一种苹果中irt1启动子插入元件的应用
【专利摘要】本发明公开了一种苹果中IRT1启动子插入元件的应用。本发明公开一种鉴定或辅助鉴定植物耐缺铁能力大小的方法，包括检测待测植物的IRT1蛋白质的基因组基因序列，IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域均具有5′-ATTATAA-3′序列的待测植物的耐缺铁能力大于或候选大于IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域均不具有5′-ATTATAA-3′序列的待测植物的耐缺铁能力。利用本发明公开的IRT1启动子上的元件TATA-box的缺失和存在可以快速的筛选后代中的耐缺铁植株。本发明在植物的耐缺铁领域中具有重要意义。
【专利说明】
一种苹果中I RT1启动子插入元件的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种苹果中IRT1启动子插入元件的应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 铁元素是作物生长必需的微量元素之一。缺铁胁迫造成的果树叶片黄化和植株早 衰的现象能引起作物品质下降、产量降低，对农业经济效益有着极大的影响。我国苹果树大 多生长于偏碱性土壤中，易发生黄叶病的现象，因此寻求缺铁胁迫的内在机制来改善苹果 缺铁失绿症显得愈来愈重要。
[0003] 苹果铁高效基因型小金海棠缺铁处理的根系CDNA文库中克隆得到的二价阳离子 转运蛋白基因 MxIRTl基因 （Peng li，et al，2006)，其合成的蛋白对小金海棠对铁的吸收和 转运过程中起着重要作用。该基因的cDNA全长为1398bp，0RF为1095bp。该基因编码一 个364个氨基酸的多肽，是一种膜蛋白，具有一个由30个氨基酸组成的信号肽序列和7个 跨膜螺旋，3个N-糖基化位点和1个0-糖基化位点，在第3和第4个跨膜螺旋之间有一富 含组氨酸的区域（HGHFHAHNH)，该区域被认为是金属离子的结合位点。MxIRTl基因的表达 在缺铁不同时间存在差异，但造成其差异表达的内在原因还不清楚。
[0004] 小金海棠是一种耐缺铁的植株，它是一种典型的机理I植物，g卩：植物通过质膜上 的H+-ATPase，使土壤酸化，增加铁的可溶性，然后在三价铁还原酶的作用下将三价铁还原 成二价铁，在二价铁转运蛋白的作用下将二价铁转运进细胞质内，增加植株的耐缺铁性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种苹果中IRT1启动子插入元件的应用。
[0006] 本发明提供一种鉴定或辅助鉴定植物耐缺铁能力大小的方法，包括检测待测植 物的IRT1蛋白质的基因组基因序列，IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域均具有 5' -ATTATAA-3'序列的待测植物的耐缺铁能力大于或候选大于IRT1蛋白质的基因组基 因序列启动子区域均不具有Y -ATTATAA-3'序列的待测植物的耐缺铁能力。
[0007] 上述方法中，所述IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域均具有 5' -ATTATAA-3'序列的待测植物为IRT1蛋白质的基因组基因序列的-363~-357位置均 为Y -ATTATAA-3'序列的待测植物；
[0008] 所述IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域均不具有Υ -ATTATM-3'序列 的待测植物为IRT1蛋白质的基因组基因序列的-363~-357位置均不为Y -ATTATAA-3 ^ 序列的待测植物；
[0009] 所述-363~-357位置为IRT1蛋白质的基因组基因序列中IRT1基因起始密码子 ATG的5'上游方向第-363位至第-357位，以IRT1基因起始密码子ATG中的A为第+1位。
[0010] 上述任一所述的方法中，所述IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域均具有 5 ^ -ATTATAA-3 ^序列的待测植物的鉴定方法如下：以待测植物的基因组DNA为模板，以 SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果 所述PCR扩增产物自5'末端起第216位至第222位均为Υ -ATTATAA-3^，则待测植物为 IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域均具有Y -ATTATAA4序列的待测植物；
[0011] 所述IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域均不具有Υ -ATTATM-3'序列 的待测植物的鉴定方法如下：以待测植物的基因组DNA为模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果所述PCR扩增产物自5'末 端起第216位至第222位均不为Y -ATTATAA-3'，则待测植物为IRT1蛋白质的基因组基 因序列启动子区域均不具有Y -ATTATAA-3'序列的待测植物。
[0012] -种鉴定或辅助鉴定植物耐缺铁能力大小的方法也属于本发明的保护范围，包括 检测待测植物的IRT1蛋白质的基因组基因序列，IRT1蛋白质的基因组基因序列具有纯合 5' -TTG-3'序列的待测植物的耐缺铁能力大于或候选大于IRT1蛋白质的基因组基因序 列不具有Y -TTG-3'序列的待测植物的耐缺铁能力；
[0013] 所述IRT1蛋白质的基因组基因序列具有纯合Y -TTG-3'序列的待测植物为 IRT1蛋白质的基因组基因序列的-376~-374位置均为Y -TTG-3'序列的待测植物；
[0014] 所述IRT1蛋白质的基因组基因序列不具有Y -TTG-3'序列的待测植物为IRT1 蛋白质的基因组基因序列的-376~-374位置均不为Y -TTG-3'序列的待测植物；
[0015] 所述-376~-374位置为IRT1蛋白质的基因组基因序列中IRT1基因起始密码子 ATG的5'上游方向第-376位至第-374位，以IRT1基因起始密码子ATG中的A为第+1位。
[0016] 一种鉴定或辅助鉴定植物耐缺铁能力大小的方法也属于本发明的保护范围，包括 检测待测植物的IRT1蛋白的氨基酸序列，IRT1蛋白自N端起第32位氨基酸为天冬氨酸的 待测植物的耐缺铁能力大于或候选大于IRT1蛋白自N端起第32位氨基酸为谷氨酸的待测 植物的耐缺铁能力。
[0017] 一种鉴定或辅助鉴定植物耐缺铁能力大小的方法也属于本发明的保护范围，包括 如下步骤：提取待测植物的基因组DNA，以其为模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示 的DNA分子为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；PCR扩增产物的长度均为727bp的 待测植物的耐缺铁能力大于或候选大于PCR扩增产物的长度均为717bp的待测植物的耐缺 铁能力。
[0018] 上述任一所述的方法中，所述植物为苹果属植物。
[0019] 上述任一所述的方法中，所述苹果属植物为小金海棠、山定子、M9或三者之间的杂 交后代。
[0020] -种鉴定或辅助鉴定植物耐缺铁能力大小的试剂盒也属于本发明的保护范围，该 试剂盒包含如下（1)或（2)所示的成套DNA分子：
[0021] (1) SEQ ID No. 1 所示的 DNA 分子和 SEQ ID No. 2 所示的 DNA 分子；
[0022] (2) SEQ ID No. 3 所示的 DNA 分子和 SEQ ID No. 4 所示的 DNA 分子；
[0023] 所述SEQ ID No. 1所示的DNA分子和SEQ ID No. 2所示的DNA分子独立包装；
[0024] 所述SEQ ID No. 3所示的DNA分子和SEQ ID No. 4所示的DNA分子独立包装；
[0025] 该试剂盒用于扩增IRT1蛋白质的基因组基因序列；
[0026] 该试剂盒还含有记载在可读载体上的使用说明，说明书的内容为上述任一所述的 方法。
[0027] 上述试剂盒中，所述植物为苹果属植物；
[0028] 所述苹果属植物具体为小金海棠、山定子、M9或三者之间的杂交后代。
[0029] 本发明所提供的IRT1启动子上的元件TATA-box的缺失和存在对于缺铁胁迫的植 株来说有很重要的调节作用。通过毛细管电泳检测小金海棠和山定子，小金海棠和M9后代 IRT1启动子上的元件TATA-box的分离情况，并结合各后代的黄化表型可以发现IRT1的启 动子上的TATA-box的插入与耐缺铁性状相关，而TATA-box的缺失减弱其耐缺铁能力。
[0030] 利用本发明所提供的IRT1启动子上的元件TATA-box的缺失和存在可以快速的筛 选后代中的耐缺铁植株。本发明在植物的耐缺铁领域中具有重要意义。
【附图说明】
[0031] 图1为IRT1基因在苹果基因组上的位置示意图。
[0032] 图2为IRT1启动子插入或缺失片段序列比对。
[0033] 图3为IRT1启动子插入或缺失片段功能预测结果。
[0034] 图4为IRT1编码区cDNA序列比对。
[0035] 图5为IRT1编码区氨基酸序列比对。
[0036] 图6为IRT1启动子插入或缺失片段与编码区氨基酸突变连锁示意图。
[0037] 图7为毛细管电泳预实验。
[0038] 图8为测序验证毛细管电泳结果。
[0039] 图9为毛细管电泳分析苹果后代中TATA-box的分离情况。
[0040] 图10为苹果杂交后代缺铁条件下叶片黄化情况调查。
【具体实施方式】
[0041 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] 小金海棠 （Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)在文献"成明昊，李晓林，张云 贵。苹果优良砧木资源-小金海棠，西南农业大学学报，2000年10月，22 (5) :383-386"中 公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0044] 山定子（Malus baccata Borkh)在文献"张凌云，翟衡，张宪法.苹果站木铁高效 基因型筛选，2002,中国农业科学，35(1) :68-71"中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0045] M9在文献"余亮，王飞.苹果砧木M9快繁技术的建立及试管苗生根进程解剖研 究，西北林学院学报，2013,28(4) :106-110"中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0046] 实施例1、铁转运蛋白IRT1启动子缺失元件的获得
[0047] 一、IRT1启动子及编码区序列分析
[0048] 在苹果基因组中对IRT1进行搜索，发现在整个苹果基因组中存在两个⑶S相似度 为100%的IRT1基因，它们均位于第5号染色体上，相距36735bp，如图1所示。图1表明， IRT1蛋白质的基因组基因序列的基本结构包括三个外显子（图1中的深色的实心框）和 两个内含子（图1中连接深色实心框的黑色线），为了便于描述基因结构，下述实施例中将 IRT1蛋白质的基因组基因序列中IRT1基因起始密码子ATG中的A的位置记作为+1，-代 表1RT1蛋白质的基因组基因序列中IRT1基因起始密码子ATG的5'方向，+代表1RT1蛋 白质的基因组基因序列中IRT1基因起始密码子ATG的3'方向。
[0049] 二、提取小金海棠的基因组DNA，以其为模板，以F1和R1为引物，进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物。
[0050] F1 :5，-GCAGCTGCCAACCTCAATCC-3'，（SEQ ID No. 1)
[0051] R1 :5，-CGACCGGCTTGACACCAAAA-3，。（SEQ ID No. 2)
[0052] PCR扩增产物为IRT1蛋白质的基因组基因序列和部分启动子（长度为2302bp): 5' -578bp+IRT(3Extron+2Intron) 1637bp+87bp-3' 〇
[0053] 三、将PCR扩增产物进行测序，并将测序结果进行比对，存在差异的序列比对结果 如图2所示。
[0054] 图2表明，小金海棠基因组DNA上在IRT1基因启动子即ATG上游的-363~-357 位置（或步骤二的PCR扩增产物自5'末端起第216位至第222位）存在一段差异 片段V -ATTATAA-3'。该插入片段在plantcare启动子功能预测网站：(http:// bioinformatics· psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)进行预测，结果如图 3 所不。 图3表明，该段序列为一个TATA-box，此TATA-box通常位于转录起始的-30bp左右，是IRT1 启动子核心元件。
[0055] 对PCR扩增产物的编码区进行分析，该区段包括扩增产物中IRT1基因的起始密码 子ATG到终止密码子TAA之间所有外显子部分，共1095bp。IRT1编码区cDNA序列比对结 果如图4所示。
[0056] 图4表明，IRT1编码区有四个位点碱基突变会造成有义突变： +96, +447, +489, +513 (以起始密码子ATG中的A位置记为+1，5'其方向为-，3'方向为+)。
[0057] IRT1编码区氨基酸序列比对结果如图5所示。
[0058] 图5表明，IRT1编码区氨基酸比对结果有义突变位置：+32，+149，+163，+171(IRTl 蛋白N端第一个氨基酸Μ的位置记为+1)。与之前启动子区域的TATA-box突变位点进行比 对发现其中有一处氨基酸的突变与TATA-box的缺失紧密连锁，如图6所示。
[0059] 图6表明，TATA-box ( 即IRT1蛋白质的基因组基因序列中ATG上游的第-363位 至第-357位的Y -ATTATAA-3'，或步骤二的PCR扩增产物自5'末端起第216位至第222 位的Y -ATTATAA-3')缺失时，该基因的编码区序列+96位置的碱基为G，IRT1蛋白的氨 基酸序列自N端起第32位的氨基酸为E (谷氨酸），TATA-box (即IRT1基因组DNA序列中 ATG上游的第-363位至第-357位的Y -ATTATAA-3'，或步骤二的PCR扩增产物自5'末 端起第216位至第222位的Y -ATTATAA-3')存在时，该基因的编码区序列+96位置的 碱基为T，IRT1蛋白的氨基酸序列自N端起32位的氨基酸为D (天冬氨酸）。
[0060] 实施例2、毛细管电泳分析苹果杂交后代中TATA-box的分离情况
[0061] -、以小金海棠为母本，山定子为父本进行杂交，以小金海棠为母本，M9为父本进 行杂交，将小金海棠 XM9和小金海棠 X山定子的F1代杂交后代具有黄化差异的植株，分 别采集这些植株的叶片，提取基因组DNA。
[0062] 二、设计并合成如下引物：
[0063] IRT1-F -.5' -AAGCCACCGGAGGACATGG-3，，（SEQ ID No. 3)
[0064] IRT1-R :5' -GGGCTATGATTTTGAGGGGCA-3，。（SEQ ID No. 4)
[0065] 对IRT1-F在5'端加上FAM荧光标记，最终得到荧光标记的IRT1-F。
[0066] 三、以步骤一得到的各基因组DNA为模板，以荧光标记的IRT1-F和IRT1-R为引 物，进行PCR扩增，得到各PCR扩增产物。
[0067] PCR 扩增体系（15μ1):
[0068] 表 1
[0069] PCR反应组分每个体系加入量
[0070]
[0071] PCR反应程序：
[0072] 表 2
[0073]
[0074] 四、将各PCR扩增产物用3730XL测序仪进行毛细管电泳及检测，将检测得到的原 始数据文件导入到分析软件中进行分析。
[0075] 先随机抽取4个样品（小金海棠 X山定子F1代2个，小金海棠 XM9F1代2 个）进行预实验检测，结果如图7所示，图7表明，各个抽取的样品在717. 05(717bp)和 727. 24(727bp)两个位置中出现明显的峰，说明同一样品中用同一对引物可以扩增出两条 带，其长度差值为10个碱基。
[0076] 五、基因克隆测序验证毛细管电泳结果的可靠性
[0077] 将步骤四的4个样品进行测序，测序结果如图8所示。图8表明，测序得到的两 条序列的长度差值与荧光检测的结果相同，由于5' -ATTATAA-3'与上游5' -TTG-3'（位置 为-376~-374)紧密连锁共10bp，所以两种扩增条带的差值为10bp，说明该方法可以成功 鉴定杂合的情况。
[0078] 六、对苹果杂交后代（小金海棠 X山定子F1代63个，小金海棠 XM9F1代33个） 进行步骤三的PCR扩增以及步骤四的毛细管电泳分析，结果如图9所示。图9表明，绝大部 分样本在717. 05和727. 24两个位置中出现明显的峰，说明在绝大部分F1代的IRT1蛋白 质的基因组基因序列中启动子TATA-box(即5' -ATTATAA-3'）的杂合体。但其中也鉴定 出5个单峰株系，分别为：株系号为37-007的小金海棠 X山定子F1代，该株系为727单峰 (IRT1蛋白质的基因组基因序列中启动子TATA-box(即5'-ATTATAA-3'）插入）；株系号分 别为2-048, 3-250, 3-248,1-063的小金海棠 XM9杂交F1代，这些株系均为717单峰（IRT1 蛋白质的基因组基因序列中启动子TATA-box (即5' -ATTATAA-3'）缺失）。
[0079] 将PCR扩增产物进行测序，测序结果如图8所示。由于5' -ATTATAA-3'（位置 为-363~-357)与上游5'-TTG-3'（位置为-376~-374)紧密连锁共10bp，所以两种扩增 条带（727单峰和717单峰）的差值为10bp，只具有727单峰表明所检测的植物为IRT1蛋 白质的基因组基因序列启动子区域均具有Y -ATTATAA-3'序列的植物，只具有717单峰 表明所检测的植物为IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域不具有Y -ATTATAA-3' 序列的待测植物。
[0080] 5' -ATTATAA-3'位于-363~-357位置，-363~-357位置为IRT1蛋白质的基因 组基因序列中IRT1基因起始密码子ATG的5'上游方向第-363位至第-357位，以IRT1基 因起始密码子ATG中的A为第+1位。
[0081] 七、苹果杂交后代缺铁条件下叶片黄化情况调查
[0082] 为了推测IRT1启动子TATA-box缺失与苹果耐缺铁性状的关系，在缺铁条件下进 行叶片黄化情况调查，方法如下：
[0083] 于2013年3月，将小金海棠 X山定子、小金海棠 XM9杂交F1代扦插扩繁，每个 株系选取生长一致的三棵扦插苗，移栽于河沙基质栽培槽中，正常供铁时浓度为40 μ M，低 铁处理时为4 μ Μ。低铁处理12天后观察幼叶黄化情况，拍照记录，并提取基因组DNA进行 步骤三的PCR扩增以及步骤四的毛细管电泳分析。
[0084] 结果如图10所示。
[0085] 图10中，37-007只具有727单峰（727单峰表明所检测的植物为IRT1蛋白质的 基因组基因序列启动子区域均具有Υ -ΑΤΤΑΤΑΑ-3 ^序列的植物），该株系表现为耐缺铁， 2-048, 3-250, 3-248,1-063只具有717单峰（717单峰表明所检测的植物为IRT1蛋白质的 基因组基因序列启动子区域不具有5' -ATTATAA-3'序列的植物），该株系表现为不耐缺 铁。结果表明，IRT1基因组基因序列中启动子区域的TATA-box (即5' -ATTATAA-3'）的插 入与耐缺铁性状相关，而TATA-box的缺失减弱其耐缺铁能力。
【主权项】
1. 一种鉴定或辅助鉴定植物耐缺铁能力大小的方法，包括检测待测植物的IRT1蛋白 质的基因组基因序列，IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域均具有Y -ATTATAA-3' 序列的待测植物的耐缺铁能力大于或候选大于IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域 均不具有Y -ATTATAA-3'序列的待测植物的耐缺铁能力。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述IRT1蛋白质的基因组基因序列 启动子区域均具有Y -ATTATAA-3'序列的待测植物为IRT1蛋白质的基因组基因序列 的-363~-357位置均为Y -ATTATAA-3'序列的待测植物； 所述IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域均不具有Y -ATTATAA-3'序列的待 测植物为IRT1蛋白质的基因组基因序列的-363~-357位置均不为Y -ATTATAA-3'序 列的待测植物； 所述-363~-357位置为IRT1蛋白质的基因组基因序列中IRT1基因起始密码子ATG 的5'上游方向第-363位至第-357位，以IRT1基因起始密码子ATG中的A为第+1位。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述IRT1蛋白质的基因组基因序列 启动子区域均具有Y -ATTATAA-3'序列的待测植物的鉴定方法如下：以待测植物的基因 组DNA为模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物为引物，进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物；如果所述PCR扩增产物自5'末端起第216位至第222位均为Y -ATTATAA-3'， 则待测植物为IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域均具有Y -ATTATAA-3'序列的 待测植物； 所述IRT1蛋白质的基因组基因序列启动子区域均不具有Y -ATTATAA-3'序列的待 测植物的鉴定方法如下：以待测植物的基因组DNA为模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 所示的引物为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果所述PCR扩增产物自5'末端起 第216位至第222位均不为Y -ATTATAA-3'，则待测植物为IRT1蛋白质的基因组基因序 列启动子区域均不具有Y -ATTATAA-3'序列的待测植物。4. 一种鉴定或辅助鉴定植物耐缺铁能力大小的方法，包括检测待测植物的IRT1蛋白 质的基因组基因序列，IRT1蛋白质的基因组基因序列具有纯合Y -TTG-3'序列的待测植 物的耐缺铁能力大于或候选大于IRT1蛋白质的基因组基因序列不具有5' -TTG-3'序列 的待测植物的耐缺铁能力； 所述IRT1蛋白质的基因组基因序列具有纯合Y -TTG-3'序列的待测植物为IRT1蛋 白质的基因组基因序列的-376~-374位置均为Y -TTG-3^序列的待测植物； 所述IRT1蛋白质的基因组基因序列不具有Y -TTG-3'序列的待测植物为IRT1蛋白 质的基因组基因序列的-376~-374位置均不为Y -TTG-3^序列的待测植物； 所述-376~-374位置为IRT1蛋白质的基因组基因序列中IRT1基因起始密码子ATG 的5'上游方向第-376位至第-374位，以IRT1基因起始密码子ATG中的A为第+1位。5. -种鉴定或辅助鉴定植物耐缺铁能力大小的方法，包括检测待测植物的IRT1蛋白 的氨基酸序列，IRT1蛋白自N端起第32位氨基酸为天冬氨酸的待测植物的耐缺铁能力大 于或候选大于IRT1蛋白自N端起第32位氨基酸为谷氨酸的待测植物的耐缺铁能力。6. -种鉴定或辅助鉴定植物耐缺铁能力大小的方法，包括如下步骤：提取待测植物的 基因组DNA，以其为模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的DNA分子为引物，进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物；PCR扩增产物的长度均为727bp的待测植物的耐缺铁能力大于或 候选大于PCR扩增产物的长度均为717bp的待测植物的耐缺铁能力。7. 根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述植物为苹果属植物。8. 根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述苹果属植物为小金海棠、山定 子、M9或三者之间的杂交后代。9. 一种鉴定或辅助鉴定植物耐缺铁能力大小的试剂盒，该试剂盒包含如下（1)或（2) 所示的成套DNA分子： (1) SEQ ID No. 1所示的DNA分子和SEQ ID No. 2所示的DNA分子； (2) SEQ ID No. 3所示的DNA分子和SEQ ID No. 4所示的DNA分子。10. 根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述植物为苹果属植物； 所述苹果属植物具体为小金海棠、山定子、M9或三者之间的杂交后代。
【文档编号】G01N33/68GK105838776SQ201510016288
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月13日
【发明人】吴婷, 张美玲, 韩振海, 张新忠, 王忆, 许雪峰
【申请人】中国农业大学