Cas9 介导的香石竹基因编辑载体和应用
【专利摘要】本发明涉及Cas9介导的香石竹基因编辑载体和应用，首先，构建含香石竹目标基因靶位点的CRISPR?Cas9系统，将Cas9表达载体导入根癌农杆菌C58菌株，再将香石竹叶片的基部放入预培养培养基，22±2℃光照培养3?4天，将含Cas 9表达载体的农杆菌活化，再将预培养后的外植体浸入已活化备好的农杆菌菌液中20?30分钟，吸干菌液，接着转入共培养基中，22±2℃暗培养3?4天，再转置到筛选培养基培养，22±2℃光照培养，分化出再生芽，将再生芽转入增殖培养基中进行增殖筛选培养，并检测阳性转基因再生植株，对靶位点进行测序，检测香石竹目标基因靶点的突变株系。
【专利说明】
Cas9介导的香石竹基因编辑载体和应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体设及一种化s9介导的香石竹基因编辑载体 和应用。
【背景技术】
[0002] RNAi干扰技术和基因编缉技术是研究基因功能方法，RNAi介导的基因下调是减少 细胞中目的基因表达产物的最常用方法，然而，RNAi无法完全去除目的基因。与此相反，基 因组编辑技术改变遗传密码，引起基因敲除，W致完全缺失基因功能。目前，有两种技术可 用于高效地形成双链断裂：TALENUranscription Activator-Uke Effector Nucleases) 和CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeat Associated)蛋 白。TALEN是由带特异结合位点的DNA结合蛋白和限制性内切酶Fokl融合而成的嵌合体蛋 白。CRISPR-化S的作用机理是一个带特异结合位点的sgRNA(single guide RNA)引导化s9 核酸酶到祀位点。两种技术都是运用核酸酶来切割祀序列，所得到的双链断裂或被修复或 导致细胞死亡。TALEN技术构建体系比较麻烦，化s9技术构建体统简单。
[0003] 香石竹别名康乃馨、廳香石竹，石竹科，石竹属，宿根草本植物。香石竹是著名的 "母亲节"之花。在香石竹中，目前有学者利用RNAi干扰技术研究香石竹基因功能，但转基因 的效率低，且不能彻底敲掉目标基因。因此如何克服现有技术的不足是目前基因工程技术 领域亟需解决的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供了一种化s9介导的香石竹 基因编辑载体，与采用该编辑载体定向突变香石竹目标基因的方法，本发明利用化s9技术， 在香石竹中实现特定位点的基因编缉，从而造成基因序列永久的突变，为研究基因功能奠 定基础。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： Cas9介导的香石竹基因编辑载体，包括Atue启动子调控SgRNA表达的表达框Atue-SgRNA和2 X 35S启动子调控化s9表达的表达框2 X 35SH：as9。
[0006] 本发明还要求保护所述化s9介导的香石竹基因编辑载体在香石竹基因功能研究 或香石竹基因工程育种中的应用。
[0007] 一种定向突变香石竹基因的方法，采用上述化s9介导的香石竹基因编辑载体，包 括W下步骤： 步骤(1)，构建化S 9介导的香石竹基因编辑载体： 将Atue启动子调控含祀序列的SgRNA表达的表达框和2 X 35S启动子调控化s9表达的表 达框通过T4连接酶连入PCAMBIA1301载体中，得到化S 9表达载体，即Cas 9介导的香石竹基 因编辑载体;所述的Cas 9表达载体的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示；祀序列通过重叠 PCR法插入Atue-SgRNA表达框； 步骤(2)，农杆菌转化香石竹： 采用冻融法将步骤（1)构建好的化s9表达载体转化到农杆菌中，然后将含化s9表达载 体的农杆菌与相同体积的50 V/V %甘油水溶液混合均匀，得到含化s9表达载体的农杆菌菌 液，置于-80°C冰箱内保存； 步骤(3 )，香石竹外植体预培养： 取无菌的香石竹组培苗最顶端的1-3节叶片，将叶片的基部沿垂直于基部轴向切成2-5 毫米的薄片，接种于预培养培养基中，22±2°C条件下光照培养3-4天，得到预培养的叶片； 所述的预培养培养基为MS巧DZ 0.1-0.5mg/L +NAA 0.1-0.5mg/L，薦糖30g/L，琼脂9-llg/L，pH为5.8; 步骤(4)，农杆菌菌液培养： 将步骤(2)得到的含化s9表达载体的农杆菌菌液20-5化L加入到添加卡那霉素和利福 平的YEB液体培养基中，于28°C下，180-200 rmp振荡培养16-20小时，得到活化的农杆菌菌 液;所述的活化的农杆菌菌液ODsoo值为0.5-0.8;所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液体 培养基是在Y邸液体培养基中添加卡那霉素至终浓度为50-80mg/L，且同时添加利福平至终 浓度为 50-80mg/l; 步骤巧），香石竹遗传转化： 在摇床上，将步骤(3)预培养的叶片浸入步骤(4)得到的活化的农杆菌菌液中，W50-80 rmp的速度振荡，20-30分钟后取出；将叶片放在灭过菌的滤纸上吸干多余的菌液，然后将叶 片转入共培养的培养基中，在22±2°C条件下暗培养3-4天，再转入筛选培养基中，进行筛选 培养，40-60天更换培养基一次，待分化出丛生的再生芽，将再生芽转入增殖培养基中进行 增殖筛选培养，得到转基因再生植株； 所述的共培养的培养基为MS巧DZ 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+AS 20-30 mg/L，薦 糖30g/L，琼脂 9-1 Ig/L，抑为5.8; 所述的筛选培养基为 MS 巧 DZ 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+ Cef 300-400 mg/L+ Hyg 6-lOmg/L，薦糖30g/L，琼脂9-1 Ig/L，抑为5.8。
[000引所述的增殖培养基为MS+BA O-O.lmg/L+NAA O-O.lmg/L+ Hyg 6-lOmg/L，薦糖 30邑/1，琼脂9-11邑/1，抑为5.8; 步骤(6)，香石竹阳性转基因再生植株的验证： 提取步骤巧)增殖筛选培养得到的转基因再生植株DNA，采用PCR法扩增化S 9片断（可 扩增全部化S 9片断，也可扩增部分化S 9片断），能扩增出化S 9片断的植株为阳性转基因 再生植株;然后在祀位点两端设计引物，扩增阳性转基因再生植株含目标祀点的DNA片断， 测序法检测祀点的编辑情况。
[0009] 进一步，优选的是所述农杆菌选用根癌农杆菌巧8。
[0010] 进一步，优选的是步骤（1)的构建化S 9介导的香石竹基因编辑载体的具体方法如 下： 采用KpnI/Sall 双酶切AtU6-26SK质粒，Sall/EcoRI 双酶切35S-Cas9-SK质粒和KpnI/ EcoRI双酶切PCAMBIA1301质粒，并分别回收=种双酶切产物，采用T4连接酶在16°C下将= 种的双酶切产物连接16小时，采用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR法筛选阳性 克隆，并进行测序验证，得到核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示的化S 9表达载体。
[0011] 本发明与现有技术相比，其有益效果为： 本发明利用新型的基因编缉系统CRISPR-Cas系统，对香石竹目标基因进行定向编缉， 可W获得基因功能缺失的突变体，为香石竹基因功能的研究及利用转基因技术培育优良性 状的种质打下基础。
[0012] 本发明在香石竹中建立了一种定向突变目标基因的方法，与RNAi技术相比，实现 在香石竹中特定位点的定向基因编缉，从而造成基因序列永久的缺失;Cas 9技术与TALEN 技术相比，具有操作简单，耗时较短，可缩短一倍的时间，费用较低，费用可节省60-70%，运 为基因功能的研究W及利用转基因技术来培育新品种奠定基础。
【附图说明】
[0013] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图： 图1利用重叠 PCR技术拼接含祀序列的SgRNA表达盒电泳图。A : 1-2为PrimerFl和 Primer2105Rl引物扩增SgRNA表达盒部分片断；B: 1-2为Primer2105F2和PrimerR2引物扩 增SgRNA表达盒部分片断；C: 1-2为引物PrimerFl和PrimerR2进行重叠 PCR扩增含2105S 个祀点的SgRNA表达盒。MiMarker。
[0014] 图2为化S 9载体构建过程示意图； 图3为含目标祀点的Cas 9载体PCR鉴定结果电泳图；其中，M:Marker; 1 -4:4个单克隆 SgRNA表达盒PCR鉴定;5-8:4个单克隆化s9表达盒PCR鉴定;9-12:4个单克隆潮霉素基因 PCR 鉴定。
[001引图4农杆菌中Cas9表达盒部分片断的PCR鉴定结果电泳图；其中，M:Marker;l-4:4 个单克隆化s9表达盒PCR鉴定;5:水对照。
[0016]图5为2105化S 9载体的转基因再生植株PCR鉴定结果电泳图；其中，1-12:12株增 殖筛选培养得到的转基因再生植株PCR鉴定;WT:野生型；一：阴性水对照;+ :阳性大肠杆菌 液对照;M:Marker. 图6为转基因阳生再生植株祀点DNA片断扩增结果电泳图，1-7:7株阳性植株祀点DNA片 断扩增产物;8:水对照。
[0017] 图7为编缉祀点的测序图，序列图显示N〉S和I〉M突变；图中标出protospacer和 PAM位置，W及氨基酸编码的序列。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0019] 本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发 明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过购买获得的 常规产品。
[0020] AtU6-26SK和35S-化S9-SK质粒由上海植物逆境生物学研究中屯、朱健康研究员馈 赠，S排NA表达盒和Cas9表达盒的序列见文章 （Feng Z，Zhang B，Ding W，Liu X，Yang D, Wei P, Cao F， Zhu S, Zhang F， Mao Y et al. 2013. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/C^s system. Cell Res 23(10): 1229-1232.)0
[0021] 如果没有特别指出，百分号为质量百分数，溶液的溶剂为水。
[0022] 下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施 例。
[0023] 实施例1 (1)构建化S 9介导的香石竹基因编辑载体 1)采用重叠 PCR扩增含2105祀点的SgRNA表达盒。
[0024] 第一轮PCR: WAtU6-26SK为模板，分别 WPrime巧 1 和Primer2105Rl、Primer2105F2 和PrimerR2为引物，用TransStad化9〇臟化Iymerase进行特异PCR扩增出500多bp的片 断和100多bp的二个片断。扩增体系皆为50微升， 其中PCR反应体系：上下游引物各为1微升，dNTP 4微升，模板DNA 1微升，TransStart I^qDNA Polymerase 1微升，IOXbuffer 5微升，补加双蒸水至50微升。
[0025] 反应条件为94 °C预变性10分钟，94 °C 30秒，64 °C 30秒，72 °C 30分钟，共 35个循环，72 °C再延伸10分钟。
[0026] 第二轮PCR: W扩增出500多bp的片断和100多bp的二个片断为模板，用引物 PrimerFl和PrimerRS进行重叠聚合酶链式反应，扩增含有目的片断的S曲NA表达盒。反应 分两步进行，第一步，在50微升体系中加500多bp的片断和100多bp的二个片断各1微升， dNTP 4微升，TransStart I'aqDNAPolymerase 1 微升，10 X buffer 5微升，加水至50微升， 反应条件为94 °C预变性10分钟，94 °C 30秒，64 °C 30秒，72 °C30秒，共10个循环，72 °C再延伸10分钟；第二步:在第一步50微升反应体系中补加物Prime巧1和PrimerR2引物各 1微升，反应循环为30个。（图1) 将含有2105祀位点序列的DNA片断连入祀ASY-Blunt Cloning Vector克隆载体(北京 全式金），挑选阳性克隆并测序。测序与祀位点序列一致的为阳性克隆。
[0027] 2)构建化S 9和SgRNA表达盒的双价表达载体 提取 DcPSl 基因含 2105 祀点的 AtU6-26SK、35S-Cas9-SK 和 PCAMBIA1301 质粒。
[00巧]0。？51基因2105祀点的核巧酸序列为5'-旨1:1:。1旨1:。曰1曰旨旨旨。旨曰1:1旨旨旨旨-3'（56〇10 NO.2)2105祀点为沈Q ID NO. 1 的第 16646-第 16665碱基。
[00巧]采用KpnI/Sall 双酶切AtU6-26SK质粒，Sall/EcoRI 双酶切35S-Cas9-SK质粒和 KpnI/EcoRI双酶切PCAMBIA1301质粒。回收双酶切产物，T4连接酶(肥B)16°C连接16小时， 连接产物转化大肠杆菌D册a感受态细胞（图2)。挑取白色大肠杆菌，放入2毫升氨节抗性的 液体培养基内，于37°C 200转/分振荡培养16小时，得到黄色的菌液。
[0030] 所述的氨节抗性的液体培养基的制备方法是:将10克膜蛋白腺、5克酵母粉和10克 化Cl加入到水中，并定容至1升，调pH为7.0,于121°C下，高压灭菌20min，冷却后加入100毫 克/毫升的氨节青霉素水溶液1毫升，即得。
[0031] 采用PCR鉴定阳性克隆，分别在SgRNA表达盒、Cas9表达盒和潮霉素憐酸转移酶 (Hyg)基因上设计1对引物。SgRNA表达盒部分片断扩增采用的引物为ATU6-26SK-1IF和 ATU6-26SK-645R;Cas9表达盒部分片断扩增所采用的引物为35SCAS9-701F和35SCAS9-1460R;潮霉素憐酸转移酶(Hyg)基因部分片断扩增HYG-35F和HYG-727R; PCR反应体系： 菌液1微升；
[0032] Ps: 6种引物的浓度均为10微摩尔/升，加入的体积均为I微升 PCR反应条件：95 °C 5分钟，95 °C 30秒，58 °C 30秒，72 °C 1分钟，35个循环，72 °C 5分钟。
[0033] 琼脂糖凝胶电泳观察结果，S对引物均扩增出目地条带的为1个阳性克隆（图3)。 良 PATU6-26SK-11F 和 ATU6-26SK-645R 引物扩增出 63 加 P 的条带，35SCAS9-701F 和 35SCAS9-1460R引物扩增出760bp的条带，HYG-35F和HYG-727R引物引物扩增出693bp的条带。
[0034] 测序鉴定，选取=对引物扩增片断大小正确的3个阳性克隆送去上海捷瑞生物技 术有限公司测序，使用的测序引物为ATU6-26SK-645R，所测序列与2105祀点碱基序列相同 的克隆为阳性克隆。
[003引表r引物的序列。
[0036] 其中FP为上游引物，RP为下游引物。
[0037] (2)化s9表达载体转化农杆菌 采用冻融法将构建好的化S 9表达载体转入巧8农杆菌。具体操作如下：向冰上刚融化 的50微升农杆菌感受态细胞中加入1微克化S 9表达载体质粒DNA，混匀后冰上放置30分钟， 液氮速冻5分钟，37 °C水浴3分钟至全融，冰上放置2分钟，加入到1毫升Y邸液体培养基中，28 °C，200转/分恢复培养3小时，5000转/分离屯、3分钟，收集菌体，均匀涂于事先加有50毫克/ 升卡那抗性和50毫克/升利福平的Y邸平板上，28°C倒置避光培养2天。
[0038] 所述的Y邸液体培养基的制备方法是将5克膜蛋白腺、1克酵母粉、5克薦糖和0.5克 MgS化，一起加入到水中，并采用化OH调节抑，最终定容至1升，抑为7.2-7.5，再于12rC高压 灭菌20分钟，即得。
[0039] 上述卡那抗性和利福平的Y邸平板的制备方法是将5克膜蛋白腺、1克酵母粉、5克 薦糖、O . 5克MgS化和琼脂1.5克，一起加入到水中，调抑，定容至100毫升，抑为7.2-7.5，再 于12rC高压灭菌20分钟，接着冷却到60°C时加入50毫克/毫升的卡那霉素水溶液100微升 和50毫克/毫升利福平水溶液100微升，倒平板，即得 从平板上随机挑取10个单菌落，分别接种于50毫升含50毫克/升卡那抗性和50毫克/升 利福平的YEB液体培养基中，该含卡那抗性和利福平的YEB液体培养基的制备方法是:将5克 膜蛋白腺、1克酵母粉、5克薦糖和0.5克MgS〇4，一起加入到水中，并采用化OH调节pH，最终 定容至1升，抑为7.2-7.5，再于12rC高压灭菌20分钟，冷却后加入50毫克/毫升的卡那霉素 水溶液1毫升和50毫克/毫升利福平水溶液1毫升，即得。
[0040] 28°C，200转/分恒溫振荡培养2天，取少量菌液进行PCR扩增鉴定。
[0041 ] PCR反应体系：
[0042] PCR反应条件：95 °C 5分钟，95 °C 30秒，58 °C 30 秒，72 °C 1 分钟，35 个循 环，72 °C 5分钟。
[0043] PCR扩增鉴定结果（图4)。
[0044] 将鉴定的化S 9表达载体的农杆菌与相同体积的50 V/V %甘油水溶液混合均匀， 置于-80 °C冰箱内保存。
[0045] (3)香石竹外植体预培养 在超净工作台上，取无菌的香石竹组培苗'马斯特'叶片，用綴子小屯、撕下最顶端1-3节 叶片，将叶片的基部横切成2-5毫米的薄片，薄层背面朝下接种于MS巧DZ(苯基嚷二挫基脈） 0.5 111邑/1+酷4(糞乙酸)0.5 111邑/1，薦糖30邑/1，琼脂9-11邑/1，抑为5.8预培养培养基中， 24 °C条件下光照培养4天。
[0046] (4)农杆菌菌液培养 吸取含化S 9表达载体的农杆菌菌液20化接种于30毫升Y邸液体培养基摇菌培养，YEB 液体培养基中添加终浓度50毫克/升卡那霉素和终浓度50毫克/升利福平，28°C条件下，180 rmp振荡培养16小时，当ODsoo为0.5时，得到含化S 9表达载体的农杆菌菌液，用于农杆菌浸 染。
[0047] (5)香石竹遗传转化 将预培养的叶片浸入到含化S 9表达载体的农杆菌菌液30分钟，此过程放在摇床上，80 rmp不断振荡W使菌液与外植体充分接触。将叶片放在灭过菌的滤纸上吸干多余的菌液，转 入MS+ TDZ 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L +AS(乙酷下香酬）20 mg/L，薦糖30 g/L，琼脂 11 g/ L，pH为5.8的共培养的培养基中，在24°C条件下暗培养4天，再转入MS+ TDZ 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L + 400 mg/L Cef(头抱氨嚷朽）+ 6 mg/L Hyg，薦糖30 g/L，琼脂 11 g/L，pH为 5.8筛选培养基中，进行筛选培养，60天更换成新的筛选培养基，待分化出再生芽，将再生芽 转入MS+BA(6-节氨基嚷岭）0.1 mg/L +NAA 0.1 mg/L + 6 mg/L Hyg,薦糖30 g/L，琼脂 11g/L，抑为5.8增殖培养基中进行增殖筛选培养。
[004引（6 )香石竹阳性转基因再生植株的验证 香石竹化基因化S 9表达载体采用PCR法验证阳性转基因再生植株和测序法检测对 祀点是否切割。首先提取增殖筛选培养得到的转基因再生植株的DNA进行PCR扩增；
[0049] PCR反应条件：95 °C 5分钟，95 °C 30秒，58 °C 30 秒，72 °C 1 分钟，35 个循 环，72 °C 5分钟。
[0050] 引物扩出含目的条带(与' + '泳道扩增条带相一致的条带）的片断为阳性转基因再 生植株(图5)，1、7、8、9泳道能扩出条带，为阳性转基因再生植株。对93株增殖筛选培养得到 的转基因再生植株进行筛选，共检测到27株阳性转基因再生植株，占到所有再生植株的 29〇/〇。
[0化1 ] W阳性转基因再生植株基因组DNA为模板进行PCR扩增；
[0052] PCR反应条件：95 °C 5分钟，95 °C 30秒，58 °C 30 秒，72 °C 1 分钟，35 个循 环，72 °C 5分钟。
[0053] 将扩增得到的含祀序列的560bp的DNA片断（图6)，克隆到PMD18T载体(Takara)并 进行测序检测。测序结果发现其中有4株植株的祀位点出现了单碱基突变，其中，两株发生 氨基酸的突变，两株未产生氨基酸的变异，Cas 9表达载体对祀点进行了编缉，产生了基因 突变(图7)。
[0054] 实施例2 一种定向突变香石竹基因的方法，采用化s9介导的香石竹基因编辑载体，包括W下步 骤： 步骤(1)，构建化S 9介导的香石竹基因编辑载体： 将Atue启动子调控SgRNA表达的表达框和2 X 35S启动子调控化s9表达的表达框通过T4 连接酶连入PCAMBIA1301载体中，得到化S 9表达载体;所述的化S 9表达载体的核巧酸序列 如沈Q ID NO. 1所示； 步骤(2)，农杆菌转化香石竹： 采用冻融法将步骤（1)构建好的化s9表达载体转化到农杆菌中，然后将含化s9表达载 体的农杆菌与相同体积的50 V/V %甘油水溶液混合均匀，得到含化s9表达载体的农杆菌菌 液，置于-80°C冰箱内保存； 步骤(3 )，香石竹外植体预培养： 取无菌的香石竹组培苗最顶端的1节叶片，将叶片的基部沿垂直于基部轴向切成2毫米 的薄片，接种于预培养培养基中，22±2°C条件下光照培养3天，得到预培养的叶片； 所述的预培养培养基为MS巧DZ 0.1 mg/L +NAA 0.1 mg/L，薦糖30 g/L，琼脂9 g/L，pH 为 5.8; 步骤(4)，农杆菌菌液培养： 将步骤(2)得到的含化s9表达载体的农杆菌菌液20iiL加入到添加卡那霉素和利福平的 YEB液体培养基中，于28°C下，200rmp振荡培养16小时，得到活化的农杆菌菌液;所述的活化 的农杆菌菌液ODsoo值为0.5;所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基是在YEB液体 培养基中添加卡那霉素至终浓度为80mg/L，且添加利福平至终浓度为80mg/l; 步骤巧），香石竹遗传转化： 在摇床上，将步骤（3)预培养的叶片浸入步骤(4)得到的活化的农杆菌菌液中，W50 rmp的速度振荡，30分钟后取出；将叶片放在灭过菌的滤纸上吸干多余的菌液，然后将叶片 转入共培养的培养基中，在22±2°C条件下暗培养3天，再转入筛选培养基中，进行筛选培 养，40天更换培养基一次，待分化出丛生的再生芽，将再生芽转入增殖培养基中进行增殖筛 选培养，得到转基因再生植株； 所述的共培养的培养基为MS巧DZ O.lmg/L+NAA O.lmg/L+AS 20mg/L，薦糖30g/L，琼脂 9邑/1，抑为5.8; 所述的筛选培养基为MS巧DZ O.lmg/L+NAA O.lmg/L+ Cef 300 mg/L+ Hyg 6mg/L，薦 糖30邑/1，琼脂9邑/1，抑为5.8。
[0055]所述的增殖培养基为MS+BA Omg/L+NAA Omg/L+ Hyg 6mg/L，薦糖30g/L，琼脂9g/ 1，抑为5.8; 步骤(6)，香石竹阳性转基因再生植株的验证： 提取步骤巧)增殖筛选培养得到的转基因再生植株DNA，采用PCR法扩增化S 9片断，能 扩增出化S 9片断的植株为阳性转基因再生植株;然后在祀位点两端设计引物，扩增阳性转 基因再生植株含目标祀点的DNA片断，测序法检测祀点的编辑情况。
[0056] 实施例3 一种定向突变香石竹基因的方法，采用化s9介导的香石竹基因编辑载体，包括W下步 骤： 步骤(1)，构建化S 9介导的香石竹基因编辑载体： 采用KpnI/Sall 双酶切AtU6-26SK质粒，Sall/EcoRI 双酶切35S-Cas9-SK质粒和KpnI/ EcoRI双酶切PCAMBIA1301质粒，并分别回收=种双酶切产物，采用T4连接酶在16°C下将= 种的双酶切产物连接16小时，采用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR法筛选阳性 克隆，并进行测序，得到核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示的化S 9表达载体； 步骤(2)，农杆菌转化香石竹： 采用冻融法将步骤（1)构建好的化s9表达载体转化到农杆菌中，然后将含化s9表达载 体的农杆菌与相同体积的50 V/V %甘油水溶液混合均匀，得到含化s9表达载体的农杆菌菌 液，置于-80°C冰箱内保存； 步骤(3 )，香石竹外植体预培养： 取无菌的香石竹组培苗最顶端的3节叶片，将叶片的基部沿垂直于基部轴向切成5毫米 的薄片，接种于预培养培养基中，22±2°C条件下光照培养4天，得到预培养的叶片； 所述的预培养培养基为MS巧DZ 0.3mg/L +NAA 0.3mg/L，薦糖30g/L，琼脂llg/L，抑为 5.8; 步骤(4)，农杆菌菌液培养： 将步骤(2)得到的含化s9表达载体的农杆菌菌液SOiiL加入到添加卡那霉素和利福平的 YEB液体培养基中，于28°C下，190rmp振荡培养20小时，得到活化的农杆菌菌液;所述的活化 的农杆菌菌液ODsoo值为0.8;所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基是在YEB液体 培养基中添加卡那霉素至终浓度为50mg/L，且添加利福平至终浓度为50mg/l; 步骤巧），香石竹遗传转化： 在摇床上，将步骤（3)预培养的叶片浸入步骤(4)得到的活化的农杆菌菌液中，W80 rmp的速度振荡，20分钟后取出；将叶片放在灭过菌的滤纸上吸干多余的菌液，然后将叶片 转入共培养的培养基中，在22±2°C条件下暗培养4天，再转入筛选培养基中，进行筛选培 养，60天更换培养基一次，待分化出丛生的再生芽，将再生芽转入增殖培养基中进行增殖 筛选培养，得到转基因再生植株； 所述的共培养的培养基为MS巧DZ 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+AS 30 mg/L，薦糖30g/L，琼 脂11邑/1，抑为5.8; 所述的筛选培养基为MS+TDZ 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+ Cef 400 mg/L+ Hyg lOmg/L，薦 糖30邑/1，琼脂11邑/1，抑为5.8。
[0057]所述的增殖培养基为MS+BA O.lmg/L+NAA O.lmg/L+ Hyg lOmg/L，薦糖30g/L，琼 脂11邑/1，抑为5.8; 步骤(6)，香石竹阳性转基因再生植株的验证： 提取步骤巧)增殖筛选培养得到的转基因再生植株DNA，采用PCR法扩增化S 9片断，能 扩增出化S 9片断的植株为阳性转基因再生植株;然后在祀位点两端设计引物，扩增阳性转 基因再生植株含目标祀点的DNA片断，测序法检测祀点的编辑情况。
[0化引实施例4 一种定向突变香石竹基因的方法，采用化s9介导的香石竹基因编辑载体，包括W下步 骤： 步骤(1)，构建化S 9介导的香石竹基因编辑载体： 采用KpnI/Sall 双酶切AtU6-26SK质粒，Sall/EcoRI 双酶切35S-Cas9-SK质粒和KpnI/ EcoRI双酶切PCAMBIA1301质粒，并分别回收=种双酶切产物，采用T4连接酶在16°C下将= 种的双酶切产物连接16小时，采用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR法筛选阳性 克隆，并进行测序，得到核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示的化S 9表达载体； 步骤(2)，农杆菌转化香石竹： 采用冻融法将步骤（1)构建好的化s9表达载体转化到农杆菌中，然后将含化s9表达载 体的农杆菌与相同体积的50 V/V %甘油水溶液混合均匀，得到含化s9表达载体的农杆菌菌 液，置于-80°C冰箱内保存； 步骤(3 )，香石竹外植体预培养： 取无菌的香石竹组培苗最顶端的2节叶片，将叶片的基部沿垂直于基部轴向切成4毫米 的薄片，接种于预培养培养基中，22±2°C条件下光照培养3.5天，得到预培养的叶片； 所述的预培养培养基为MS巧DZ 0.2mg/L +NAA 0.2mg/L，薦糖30g/L，琼脂lOg/L，抑为 5.8; 步骤(4)，农杆菌菌液培养： 将步骤(2)得到的含化s9表达载体的农杆菌菌液40iiL加入到添加卡那霉素和利福平的 YEB液体培养基中，于28°C下，ISOrmp振荡培养18小时，得到活化的农杆菌菌液;所述的活化 的农杆菌菌液ODsoo值为0.7;所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基是在YEB液体 培养基中添加卡那霉素至终浓度为60mg/L，且添加利福平至终浓度为60mg/l; 步骤巧），香石竹遗传转化： 在摇床上，将步骤（3)预培养的叶片浸入步骤(4)得到的活化的农杆菌菌液中，W66 rmp的速度振荡，25分钟后取出；将叶片放在灭过菌的滤纸上吸干多余的菌液，然后将叶片 转入共培养的培养基中，在22±2°C条件下暗培养3.7天，再转入筛选培养基中，进行筛选培 养，50天更换培养基一次，待分化出丛生的再生芽，将再生芽转入增殖培养基中进行增殖筛 选培养，得到转基因再生植株； 所述的共培养的培养基为MS巧DZ 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+AS 25 mg/L，薦糖30g/L，琼 脂9.5邑/1，抑为5.8; 所述的筛选培养基为MS巧DZ 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+ Cef 380 mg/L+ Hyg 8mg/L，薦 糖30g/L，琼脂 9.8g/L，pH为5.8。
[0059] 所述的增殖培养基为MS+BA 0.06mg/L+NAA 0.08mg/L+ Hyg 7mg/L，薦糖30g/L，琼 脂10.5邑/1，抑为5.8; 步骤(6)，香石竹阳性转基因再生植株的验证： 提取步骤巧)增殖筛选培养得到的转基因再生植株DNA，采用PCR法扩增化S 9片断，能 扩增出化S 9片断的植株为阳性转基因再生植株;然后在祀位点两端设计引物，扩增阳性转 基因再生植株含目标祀点的DNA片断，测序法检测祀点的编辑情况。
[0060] W上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，运些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。
[0061 ] 序列表
【主权项】
1 .Cas9介导的香石竹基因编辑载体，其特征在于：包括AtU6启动子调控sgRNA表达的 表达框AtU6-sgRNA和2 X 35S启动子调控Cas9表达的表达框2 X 35S-Cas9。2. 权利要求1任一项所述Cas9介导的香石竹基因编辑载体在香石竹基因功能研究或 香石竹基因工程育种中的应用。3. -种定向突变香石竹基因的方法，采用权利要求1所述的Cas9介导的香石竹基因编 辑载体，其特征在于，包括以下步骤： 步骤(1)，构建Cas 9介导的香石竹基因编辑载体： 将AtU6启动子调控含靶序列的sgRNA表达的表达框和2X35S启动子调控Cas9表达的表 达框通过T4连接酶连入PCAMBIA1301载体中，得到Cas 9表达载体;所述的Cas 9表达载体的 核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示;靶序列通过重叠 PCR法插入AtU6-sgRNA表达框； 步骤(2 )，农杆菌转化香石竹： 采用冻融法将步骤（1)构建好的Cas9表达载体转化到农杆菌中，然后将含Cas9表达载 体的农杆菌与相同体积的50 V/V %甘油水溶液混合均匀，得到含Cas9表达载体的农杆菌菌 液，置于-80 °C冰箱内保存； 步骤(3 )，香石竹外植体预培养： 取无菌的香石竹组培苗最顶端的1-3节叶片，将叶片的基部沿垂直于基部轴向切成2-5 毫米的薄片，接种于预培养培养基中，22±2°C条件下光照培养3-4天，得到预培养的叶片； 所述的预培养培养基为MS+TDZ 0.1-0.5mg/L +NAA 0·l-0·5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9-llg/L，pH为5·8; 步骤(4 )，农杆菌菌液培养： 将步骤(2)得到的含Cas9表达载体的农杆菌菌液20-50yL加入到添加卡那霉素和利福 平的YEB液体培养基中，于28°C下，180-200 rmp振荡培养16-20小时，得到活化的农杆菌菌 液;所述的活化的农杆菌菌液OD600值为0.5-0.8;所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液体 培养基是在YEB液体培养基中添加卡那霉素至终浓度为50-80mg/L，且同时添加利福平至终 浓度为 50-80mg/L; 步骤(5)，香石竹遗传转化： 在摇床上，将步骤(3)预培养的叶片浸入步骤(4)得到的活化的农杆菌菌液中，以50-80 rmp的速度振荡，20-30分钟后取出；将叶片放在灭过菌的滤纸上吸干多余的菌液，然后将叶 片转入共培养的培养基中，在22±2°C条件下暗培养3-4天，再转入筛选培养基中，进行筛选 培养，40-60天更换培养基一次，待分化出丛生的再生芽，将再生芽转入增殖培养基中进行 增殖筛选培养，得到转基因再生植株； 所述的共培养的培养基为MS+TDZ 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+AS 20-30 mg/L，蔗 糖30g/L，琼脂 9-1 lg/L，pH为5 · 8; 所述的筛选培养基为MS+TDZ 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+ Cef 300-400 mg/L+ Hyg 6-10mg/L，鹿糖30g/L，琼脂9-llg/L，pH为5.8; 所述的增殖培养基为MS+BA 〇-〇.lmg/L+NAA 〇-〇.lmg/L+ Hyg 6-10mg/L，蔗糖30g/L， 琼脂9-118/1，？!1为5.8; 步骤(6)，香石竹阳性转基因再生植株的验证： 提取步骤(5)增殖筛选培养得到的转基因再生植株DNA，采用PCR法扩增Cas 9片断，能 扩增出Cas 9片断的植株为阳性转基因再生植株;然后采用PCR法扩增阳性转基因再生植株 含靶序列的DNA片断，测序法检测靶序列的编辑情况。4. 根据权利要求3所述的定向突变香石竹目标基因的方法，其特征在于:所述农杆菌选 用根癌农杆菌C58。5. 根据权利要求3所述的定向突变香石竹目标基因的方法，其特征在于：步骤（1)的构 建Cas 9介导的香石竹基因编辑载体的具体方法如下： 采用KpnI/Sall双酶切含靶序列的AtU6-26SK质粒，Sall/EcoRI双酶切35S-Cas9-SK 质粒和KpnI/EcoRI双酶切PCAMBIA1301质粒，并分别回收三种双酶切产物，采用T4连接酶 在16°C下将三种的双酶切产物连接16小时，采用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过 PCR法筛选阳性克隆，并进行测序验证，得到核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的Cas 9表达 载体。
【文档编号】C12N15/84GK105838733SQ201610333623
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】周旭红, 朱健康, 苏艳, 王继华, 李姝影, 田敏, 赵丹丹
【申请人】云南省农业科学院花卉研究所