/L甘露醇）。37°C摇床震荡培养3h之 后，将复苏物涂布在LB平板上，37 °C培养24-36h，挑取阳性转化子，获得枯草芽孢杆菌重组 菌株 WB600/pBSA43_al 1 i inasem。
[0091] 实施例4
[0092] 毕赤酵母新型高活力蒜氨酸酶游离表达重组菌的构建
[0093] 1、新型高活力蒜氨酸酶表达载体pPIC9K-alliinaSem的构建
[0094] 将经易错PCR构建获得的新型高活力蒜氨酸酶基因经EcoRI和Notl双酶切后与同 样双酶切的毕赤酵母表达载体PPIC9K用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109 (DH5c〇感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子;提取阳性转化子质粒，经37°C摇管 培养后抽提质粒，并进行单、双酶切初步验证，并将酶切验证正确的重组质粒命名为 pPIC9K-alliinaSem;将酶切验证正确的阳性克隆送至北京华大基因科技股份有限公司测 序，以进一步确保目的基因的正确性，最终确定构建获得正确的重组菌株JM109/pPIC9K- alliinasem〇
[0095] 2、新型高活力蒜氨酸酶重组菌株的构建及新型高活力蒜氨酸酶高表达菌株的筛 选
[0096] (1)线性化重组表达质粒pPIC9K_alliinasem的制备
[0097] 重组质粒在电转化毕赤酵母GS115前，要先将构建好的重组表达质粒pPIC9K- alliinasem进行线性化以提高重组质粒在毕赤酵母染色体上的整合效率。每次转化需要线 性化质粒DNA 5-20yg，且质粒越纯，转化效率越高。可以分别用SacI和SalI这2种限制性内 切酶进行线性化酶切。酶切完之后，用小量DNA回收试剂盒回收线性化酶切产物。
[0098] (2)线性化质粒口？1091(-311;[;[1^861]1电转化毕赤酵母63115、阳性转化子的鉴定及 新型高活力蒜氨酸酶高产菌株的筛选
[0099] ①将80yL感受态细胞和5-20yg经线性化的DNA加入到1.5mL预冷的离心管中，混 匀，将反应液转移到预先冰浴的转化杯中；
[0100]②冰浴装有转化液的转化杯5min，根据电转装置推荐的参数，进行毕赤酵母电转 化：
[0101 ]③脉冲后，立即向转化杯中加入lmL预冷的lmol/L的山梨醇溶液，把转化液转移到 一个新的1.5mL离心管中；
[0102] ④30°C静置培养1-2h，吸取毕赤酵母GS115电转液200yL涂布在MD培养基上；
[0103] ⑤30°C培养直至转化子出现；
[0104]⑥挑取转化子单菌落溶解在10yL去离子水中，取2yL菌液，加入Lyticase破壁酶， 30 °C反应lOmin，反应液立即放入-80 °C冰箱中冷冻lOmin，使酵母细胞壁裂解，释放的基因 组作为模板进行PCR。以转入空质粒pPIC9K的毕赤酵母GS115/pPIC9K作为对照，确定阳性转 化子。
[0105] ⑦在确定阳性转化子的基础上，先用含不同浓度遗传霉素的抗性平板筛选高遗传 霉素抗性的转化子，然后分别测定这些高遗传霉素抗性的转化子的新型蒜氨酸酶的酶活， 以得到新型高活力蒜氨酸酶的高产菌株GS115/pPIC9K-alliinaSem。
[0106] 实施例5
[0107] 毕赤酵母细胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶重组菌的构建
[0108] 1、重组质粒 pPIC9K_Fl〇-alliinasem 的构建
[0109] 将易错PCR纯化产物与载体pPIC9K-Flo经SnaBI和EcoRI双酶切后，将新型高活力 蒜氨酸酶基因连接至载体pPIC9K-Flo中，将连接产物转化到大肠杆菌DH5a感受态中，在含 有Amp的LB固体培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，双酶切鉴定并测序，命 名为 pPIC9K-Flo_alliinasem〇[0110] 2、毕赤酵母重组菌的构建
[0111]将测序正确的重组质粒经Sal I线性化后，用电转化法转化毕赤酵母GS115，MD平板 筛选重组子，获得毕赤酵母细胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶重组菌GS115/pPIC9K-Fl〇- alliinasem〇
[0112] 实施例6
[0113] 新型高活力蒜氨酸酶在枯草芽孢杆菌重组菌中的表达及制备
[0114] 将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-al 1 i inasem接种于LB液体培养基(含卡 纳霉素，30yg/mL)中，37°C，200r/min培养过夜，按1 %接种量转接于50mL新鲜培养基中， 200r/min培养48h，可制备获得新型高活力蒜氨酸酶粗酶液，然后采用分级盐析法沉淀新型 高活力蒜氨酸酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷 冻干燥制得新型高活力蒜氨酸酶纯酶酶粉。
[0115] 实施例7
[0116] 新型高活力蒜氨酸酶在毕赤酵母游离表达重组菌中的表达及制备
[0117] 将培养于YH)固体平板上的毕赤酵母游离表达新型高活力蒜氨酸酶重组菌接种至 YH)液体培养基中，30 °C、250r/min培养24h。以1 %的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30°C 培养24h，然后6000r/min离心5min得到菌体，转入BMMY培养基中。30°C、250r/min，每隔24h 补甲醇，使其终浓度保持在〇.5%V/V，培养120h后可得到新型蒜氨酸酶突变体的粗酶液，然 后采用分级盐析法沉淀新型高活力蒜氨酸酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离 子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得新型高活力蒜氨酸酶纯酶酶粉。
[0118] 实施例8
[0119] 毕赤酵母细胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶全细胞催化剂的制备
[0120] 将培养于YH)固体平板上的毕赤酵母细胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶重组菌接 种至Yro液体培养基中，30°C、250r/min培养24h，以1 %的接种量转接到新鲜BMGY培养基中， 30 °C培养24h，然后6000r/min离心5min得到菌体，转入BMMY培养基中，30 °C、250r/min培养 120h，每隔24h补甲醇，使其终浓度保持在0.5%V/V，然后离心收集取菌体，用双蒸水洗1-2 次，加入保护剂，通过真空冷冻干燥制得毕赤酵母细胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶全细 胞催化剂。
[0121] 实施例9
[0122] 重组菌酶活力测定
[0123] 将得到的三株重组菌发酵后测定酶活，其中枯草芽孢杆菌新型高活力蒜氨酸酶重 组菌发酵后发酵液中新型蒜氨酸酶的比酶活可达到（l〇5.34±1.73)U/mg，毕赤酵母游离表 达新型高活力蒜氨酸酶重组菌发酵后发酵液中的比酶活可达（173.72±2.89)U/mg，毕赤酵 母细胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶全细胞催化剂的比酶活可达（196.47±4.93)U/(g · 干细胞）。而枯草芽孢杆菌野生型蒜氨酸酶重组菌发酵后发酵液中蒜氨酸酶的比酶活可达 到（70.23±2.13)U/mg，毕赤酵母游离表达野生型蒜氨酸酶重组菌发酵后发酵液中的比酶 活可达（115.82 ± 2.46)U/mg，毕赤酵母细胞表面展示野生型蒜氨酸酶全细胞催化剂的比酶 活可达（130.98±3.93)U/(g ·干细胞）。
[0124] 实施例10
[0125] 新型蒜氨酸酶抗氧化活性测定
[0126] 1、DPPH·自由基清除能力的测定
[0127] 参照Brand-WilliamsW.的方法。以下操作分别在无氧条件和有氧条件下进行：用 超纯水混合蒜氨酸及重组蒜氨酸酶粗酶液，制成蒜氨酸/蒜氨酸酶混合物溶液(终浓度为 10mm〇l/Lal 1 iin，蒜氨酸酶粗酶液总蛋白含量为0.275mg/mL)，于37°C水浴中酶催化反应不 同时间，取1 mL样品及4mL浓度为0.12mmol/L的DPPH乙醇溶液(体积分数为95% )，混匀，室 温下避光反应3〇111；[11，如有沉淀在55001'/1]1；[11条件下离心51]1；[11。用体积分数为95%乙醇溶液 作参比，于517nm测定吸光值。根据下式计算每个样品液对DPPH ·自由基的清除率：
[0128] 清除率/% = [l-(Ai_Aj)/Ac]X100%
[0129] 式中:Ai :为加样品液后DPPH溶液的吸光值；
[0130] Aj:为样品液的吸光值；
[0131] Ac:为未加样品液时DPPH溶液的吸光值。
[0132 ] 2、总抗氧化能力的测定(FRAP值测定）
[0133] 取各供试品溶液，适当稀释后移液器取10ΟμL，加入FRAP工作液3mL，混匀反应 20min，于593nm处读取吸光度。以FeS04为标准物质绘制标准曲线（如图6所示），求得回归方 程为：
[0134] y = 0 · 3584x-0 · 0043，相关系数 R2 = 0 · 9986
[0135] 样品的总抗氧化能力以FRAP值表示：1FRAP单位相当于lmmol/L FeS〇4,即样品的 总抗氧化能力相当于FeS〇4的mmol/L数。
【主权项】
1. 一种新型高活力蒜氨酸酶突变体基因，其特征在于:其基因序列为SEQ ID N0:5。2. -种如权利要求1所述的新型高活力蒜氨酸酶突变体基因的构建方法，其特征在于： 将大蒜鳞茎野生型蒜氨酸酶基因进行随机突变，第674位碱基A-T，第799位碱基G-T，第 800位碱基A-T，第801位碱基A-C，得到新型高活力蒜氨酸酶突变体基因；所述大蒜鳞茎野 生型蒜氨酸酶基因序列为SEQ ID NO:3。3. -种新型高活力蒜氨酸酶突变体，其特征在于:通过如序列3所示的核苷酸序列编码 的野生型蒜氨酸酶氨基酸序列中，第225位的氨基酸Glu替换为Val和第267位的氨基酸Glu 替换为Phe，得到如序列6所示的氨基酸序列。4. 一种如权利要求3所述的新型高活力蒜氨酸酶突变体的制备方法，其特征在于:包括 如下步骤： ⑴通过易错PCR随机突变大蒜鳞茎的野生型蒜氨酸酶基因，第674位碱基A-T，第799位 碱基G-T，第800位碱基A-T，第801位碱基A-C，得到新型高活力蒜氨酸酶突变体编码基 因； ⑵将所述的新型高活力蒜氨酸酶突变体编码基因酶切、连接到表达或展示载体，得到 携带高活力蒜氨酸酶突变体编码基因重组载体； (3)将重组载体转化至宿主细胞，得到重组菌株； ⑷表达所述的重组菌株，纯化获得如SEQ ID NO:6所示的新型高活力蒜氨酸酶。5. -种包含权利要求1所述的基因的表达载体以及宿主细胞。6. 根据权利要求5所述的新型高活力蒜氨酸酶基因的表达载体以及宿主细胞，其特征 在于:所述的表达载体为PBSA43、所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600。7. 根据权利要求5所述的新型高活力蒜氨酸酶基因的表达载体以及宿主细胞，其特征 在于:所述的表达载体为PPIC9K、所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115。8. 根据权利要求5所述的新型高活力蒜氨酸酶基因的表达载体以及宿主细胞，其特征 在于:所述的展示载体为pPIC9K-Flo、所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115。
【文档编号】C12N15/81GK105838729SQ201610330256
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】路福平, 刘逸寒, 郭伟, 韩杨, 贾雷博
【申请人】天津科技大学