一种转化植物甾醇的工程菌及其构建方法和应用
【专利摘要】本发明涉及工业微生物和发酵工艺学领域，尤其是一种具有催化功能的偶发分枝杆基因工程菌构建方法及其应用。通过失活保藏号CGMCC No.9657的野生型偶发分枝杆菌中1,2位脱氢酶基因，构建获得的基因工程菌，能够催化植物甾醇生成9α-羟基雄烯二酮，选择性在70％～80％，可减少副产物9α-羟基睾酮。CGMCC No. 965720140915
【专利说明】
一种转化植物留醇的工程菌及其构建方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术和生物化工领域，具体为工业微生物和发酵工艺学领域，尤 其是一种具有催化功能的偶发分枝杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 留体激素类药物是指分子结构中含有留体结构的激素类药物，是临床上一类重要 的药物，具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用，是医药行业的重点发展 方向之一。这类药物主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类。皮质激素类药物用于临 床的有醋酸可的松（cortisone acetate)、氢化可的松（hydrocortisone)、醋酸地塞米松 (oexamethasone acetate)、醋酸氟轻松（fluocinonide)等。
[0003] 留体激素类药物生产的重要原料为植物留醇。从植物留醇经过分支杆菌转化生成 9 α -羟基-雄烯二酮（9 α -羟基-雄烯二酮，90H-AD，9 a -OH AD)。9 α -羟基-雄烯二酮 可以作为多种重要留体类药物的合成原料。
[0004] 化学合成的方法生产工艺复杂产率不高，因此生物工艺发酵方法生产9α -羟 基-雄烯二酮是发展方向。
[0005] 现有的报道中，采用新金色分枝杆菌（M ycobacterium sp.)微生物催化植物甾醇 转化为雄烯二酮，即雄留-4-烯-3, 17-二酮（AD)或雄留-1，4-烯-3, 17-二酮（ADD)，通过 诱变筛选到的菌株后ADD产量可明显提高。雄烯二酮需经过进一步反应生成9 α -羟基-雄 烯二酮。
[0006] 保藏号为CGMCC No. 9657的一种偶发分枝杆菌，其中的9位羟基化酶、4, 5位脱氢 酶与留体边链降解酶可以催化植物留醇转化为9 α -羟基-雄烯二酮，转化过程中同时产生 了较多量的副产物如9 α -羟基睾酮，生产单耗为2. 2~2. 5,总转化率达到95%，选择性 50 %~60%。造成选择性较低的主要原因是随着发酵时间的延长，产物9 α -羟基-雄烯二 酮会被1，2位脱氢酶转化为9 α -羟基-1，4-雄烯二酮，9 α -羟基-1，4-雄烯二酮进一步 生产其他副产物，反应如下式所示。
[0007] 因此，需要对该菌株进行改进，获得能够减少产物降解的基因工程菌，减少9-羟 基-1，4-雄烯二酮生成及进一步降解，以降低单耗。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种构建新的偶发分枝杆菌工程菌的方法，这种菌株具有 催化植物留醇生产9 α -羟基雄烯二酮的功能，能降低单耗并减少副产物。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种新的工程菌。
[0010] 本发明还将上述工程菌用于生产9 α -羟基雄烯二酮。
[0011] 技术方案为，通过失活偶发分枝杆菌中至少一个1，2位脱氢酶基因的方法，构建 转化植物留醇的工程菌。
[0012] 优选的，通过失活保藏号为CGMCC No. 9657的偶发分枝杆菌中至少一个1，2位脱 氢酶基因的方法，构建转化植物留醇的工程菌。
[0013] 上述偶发分枝杆菌（拉丁名Mycobacterium foruitum)的保藏号为CGMCC No. 9657,保藏日期为2014年9月15日，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0014] 该菌株的培养条件为牛肉膏0.2%、蛋白胨0.4%、甘油2%、琼脂粉2% (pH自 然），28°C培养6-7天。保藏条件为真空冷冻干燥（长期保藏）。
[0015] 这种工程菌可用于催化植物留醇转化为9 α -羟基雄烯二酮，转化率超过95 %并 减少副产物，选择性提高到70%~80%，单耗为1. 8~2. 0。
[0016] 使野生型转化植物留醇的偶发分枝杆菌中的至少一个1，2位脱氢酶基因失活，构 建转化植物留醇的工程菌。
[0017] 通过失活保藏号为CGMCC No. 9657的偶发分枝杆菌中至少一个1，2位脱氢酶基因 的方法，构建转化植物留醇的工程菌。
[0018] 所失活的1，2位脱氢酶基因选自以下6个基因中的至少一种：GenBank登录号 EJZ14836、EJZ16093、EJZ16098、EJZ14570、EJZ14467 和 EJZ13173 所对应的核酸序列同源性 在99%以上的核酸序列；更优选的，所失活的基因为1，2位脱氢酶SEQ ID No. 1~No. 6中 的至少一种。
[0019] 优选的，通过插入失活质粒使1，2位脱氢酶基因中断失活。具体为：
[0020] (1)扩增1，2位脱氢酶基因的部分同源序列并插入失活质粒；
[0021] (2)将步骤（1)得到的质粒转化保藏号CGMCC No. 9657的野生型偶发分枝杆菌。
[0022] 所述工程菌构建方法为，向上述6种
[0023] 所述的部分同源序列以保藏号为CGMCC No. 9657的野生型偶发分枝杆菌基因组 DNA为模板，用以下各组上下游引物中的至少一组扩增获得的片段或者与该片段相同的核 苷酸序列：
[0024] (a)基因 1 上游引物：5' -AAAGAATTCCGGAGATGCTGTCGTTCGTG
[0025] 基因 1 下游引物：5' -AAAAAGCTTCGCCGGATTCCATCCACTT
[0026] (b)基因 2 上游引物：5 ' -AAAGAATTCTCGAAGTTGTCTGCCTTGACTG
[0027] 基因 2 下游引物：5 ' -AAAAAGCTTCCGCTGGCTGAACCTGATG
[0028] (c)基因 3 上游引物：5 ' -AAAGAATTCGACGGTCTTGCCGGGTTC
[0029] 基因 3 下游引物：5 ' -AAAAAGCTTCGGACGGTCAGTGAGTGGATT
[0030] (d)基因 4 上游引物：5 ' -AAAGAATTCTGTGCCCAGATCGGAAATGC
[0031] 基因 4 下游引物：5 ' -AAA AAGCTTTGCCTCGCTTCGGCTCAAC
[0032] (e)基因 5 上游引物：5 ' -AAAGAATTCGACACCGACCTGGTGGAGACA
[0033] 基因 5 下游引物：5' -AAA AAGCTITTCAACGTGGCGGCAATC
[0034] (f)基因 6 上游引物：5 ' -AAAGAATTCAGGGTCGGCTGCTTCTG
[0035] 基因 6 下游引物：5' -AAAAAGCTT TTCTCACTTCGGCGGTTC。
[0036] 通过上述方法可获得转化植物留醇的偶发分枝杆菌工程菌，该菌株的培养及保藏 方法与保藏号为CGMCC No. 9657的偶发分枝杆菌相同。
[0037] -种9α-羟基雄烯二酮的制备工艺，以植物留醇为原料，用上述工程菌发酵转 化，发酵的条件为：25~34°C下（优选为26~32°C )通入空气并搅拌；通气比为1 :0· 3~ 0. 85,发酵转化48~168小时。
[0038] 优选的通气比为1 :0. 5~0. 75 ;更优选为1 :0. 55~0. 65。优选的搅拌速度为 300~600rpm，更优选450~500rpm。优选的发酵时间为84~168小时，更优选为84~ 120小时或136~168小时。
[0039] 一个优选的发酵转化培养的条件为：温度29±1°C，通气比1:0. 6,搅拌速度 480rpm，发酵转化时间为84~120小时或136~168小时。
[0040] 发酵转化培养基含有：(a)甘油0.5%~2%，（b)磷酸钠或酸式磷酸钠盐 0.75%~0.9%，和磷酸钾或酸式磷酸钾盐0.35%~0.5%，（d)铵盐如NH4C1 0.15%~ 0.3%，（e)MgS040 . 02%~0.06%，（f)黄豆粉 0.05%~0.2%或 0.5%~1 %的蛋白胨或酵 母膏；（g)分散剂（如吐温80) 0.05%~0.2%; (h)卡那霉素 15~25ppm，均为质量百分比。
[0041] 发酵转化培养基中还含有植物留醇0. 7%~2%，余量为水。
[0042] 优选的，发酵转化培养基为：甘油 l%，Na2HP040 . 84%，KH2P040 . 45%，NH4C1 0. 2%， MgS040 . 03%，黄豆粉0· 1 %，植物甾醇1 %，分散剂如吐温800. 1 %，卡那霉素 20ppm，余者为 水，pH 8. 5〇
[0043] 优选的，先将偶发分枝杆菌接种于种子培养基，25~34°C (优选为26~32°C ) 下通入空气并搅拌，培养48~120小时后再接种于发酵培养液。通气比为1 :0. 3~0. 85， 优选为1 :〇. 5~0. 75,搅拌速度为300~600rpm，优选为450~500rpm。取种子培养液以 5%~12%的体积比接种发酵培养液，优选为10%。
[0044] 发酵中使用的种子培养基含有：蛋白胨0.8%~1.4%，牛肉膏0.2%~0.5%， 恥(：10.45%~0.6%(均为质量百分比），卡那霉素40~60??111，？册.8~7.3。优选的，种 子培养基pH = 6. 9~7. 0,含有蛋白胨1%，牛肉膏0· 3%，NaCl 0· 5%，卡那霉素50ppm，。
[0045] 优选的，种子培养条件为：温度29土1°C，通气比1:0. 6,搅拌速度480rpm，培养96 小时。
[0046] 发酵液用有机溶剂，如乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷提取。发酵液与有机溶剂体 积比为1 :2~2 :1，优选为1 :1· 2~1. 2:1。
[0047] 经检测，用本发明的偶发分枝杆菌发酵转化植物留醇的主要产物为9 α -羟基雄 烯二酮，转化率95%以上，选择性达80%以上，生产9 α -羟基雄烯二酮的单耗在1. 8~2， 与野生型菌株相比，基因工程菌阻断1，2位脱氢酶使之失活，从而减少9-羟基-1，4-雄烯 二酮生成和进一步降解，使转化的单耗降低；基因工程菌转化所产生的9 α -OH AD与副产 物d (9 α -羟基睾酮）的产量比例为8:1~12:1，副产物d (9 α -羟基睾酮）的量比野生型 菌株下降50%以上，且基因工程菌转化后期产物稳定，不会出现原始野生型菌株转化后期 产物快速降解的现象。与原始菌株相比，基因工程菌具有更佳的性能，可以提高生产效率。 工艺方法简单，效率高，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0048] 图1为同源重组基因中断失活的示意图。
[0049] 图2为发酵96小时后，提取发酵液检测的液相色谱（HPLC)图，图2中㈧为基因 工程菌，图2中（Β)为野生型菌株。
[0050] 其中，a-副产物1 ;b-乙酸乙酯；c-9 α -羟基雄烯二酮；d-9 α -羟基睾酮（副 产物2) ;e-副产物3 ;f-副产物4
[0051] 图3为不同发酵时间时，野生型菌株与基因工程菌转化生成的产物量. 具体实施方案
[0052] 实施例1
[0053] 野生型的偶发分枝杆菌，2011年8月采集自湖南张家界
[0054] 拉丁名称：Mycobacterium foruitum
[0055] 保藏号：CGMCC No. 9657
[0056] 保藏日期：2014年9月15日
[0057] 保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0058] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0059] 上述偶发分枝杆菌的保藏条件为：真空冷冻干燥（长期保藏）
[0060] 培养条件为：可以用通用的偶发分支杆菌培养基，25~30°C (优选28°C)在茄子 瓶内斜面培养6~7天。典型的斜面培养基成分：牛肉膏0. 2%、蛋白胨0. 4%、甘油2%、 琼脂粉2% (pH自然）。
[0061] 实施例2 1，2位脱氢酶基因相关的同源交换片段的克隆
[0062] 在野生型的偶发分支杆菌中，克隆到六个与1，2位脱氢酶相关的基因。其序列分 别与 GenBank 登录号 EJZ13173、EJZ14467、EJZ14570、EJZ14836、EJZ16098 和 EJZ16093 所 对应的核酸序列有99 %~100 %的同源性。
[0063] 分别克隆六个基因的内部一部分片段，构建六个基因插入失活质粒。首先根据已 发表的偶发分支杆菌相应序列设计引物（序列分别如SEQ ID No. 1~12所示）：
[0064] 基因 1(EJZ13173)上游引物：5' -AAAGAATTCCGGAGATGCTGTCGTTCGTG
[0065] 基因 1 下游引物：5' -AAAAAGCTTCGCCGGATTCCATCCACTT
[0066] 基因 2(EJZ14467)上游引物：5' -AAAGAATTCTCGAAGTTGTCTGCCTTGACTG
[0067] 基因 2 下游引物：5 ' -AAAAAGCTTCCGCTGGCTGAACCTGATG
[0068] 基因 3(EJZ14570)上游引物：5' -AAAGAATTCGACGGTCTTGCCGGGTTC
[0069] 基因 3 下游引物：5 ' -AAAAAGCTTCGGACGGTCAGTGAGTGGATT
[0070] 基因 4(EJZ14836)上游引物：5' -AAAGAATTCTGTGCCCAGATCGGAAATGC
[0071] 基因 4 下游引物：5' -AAA AAGCTTTGCCTCGCTTCGGCTCAAC
[0072] 基因 5(EJZ16098)上游引物：5' -AAAGAATTCGACACCGACCTGGTGGAGACA
[0073] 基因 5 下游引物：5' -AAA AAGCTITTCAACGTGGCGGCAATC
[0074] 基因 6(EJZ16093)上游引物：5' -AAAGAATTCAGGGTCGGCTGCTTCTG
[0075] 基因 6 下游引物：5' -AAAAAGCTT TTCTCACTTCGGCGGTTC
[0076] 上述引物由上海迈浦生物科技有限公司合成。以保藏号为的野生型偶发分支杆菌 总基因组为模板。使用宝生物公司的Primerstart高保真DNA聚合酶来进行片段的克隆。 PCR条件为：98°C变性10S、65°C退火15S，30个循环，72°C延伸7min。PCR产物上样电泳后， 回收目的条带。回收的目的条带与质粒进行连接，连入PSP72质粒的Hindlll/EcoRI位点， 命名为 pSL-2-1，pSL-2-2, pSL-2-3, pSL-2-4, pSL-2-5 和 pSL-2-6 并测序。各个克隆片段 与 GenBank (登录号：EJZ13173、EJZ14467、EJZ14570、EJZ14836、EJZ16098 和 EJZ16093 所 对应的核酸序列）中序列相比对，同源性大于99%。
[0077] 将同源交换目的片段用同样的酶切位点Hindlll/EcoRI从pSL-2-1，pSL-2-2， pSL-2-3, pSL-2-4, pSL-2-5和pSL-2-6中切出，回收目的片段，将其分别连入Hindlll/ EcoRI酶切位点的pET28a质粒，得到新质粒分别命名为pSL-3-l，pSL-3-2，pSL-3-3， pSL-3-4, pSL-3-5 和 pSL-3-6。
[0078] 实施例3基因插入失活质粒的电转化
[0079] 从保藏号为CGMCC No. 9657的野生型偶发分支杆菌斜面挑取适量菌体与50ml 种子培养基中培养48小时左右，达到对数生长期。将菌液摇瓶取出，倒入50ml离心管， 3800rpm离心15min，离心结束后，用含有10 %甘油洗涤菌体，再3800rpm离心；重复洗 涤、离心1次；将上清液倒掉,分别取菌体约于六个电击杯（200μ 1/个）内，取2μ 1质粒 (pSL-2-1，pSL-2-2, pSL-2-3, pSL-2-4, pSL-2-5 和 pSL-2-6)分别加入电击杯内混匀，电转 仪条件为2. 5kv, 2ms,电击结束后，加入500 μ 1种子培养基，混匀后吸出分别置于小离心管 内，37°C培养箱培养约2小时。将六份电转化产物分别涂含有200 μ g/ml卡那霉素的斜面 培养基平板，37°C培养两周后，挑取阳性转化子。转入6种失活质粒的菌株分别命名为菌株 I~VI，上述菌株的培养和保藏方法同CGMCC No. 9657的野生型偶发分枝杆菌。
[0080] 突变株总DNA的抽提以及基因型的验证方法为：分别挑取六个质粒（PSL-2-1， pSL-2-2, pSL-2-3, pSL-2-4, pSL-2-5和pSL-2-6)的阳性转化子于种子液体培养基中（Kan 200μg/ml)进行抗性验证，30°C，220rpm培养3天后，筛选出可以生长的菌株。取上述可以 在卡那霉素抗性培养液中生长的菌液lml，离心倒去上清，用0. 5ml的STE缓冲液洗涤一 次，并用〇. 5ml的STE缓冲液重悬菌体后，加入溶菌酶（终浓度lmg/ml)，37°C温浴15分钟， 加入0· 4mL蛋白酶K(5mg/mL，用lysis buffer新鲜配制），0· lmLIO% SDS，混匀后迅速放入 70°C水浴15mim，呈澄清。置冰上冷却，加入0. lmL 5M KAc，冰上冷却15min。加入0. 5mL饱 和酚，混匀，加0. 5mL氯仿，混匀，12000rpm，4°C离心20min。用破口的枪头将水相吸出置于 新的离心管，加2倍的无水乙醇，混匀，有团状的DNA出现。将其置于新的离心管，加 lmL70% 乙醇洗涤，将液体倾出，用枪吸净，加50 μ L TE溶解，加 RNase A使终浓度为50 μ g/mL，37°C 温育0. 5小时。
[0081] 以此六个转化阳性菌株的总DNA为模板，分别利用T7启动子通用引物（作为上游 引物）与基因中断质粒同源交换片段下游引物，进行PCR验证。PCR程序：95°C，3min ;94°C， lmin ;55°C，lmin ;72°C，lmin (步骤二到步骤四 30 个循环）；最后 72°C，5min。PCR 产物送 由上海迈浦生物科技有限公司进行序列测定，得到包含有部分质粒片段和基因中断同源交 换片段融合的目的条带，表明基因中断质粒已经插入目的基因内部，将其中断失活。
[0082] 实施例4
[0083] 用实施例3中得到的菌株V (即失活EJZ16098基因的偶发分枝杆菌工程菌）催化 植物留醇生产9 α -羟基雄烯二酮并进行验证。
[0084] 基因工程菌所有培养液灭菌后加入经过滤除菌的卡那霉素，种子培养基中终浓度 为50ppm，发酵培养基中为20ppm。
[0085] 取菌株V (失活其中EJZ16098基因）接种于种子培养基：将20L种子培养基放置 于35L种子罐中，接入一个茄子瓶斜面的菌（斜面面积约为8cmX 8cm)。种子培养基含有蛋 白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5% (均为质量百分比），卡那霉素50ppm，并将pH调整为 7· 0。
[0086] 种子培养条件均为：温度29土 1°C，通气比1:0. 6,转速480rpm，培养96小时。
[0087] 取培养好的种子液，按10%体积比接种于发酵培养液，置于50升发酵罐内发酵 (装料30L)，用来转化植物甾醇。发酵培养液的pH = 8. 5,并含有：黄豆粉0. 1 %，甘油1 %， Na2HP040 . 84 %，ΚΗ2Ρ040 · 45 %，NH4C1 0· 2 %，MgS040 . 03 %，卡那霉素 20ppm，植物甾醇 1 %， 吐温800. 1% (均为质量百分比）。
[0088] 发酵转化培养的条件为：温度29土 1°C，通气比1:0. 6,转速480rpm。
[0089] 转化时间48、72、96、120、144、168小时分别取发酵液，并用等体积乙酸乙酯提取。 用高效液相色谱检测乙酸乙酯相中产物的含量，每毫升乙酸乙酯（相当于每毫升发酵液） 中，如图3所示。不同发酵时间时，野生型菌株与基因工程菌转化生成的产物量对比显示， 发酵时间在72~144小时产量最高。野生型菌株发酵时间超过96小时后，发酵液中9 a -羟 基雄烯二酮的含量继续下降。
[0090] 发酵96小时后取菌株V的发酵液用等体积乙酸乙酯提取，用高效液相色谱检测 乙酸乙酯相中产物的含量，结果如图2中（B)，发酵转化的主要产物为9 a-羟基雄烯二酮 (9a-OH AD)，副产物主要为9a-羟基睾酮（液相色谱图中的d) ;9a-羟基雄烯二酮与 9a-羟基睾酮产量比例在8:1至12:1。转化率达95%以上，生产9a-羟基雄烯二酮的单 耗为1. 8~2. 0,并且选择性在70 %~80%。
[0091] 野生型偶发分枝杆菌（CGMCC No. 9657)发酵96小时后采用同样的工艺条件进 行发酵并检测产物，液相色谱图如图2中（A)，发酵转化的主要产物为9 a -羟基雄烯二酮 (9a-OH AD)，副产物主要为9a-羟基睾酮（液相色谱图中的d) ;9a-羟基雄烯二酮与 9 a -羟基睾酮产量比例在3:1至5:1。转化率达95 %以上，生产9 a -羟基雄烯二酮的单耗 为2. 2~2. 5,并且选择性转化率50 %~60%。
[0092] 转化率％ =转化底物量+投入底物量X 100
[0093] 收率％ =实际产物量+理论产物量X 100
[0094] 选择性％ =收率+转化率X 100
[0095] 单耗=实际产物量+投入底物量
[0096] 以上底物为植物甾醇，产物为9 a -羟基雄烯二酮；转化底物量=投入底物量-剩 余底物量；理论产物量=投入底物量+底物分子量X产物分子量，底物平均分子量414， 产物分子量302。
[0097]用实施例3所获得的其他工程菌代替上述菌株V进行发酵，结果相同。主要产物 为9 a -羟基雄烯二酮，副产物主要为9 a -羟基睾酮；两者摩尔比在8:1至12:1。转化率 达95%以上，生产9 a -羟基雄烯二酮的单耗为1. 8~2. 0,并且选择性在70-80%，效果均 优于野生型偶发分枝杆菌。
[0098] 基因工程菌转化的单耗比原始菌株转化的单耗降低，前者转化中产生的副产物 d(9 a -羟基睾酮）的量比后者下降50%以上，且基因工程菌转化后期产物稳定，不会出现 原始菌株转化后期产物快速降解的现象。与原始菌株相比，基因工程菌具有更佳的性能，采 用基因工程菌转化可以提高生产效率。
【主权项】
1. 转化植物留醇的工程菌的构建方法，其特征在于，使野生型转化植物留醇的偶发分 枝杆菌中的至少一个1，2位脱氢酶基因失活。2. 权利要求1所述转化植物留醇的工程菌的构建方法，其特征在于，所述野生型转化 植物留醇的偶发分枝杆菌为保藏号CGMCC No. 9657的菌株。3. 权利要求1所述转化植物留醇的工程菌的构建方法，其特征在于，所述选自以下 6 个基因中的至少一种：GenBank 登录号为 EJZ13173、EJZ14467、EJZ14570、EJZ14836、 EJZ16098、EJZ16093和所对应的核酸序列或者同源性在99%以上的核酸序列。4. 权利要求3所述转化植物留醇的工程菌的构建方法，其特征在于，所述1，2位脱氢酶 基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1~6所示。5. 权利要求1或2所述转化植物留醇的工程菌的构建方法，其特征在于，通过插入失活 质粒使1，2位脱氢酶基因中断失活。6. 权利要求5所述转化植物留醇的工程菌的构建方法，其特征在于，通过以下方法使 1，2位脱氢酶基因中断失活： (1) 扩增1，2位脱氢酶基因的部分同源序列并插入失活质粒； (2) 将步骤（1)得到的质粒转化保藏号CGMCC No. 9657的野生型偶发分枝杆菌。7. 权利要求5所述转化植物留醇的工程菌的构建方法，其特征在于，所述的部分同源 序列以保藏号为CGMCC No. 9657的野生型偶发分枝杆菌基因组DNA为模板，用以下各组引 物中的至少一组扩增得到的片段或者与该片段相同的核苷酸序列： (a) 基因 EJZ13173 上游引物：5' -AAAGAATTCCGGAGATGCTGTCGTTCGTG 基因 EJZ13173 下游引物：5' -AAAAAGCTTCGCCGGATTCCATCCACTT (b) 基因 EJZ14467 上游引物：5' -AAAGAATTCTCGAAGTTGTCTGCCTTGACTG 基因 EJZ14467 下游引物：5' -AAAAAGCTTCCGCTGGCTGAACCTGATG (c) 基因 EJZ14570 上游引物：5' -AAAGAATTCGACGGTCTTGCCGGGTTC 基因 EJZ14570 下游引物：5' -AAAAAGCTTCGGACGGTCAGTGAGTGGATT (d) 基因 EJZ14836 上游引物：5' -AAAGAATTCTGTGCCCAGATCGGAAATGC 基因 EJZ14836 下游引物：5' -AAA AAGCTTTGCCTCGCTTCGGCTCAAC (e) 基因 EJZ16098 上游引物：5' -AAAGAATTCGACACCGACCTGGTGGAGACA 基因 EJZ16098 下游引物：5' -AAA AAGCTITTCAACGTGGCGGCAATC (f) 基因 EJZ16093 上游引物：5' -AAAGAATTCAGGGTCGGCTGCTTCTG 基因 EJZ16093 下游引物：5' -AAAAAGCTT TTCTCACTTCGGCGGTTC。8. -种转化植物留醇的工程菌，其特征在于，为偶发分枝杆菌，通过权利要求1~7所 述的方法构建。9. 权利要求8所述的偶发分枝杆菌用于催化植物留醇转化为9 α -羟基雄烯二酮。10. -种制备9 α -羟基雄烯二酮的方法，其特征在于，以植物留醇为起始原料，用权利 要求1所述的偶发分枝杆菌发酵催化植物留醇生成9 α -羟基雄烯二酮。11. 权利要求10所述制备9 α -羟基雄烯二酮的方法，其特征在于，发酵条件为：将权 利要求8所述的工程菌接种于含有植物留醇的发酵培养液中，25~34°C下通入空气并搅 拌；发酵转化时间为48~168小时。12. 权利要求11所述制备9 α -羟基雄烯二酮的方法，其特征在于，将工程菌接种于种 子培养液或种子培养基，25~34°C下通入空气并搅拌，培养48~120小时后再接种于发酵 培养液。13.权利要求11所述制备9 a -羟基雄烯二酮的方法，其特征在于，发酵转化时间为 84~120小时或136~168小时。
【文档编号】C12N1/21GK105838730SQ201510016289
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月13日
【发明人】薛建萍, 姚再男, 邵雷, 唐璐敏, 蒲甜, 范锦锦, 朱健, 丁林富, 卜桂琴
【申请人】上海市农药研究所有限公司, 薛建萍, 姚再男