一种艰难梭菌显色培养基及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种艰难梭菌显色培养基及其应用，所述显色培养基组成：胰酪蛋白胨1?20g/L，动物组织消化物1?20g/L，葡萄糖0.1?5.5g/L，酵母提取物0.2?5.5g/L，氯化钠0.5?15g/L，亚硫酸钠0.05?1g/L，七叶苷0.1?20g/L，铁0.1?5g/L，氨基酸0.2?25g/L，琼脂粉5?20g/L，环丝氨酸0.1?2.5g/L和头孢西丁钠0.01?0.15g/L，溶剂为去离子水，pH值7.0～7.6；本发明培养基培养周期24小时，菌落为特异性的黑色，在使用该培养基时可以通过颜色准确地从临床粪便样本中获得艰难梭菌分离株。
【专利说明】
一种艰难梭菌显色培养基及其应用 (一)
技术领域
[0001] 本发明涉及一种培养艰难梭菌的培养基，特别涉及一种培养梭菌的显色培养基， 缩短培养时间，提高检出率和准确率。 (二)
【背景技术】
[0002] 艰难梭菌(Clostridium difficile)为革兰阳性厌氧产芽孢杆菌，是人类肠道中 的正常菌群之一，广泛分布于自然环境和动物粪便中。据报道25 %~30 %抗生素相关性腹 泻是由艰难梭菌引起的，而伪膜性肠炎则几乎100%由艰难梭菌所致。在过去二十年中艰难 梭菌出现了发病率、严重程度和复发率上升的趋势，所有这些都与预后不佳有关，并已成为 欧美排名第1的"超级臭虫"。现在美国已将艰难梭菌感染与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐 万古霉素的肠球菌并列于美国三大医院获得性感染之列。根据国外经验，为控制艰难梭菌 的广泛传播，最重要的是发展更为敏感和快速的检测方法，以及时发现，及早诊治。
[0003] 1935年Hall和O'Toole首次培养艰难梭菌，因为其培养非常困难而被命名为艰难 梭菌。1940年Snyder从10周-1岁的婴儿分离到艰难梭菌。其后一直到1960年才有艰难梭菌 培养的报道。目前成人艰难梭菌感染的临床操作指南：（SHEA和IDSA更新的2010版)推荐艰 难梭菌的粪便用CCFA培养基厌氧培养48小时后形成4-6_直径的不规则，不透明的灰白色 菌落。菌落的特征及识别主要依赖于检验人员的肉眼观察和经验判断，对于不典型形态特 征的菌落可能会造成漏检。由于细菌的培养在临床耐药及其他研究中的重要性，因此，实验 室开发一种培养时间短、特异性好、对主观依赖较小的艰难梭菌培养基意义重大。 (三)
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种艰难梭菌的显色培养基，缩短培养时间，从传统培养48小 时缩短到24小时，同时提高菌落的检出率和准确率，普通艰难梭菌选择性培养基上生长的 艰难梭菌为灰白色，而该显色培养基上艰难梭菌的菌落周围为特异性黑色。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种艰难梭菌显色培养基，所述显色培养基终浓度组成:胰酪蛋白胨 l-20g/L，动物组织消化物l-20g/L，葡萄糖0.1-5.5g/L，酵母提取物0.2-5.5g/L，氯化钠 0 · 5-15g/L，亚硫酸钠0 · 05-lg/L，七叶苷0 · l-20g/L，铁0 · l-5g/L，氨基酸0 · 2-25g/L，琼脂粉 5-20g/L，环丝氨酸0 · 1-2 · 5g/L和头孢西丁钠0 · 01-0 · 15g/L，溶剂为去离子水，pH值7 · 0~ 7.6;所述动物组织消化物为肝浸粉。
[0007] 进一步，所述氨基酸为脯氨酸和亮氨酸以质量比1:1的混合。
[0008] 进一步，优选所述艰难梭菌显色培养基终浓度组成:胰酪蛋白胨3-18g/L，动物组 织消化物3_18g/L，葡萄糖0.2-5.2g/L，酵母提取物1-5.5g/L，氯化钠 l-13g/L，亚硫酸钠 0 · 09-0 · 9g/L，七叶苷 0 · 2-18g/L，铁0 · 1-4 · 5g/L，氨基酸 0 · 5-20g/L，琼脂粉 5-20g/L(更优选 10-20g/L)，环丝氨酸0.1-2.5g/L和头孢西丁钠0.01-0.15g/L，溶剂为去离子水，pH值7.0~ 7.4。
[0009]更进一步，优选所述艰难梭菌显色培养基由如下质量配比的原料组成:胰酪蛋白 胨10g/L，肝浸粉10g/L，葡萄糖2g/L，酵母提取物4g/L，氯化钠4g/L，亚硫酸钠0.3g/L，七叶 苷5g/L，铁0.7g/L，氨基酸5g/L，琼脂粉15g/L，环丝氨酸0.16g/L和头孢西丁钠0.07g/L，溶 剂为去离子水，pH值7.2~7.4;所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸以质量比1:1的混合。
[0010]更进一步，优选所述显色培养基由如下质量配比的原料组成:胰酪蛋白胨lg/L，肝 浸粉20g/L，葡萄糖0. lg/L，酵母提取物5.5g/L，氯化钠0.5g/L，亚硫酸钠 lg/L，七叶苷0. lg/ L，铁0.1g/L，氨基酸25g/L，琼脂粉10g/L，环丝氨酸0. lg/L和头孢西丁钠0.15g/L，溶剂为去 离子水，pH值7.0;所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸以质量比1:1的混合。
[0011]更进一步，优选所述显色培养基由如下质量配比的原料组成:胰酪蛋白胨20g/L， 肝浸粉1 g/L，葡萄糖5.5g/L，酵母提取物0.2g/L，氯化钠15g/L，亚硫酸钠0.05g/L，七叶苷 20g/L，铁5g/L，氨基酸0.2g/L，琼脂粉20g/L，环丝氨酸2.5g/L和头孢西丁钠0.01g/L，溶剂 为去离子水，pH值7.4;所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸以质量比1:1的混合。
[0012] 本发明还提供一种所述艰难梭菌显色培养基在培养艰难梭菌中的应用，所述应用 是将艰难梭菌接种至显色培养基，37土TC厌氧培养18-24h，菌落周围有黑色素沉着的为艰 难梭菌，菌落周围无色素沉着的不是艰难梭菌。
[0013] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在:本发明培养基培养周期从现有技 术分离时间48-72小时缩短到24小时；同时培养出的菌落从现有方法的灰白色菌落改进为 特异性的黑色，在使用该培养基时可以通过颜色准确地从临床粪便样本中获得艰难梭菌分 离株。 (四）
【附图说明】
[0014] 图1艰难梭菌标准株在显色培养基上的生长情况，A为艰难梭菌标准株 (ATCC700057)，B为艰难梭菌标准株(ATCC43255)。
[0015]图2为对照菌株在显色培养基上的生长情况，A为大肠杆菌标准株ATCC25933，B为 奇异变形杆菌标准ATCC12453，C为产气荚膜梭菌标准株ATCC13124。
[0016] 图3为临床腹泻患者粪便样本分离结果，A为S393临床腹泻患者粪便样本，B为S379 临床腹泻患者粪便样本，C为S357临床腹泻患者粪便样本，D为S345临床腹泻患者粪便样本。 (五)
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0018] 实施例1标准菌株测试
[0019] 1、显色培养基成分： 胰酪蛋白胨 10g 肝浸粉 log 葡萄糖 2g 酵母提取物 4g 氯化钠 4g
[0020] 亚硫酸钠 0.3g 七叶苷 5g 铁 〇 7g 氨基酸 5g 琼脂粉 15g
[0021]加环丝氨酸0.16g，头孢西丁钠0.07g，溶剂为去离子水1L，氨基酸是脯氨酸和亮氨 酸以质量比1:1的混合，pH值7.2，倾注平板后使用。
[0022] 2、标准菌株：
[0023] 选取购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC)艰难梭 菌标准株(ATCC700057、ATCC43255)作为阳性对照，用购自ATCC的产气夹膜梭菌ATCC13124， 奇异变形杆菌ATCC12453,大肠杆菌ATCC25922作为阴性对照。
[0024] 3、实验操作
[0025]将菌株复苏后分别接种到该显色培养基，37±1°C厌氧培养18_24h，观察结果。
[0026] 结果显示艰难梭菌标准株(ATCC700057、ATCC43255)在显色培养基上显示黑色菌 落，菌落周围有黑色素沉着，见图1。而产气夹膜梭菌ATCC13124,奇异变形杆菌ATCC12453， 大肠杆菌ATCC25922在该培养基上生长出白色菌落，没有黑色色素沉淀，结果见2。上述结果 说明该培养基只针对艰难梭菌出现特异性显色，对其他阴性细菌均无显色现象出现。
[0027]实施例2实际样本检测 [0028] 1、显色培养基成分： 胰酪蛋白胨 lg 肝浸粉 20g 葡萄糖 〇.lg 酵母提取物 5.5% 氯化钠 0 5g
[0029] 亚硫酸钠 lg 七叶苷 Olg 铁 o.lg 氨基酸 25g 琼脂粉 l〇g
[0030] 加环丝氨酸O.lg，头孢西丁钠0.15g，溶剂为去离子水1L，氨基酸是脯氨酸和亮氨 酸以质量比1:1的混合，pH值7.0，倾注平板后使用。
[0031] 2、实验操作
[0032] 取临床腹泻病人粪便200mg与无水乙醇800μ1在1.5ml离心管中混合，盖上管盖，涡 旋震荡混匀。
[0033] (2)上述样本混匀后在室温下静置1小时。
[0034] (3)静置后将离心管放入高速离心机以800rpm离心10分钟。离心后将上清液吸去， 保留沉淀。
[0035] (4)在沉淀中加入800μ1的生理盐水，混匀。
[0036] (5)将混匀后的粪便标本全部倾倒至显色培养基，涂布均匀至无液体流动。
[0037] (6)37±1°(：厌氧培养18-2411，观察结果。同样条件下用艰难梭菌标准株 (ATCC43255)作为阳性对照，用产气夹膜梭菌ATCC13124作为阴性对照。
[0038]粪便样本的培养结果见图3。粪便标本(S379和S393)的培养基显示粪便的浅黄色， 菌落显示白色，培养基不变色，表明S379和S393两个样本为艰难梭菌阴性，见图3中Α和图3 中B。粪便标本（S345和S357)的培养基显示黑色，菌落周围有黑色素沉着，说明粪便标本 S345和S357为艰难梭菌阳性样本，见图3中C和图3中D。通过上述结果显示本培养基在培养 临床艰难梭菌感染阳性患者粪便样本时，培养基变黑色，且菌落周围有黑色素沉着的提示 为艰难梭菌菌落；当培养临床艰难梭菌感染阴性患者粪便样本时，菌落周围无色素沉着的 提示没有艰难梭菌生长。
[0039] 实施例3与现有艰难梭菌选择性平板的比较
[0040] 1、显色培养基成分： 胰酪蛋白胨 20g 肝浸粉 ：lg 葡萄糖 5 5g 酵母提取物 0.2g
[0041 ] 氯化钠 15g 亚硫酸钠 0.05g 七叶苷 20g 铁 5:g 氨基酸 a:2g
[0042] 琼脂粉 20g
[0043] 加环丝氨酸2.5g，头孢西丁钠 O.Olg，溶剂为去离子水1L，氨基酸是脯氨酸和亮氨 酸以质量比1:1的混合，pH值7.4，倾注平板后使用。
[0044] 2、环丝氨酸-头孢西丁果糖琼脂(CCFA)培养基为对照。
[0045] 3、实验操作
[0046] 取临床腹泻病人粪便200mg与无水乙醇800μ1分别放在1.5ml离心管中混合，盖上 管盖，涡旋震荡混匀。每个样本重复操作一次。
[0047] (2)上述样本混匀后在室温下静置1小时。
[0048] (3)静置后将离心管放入高速离心机以800rpm离心10分钟。离心后将上清液吸去， 保留沉淀。
[0049] (4)在沉淀中加入800μ1的生理盐水，混匀。
[0050] (5)将混匀后的粪便标本分别全部倾倒至CCFA和显色培养基，涂布均匀至无液体 流动。
[0051] (6)将显示培养基放置37 土 TC厌氧培养18-24h，观察结果。同样条件下用艰难梭 菌标准株(ATCC43255)作为阳性对照，用产气夹膜梭菌ATCC13124作为阴性对照。
[0052] (7)将CCFA培养基放置37 ± 1°C厌氧培养48-7 2h，观察结果。同样条件下用艰难梭 菌标准株(ATCC43255)作为阳性对照，用产气夹膜梭菌ATCC13124作为阴性对照。
[0053]结果显示，CCFA培养基需要培养48小时才能在平板上生长出艰难梭菌，而该显色 培养基可在24小时内生长出艰难梭菌。并且，艰难梭菌在CCFA上长出的菌落为典型灰白色 形状，而在显色培养基上则可生长出黑色菌落。因此，本发明涉及的艰难梭菌显色培养基与 现有艰难梭菌选择性培养基相比，具有菌株分离周期短，阳性菌落易挑选等特点。具体两种 比对如下表1。
[0054]表 1
【主权项】
1. 一种艰难梭菌显色培养基，其特征在于所述显色培养基终浓度组成：胰酪蛋白胨1-20g/L，动物组织消化物l-20g/L，葡萄糖0 · 1-5 · 5g/L，酵母提取物0 · 2-5 · 5g/L，氯化钠0 · 5-15g/L，亚硫酸钠0 · 05-lg/L，七叶苷0 · l-20g/L，铁0 · l-5g/L，氨基酸0 · 2-25g/L，琼脂粉5-20g/L，环丝氨酸0 · 1-2 · 5g/L和头孢西丁钠0 · 01-0 · 15g/L，溶剂为去离子水，pH值7 · 0~7 · 6; 所述动物组织消化物为肝浸粉。2. 如权利要求1所述艰难梭菌显色培养基，其特征在于所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸 以质量比1:1的混合。3. 如权利要求1所述艰难梭菌显色培养基，其特征在于所述显色培养基由如下质量配 比的原料组成:胰酪蛋白胨3-18g/L，动物组织消化物3-18g/L，葡萄糖0.2-5.2g/L，酵母提 取物 1-5.5g/L，氯化钠 1-13g/L，亚硫酸钠0.09-0.9g/L，七叶苷0.2-18g/L，铁0.1-4.5g/L， 氨基酸0 · 5-20g/L，琼脂粉5-20g/L，环丝氨酸0 · 1-2 · 5g/L和头孢西丁钠0 · 01-0 · 15g/L，溶剂 为去离子水，pH值7.0~7.4。4. 如权利要求1所述艰难梭菌显色培养基，其特征在于所述显色培养基由如下质量配 比的原料组成:胰酪蛋白胨l〇g/L，肝浸粉10g/L，葡萄糖2g/L，酵母提取物4g/L，氯化钠4g/ L，亚硫酸钠0.3g/L，七叶苷5g/L，铁0.7g/L，氨基酸5g/L，琼脂粉15g/L，环丝氨酸0.16g/L和 头孢西丁钠0.07g/L，溶剂为去离子水，pH值7.2~7.4;所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸以质 量比1:1的混合。5. 如权利要求1所述艰难梭菌显色培养基，其特征在于所述显色培养基由如下质量配 比的原料组成:胰酪蛋白胨lg/L，肝浸粉20g/L，葡萄糖0.1g/L，酵母提取物5.5g/L，氯化钠 0.5g/L，亚硫酸钠 lg/L，七叶苷0 . lg/L，铁0.1 g/L，氨基酸25g/L，琼脂粉10g/L，环丝氨酸 0. lg/L和头孢西丁钠0.15g/L，溶剂为去离子水，pH值7.0;所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸以 质量比1:1的混合。6. 如权利要求1所述艰难梭菌显色培养基，其特征在于所述显色培养基由如下质量配 比的原料组成:胰酪蛋白胨20g/L，肝浸粉lg/L，葡萄糖5.5g/L，酵母提取物0.2g/L，氯化钠 15g/L，亚硫酸钠0.05g/L，七叶苷20g/L，铁5g/L，氨基酸0.2g/L，琼脂粉20g/L，环丝氨酸 2.5g/L和头孢西丁钠0.01g/L，溶剂为去离子水，pH值7.4;所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸以 质量比1:1的混合。7. -种权利要求1所述艰难梭菌显色培养基在检测艰难梭菌中的应用。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用是将艰难梭菌接种至显色培养基，37 ±1°C厌氧培养18-24h，菌落周围有黑色素沉着的为艰难梭菌，菌落周围无色素沉着的不是 艰难梭菌。
【文档编号】C12R1/145GK105838774SQ201610380128
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】罗芸
【申请人】浙江省疾病预防控制中心