一种无须鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，特别涉及一种无须鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系及应用。引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。采用无须鳕鱼特异性检测引物进行实时荧光PCR扩增无须鳕鱼的Co Ⅰ基因，实时荧光PCR扩增后会产生一条特异性扩增曲线，从而将无须鳕鱼成分进行特异性鉴定。本发明特异性引物设计合理，用于无须鳕鱼的物种检测，特异性好，检测灵敏度高，即经过荧光PCR分析，即可将无须鳕鱼成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
【专利说明】
一种无须鳕鱼实时荧光PCR特异性检测体系及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种无须鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测 体系及应用。
【背景技术】
[0002] 无须鳕，学名Merluccius Merluccius，隶属于鳕科，无须属，体长，头大，牙大而 尖。有背鳍二个，第二背鳍长，靠近中部有浅凹刻。臀鳍亦长且有凹刻。腹鳍前位，在胸鳍之 前。为游速快的肉食性鱼类。
[0003] 通过形态学特征进行判断是对无须鳕鱼识别的传统方法，但是这些形态学特征的 可塑性强，受环境影响大，具有人为的主观倾向性，且存在丰富的近缘物种，近缘种间的形 态差异细微，所以传统的形态学特征识别方法存在识别困难与识别错误的问题。
[0004] 采用DNA技术鉴定动物物种是物种识别方法中最为热门也是发展最快的分子技 术，快速进化并呈母系遗传的线粒体DNA是种群遗传学和进化遗传学的理想研究对象。目 前，鱼类物种的分子检测主要集中Col基因，无须鳕鱼与其它近源物种的Col基因序列相似 度在90%左右，序列之间存在着一定的差异。实时荧光PCR是DNA技术鉴定中快捷高效的技 术之一，指在DNA扩增反应中，通过荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产 物总量的方法，研究利用实时荧光PCR对无须鳕鱼进行物种识别及在无须鳕鱼的物种保护 及系统发育研究等领域均具有重大意义。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种无须鳕鱼物种特异性检测体系及该特异性检测体系的应用方法。 本发明可以检测出来自动物样品的微量DNA，完全区分无须鳕鱼的基因与其它鱼类基因，检 测灵敏度高，方法快速，易操作。
[0006] 本发明为实现上述目的所采用的技术方案是:一种无须鳕鱼物种实时荧光PCR特 异性检测引物和检测体系，其中所述的引物序列是：
[0007] 上游引物SEQ ID N0 · 1:5 ' -GTCACGGCACACGCCTTC-3 ' ；
[0008] 下游引物SEQ ID NO · 2:5 ' -GGAGGAGCAGGAACGATGG-3 ' ；
[0009] 进一步地，所述无须鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系还包括由其他试剂所 组成的反应体系如下表1:
[0010]表1无须鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应体系
[0011]
[0012] 其中，SYBR?Premix Ex Taq购自于大连宝生物工程有限公司（商品货号:RR820)
[0013] 进一步地，所述无须鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表2:
[0014] 表2无须鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数
[0015]
[0016] -种根据所述的无须鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，利用SYBR? Green I与双链DNA非特异性结合的特性，监测每一PCR反应的荧光强度，以检测反应体系中 的DNA扩增产物。
[0017] 进一步地，所述无须鳕鱼物种进行实时荧光PCR特异性检测方法为:采用无须鳕鱼 物种实时荧光PCR特异性检测体系扩增无须鳕鱼的Col基因，以SYBR^remix Ex Taq DNA 聚合酶进行PCR反应，利用SYBRR3Green I与双链DNA结合后发出荧光的特性，检测反应体系 中的SYBR?Green I与DNA结合后发出的荧光，达到检测PCR产物扩增量目的。通过设计无 须鳕鱼物种特异性引物，从而引发特异性扩增，通过荧光信号的收集处理，获得特异性扩增 曲线。本发明特异性引物设计合理，用于无须鳕鱼物种检测，特异性好，检测灵敏度高。采用 本方法检测无须鳕鱼动物成分结果显示，采用无须鳕鱼物种特异性检测引物进行实时荧光 PCR扩增无须鳕鱼的Col基因，会产生一条特异性扩增曲线，即经过实时荧光PCR分析，即可 将无须鳕鱼成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
【附图说明】
[0018]图1.相似序列的物种分布情况，其中，方框内的物种为无须鳕鱼所在的位置；
[0019] 图2.引物的特异性分析，如图所示只有Merluccius Merluccius的物种能和所设 计的引物完全互补结合，没有检验到完全匹配的其它物种，证明引物的特异性较好；
[0020] 图3.引物PCR扩增的电泳检测结果图，图中：]?、01^00011^46〇1、无须鳕鱼2、无须 鳕鱼3、太平洋鳕鱼4、黑线鳕5、大西洋鳕6、阿拉斯加鳕鱼7、空白对照。
[0021 ]图4.无须鳕鱼实时荧光PCR的溶解曲线检测结果图，图中：1、无须鳕鱼2、无须鳕鱼 3、太平洋鳕鱼4、黑线鳕5、大西洋鳕6、阿拉斯加鳕鱼7、空白对照。
[0022]图5.无须鳕鱼与其他鳕形目海洋鱼类的实时荧光PCR特异性检测结果图，图中：1、 无须鳕鱼2、绿青鳕3、太平洋鳕鱼4、蓝鳕鱼5、黑线鳕6、大西洋鳕7、黑鳕8、阿拉斯加鳕鱼9、 空白对照。
[0023]图6 ·灵敏度分析结果图，图中：1、25ngAiL扩增结果;2、5ngAiL扩增结果;3、lng/yL 扩增结果;4、0.2ngAiL扩增结果;5、0. (Mng/yL扩增结果;6、0.0 lng/yL扩增结果;7、空白对 照。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施 例。本发明下述具体实施例中所涉及的实验方法如无特殊说明，均为实验室常规方法，所用 的试剂或药品，如无特殊说明，均由常规方法制备或者可由商业途径获得，其中所用空白对 照为水。
[0025]实施例1荧光PCR特异性检测引物序列的设计
[0026] 1.无须鳕鱼相近物种Col基因的分析
[0027] 登录NCBI (http: //www.ncbi .nlm.nih. g N程序在nr数据库中进行相似性序列的 搜索，返回的相似序列的物种分布情况如图1所示，并将所有序列以Merluccius Merluccius及Col为关键词在nr数据库中进行搜索，将搜索结果的序列下载存盘后，进行 Blast列下载存盘。图1为相似序列的物种分布情况，其中，方框内的物种为无须鳕鱼所在的 位置。
[0028] 2.无须鳕鱼物种特异性检测引物的设计
[0029] 将下载的序列进行序列的相似性分析和序列性分析，在序列的差异处设计特异性 引物。
[0030] 3.无须鳕鱼物种特异性检测引物的特异性分析
[0031]将设计好的引物在NCBI中，利用primer blast程序选择nr数据库，进行引物的特 异性分析，如图2结果所示:在返回的结果中，只有Merluccius Merluccius的物种能和所设 计的引物完全互补结合，没有检验到完全匹配的其它物种，证明引物的特异性较好。
[0032] 4.无须鳕鱼物种特异性检测引物合成
[0033] 在宝生物公司合成无须鳕鱼物种特异性检测引物1对，其序列为：
[0034] 上游引物SEQ ID N0 · 1:5 ' -GTCACGGCACACGCCTTC-3 ' ；
[0035] 下游引物SEQ ID NO · 2:5 ' -GGAGGAGCAGGAACGATGG-3 ' ；
[0036] 5.无须鳕鱼DNA的提取
[0037] 采用DNA提取试剂盒(购于宝生物公司）提取无须鳕鱼(购自于大连国富水产食品 有限公司）模板DNA，用微量分光光度计检测提取无须鳕鱼模板DNA的浓度为100ng。
[0038] 6.无须鳕鱼Col基因的克隆及测序验证
[0039] 琼脂糖凝胶电泳检测：以合成的特异性引物PCR扩增无须鳕鱼的Col基因后，以2% 琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示（如图3所示），经琼脂糖凝胶电泳检测后会分别产生 166bp的特异性电泳条带，电泳效果最好，PCR扩增效率最高。
[0040] 片段的切胶回收:采用宝生物公司的DNA片段回收试剂盒将目的条带回收及纯化， 操作过程按试剂盒附带的说明书进行。
[0041]回收片段的连接、克隆及测序：回收片段与克隆载体PMD-19T连接，转化，经菌液 PCR检测，阳性菌株送上海生物工程有限公司进行序列测定，确定所克隆的目的片段的序列 信息。
[0042] 序列验证:测序结果采用NCBI的Blast N程序通过序列比对进行验证，验证结果显 示，
[0043] 所克隆的片段为无须鳕鱼的Col基因片段。
[0044] 实施例2实时荧光PCR特异性检测体系的应用
[0045] 无须鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，即利用所述无须鳕鱼物种实 时荧光PCR特异性检测体系扩增无须鳕鱼的Col基因，对无须鳕鱼物种进行实时荧光PCR特 异性检测，具体步骤如下：
[0046] 表3无须鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应体系
[0047]
12
[0048] 无须鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表4:[0049] 串4子颂傾伟物轴stR计賠后柿給》丨蚀:?的反应参数
2 采用无须鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测组合物进行实时荧光PCR扩增无须鳕 鱼的Col基因时，以SYBRslPremix Ex Taq DNA聚合酶进行PCR反应，利用SYBR?Green I与 双链DNA结合后发出荧光，检测反应体系中的SYBR?Green I与DNA结合后发出的荧光，通 过设计无须鳕鱼物种特异性引物，从而引发特异性扩增，通过荧光信号的收集处理，获得特 异性扩增曲线，如图4所示，证明了所设计引物进行PCR扩增的有效性及特异性的结果。 [0052]实施例3特异性检测
[0053]利用所述无须鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系进行无须鳕鱼的物种成分实 时荧光PCR特异性检测无须鳕鱼等鳕形目样品，采用DNA提取试剂盒提取各待测样品的模板 DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA的浓度为50ngAxL，分别按照上述步骤4 中所述反应体系及反应参数进行PCR扩增，产生的30个循环以下的特异性扩增曲线即为无 须鳕鱼，其他样品在30个循环以后出现扩增曲线或没有扩增曲线，此方法可以准确的对无 须鳕鱼的成分进行鉴定，具有很好的特异性，如图5所示。
[0054]实施例4灵敏度检测
[0055]采用DNA提取试剂盒提取阳性样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取 的模板 DNA 梯度稀释，制备成 25Γ^/μL、5Γ^/μL、lng/yL、0 · 2ng/yL、0 .(Mng/yl^O.Olng/yLef 浓度梯度样品，分别按照上述步骤3中所述反应体系及反应参数进行实时荧光PCR扩增，以 确定本标准方法的检测灵敏度，结果如图6所示，所产生特异性扩增曲线即为无须鳕鱼，当 DNA浓度2 0.04ng/yL时均可以特异扩增，即该标准方法的检测灵敏度为0.04ng/yL。此方法 可以准确的对无须鳕鱼的成分进行鉴定，具有很好的灵敏度。
[0056]以上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的 具体实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明 的构思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。
[0057]
【主权项】
1. 一种无须轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测引物，其特征在于：引物序列如SEQ ID NO. 1和沈Q ID NO.2所示。2. -种无须轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测体系，其特征在于:包括如权利要求1所 述的引物。3. 根据权利要求2所述的一种无须轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测体系，包括下述试 剂： 2X 浓巧的 SYBRK Premix Ex Taq 12 5 μ L 浓度为10 μ mol/L的上游引物SEQ ID Ναι 0.25 μ L 浓度为10 μ mol/L的下游引物SEQ阻Ν0.2 0.25 yL。 浓度^Ong的待检样品的DNA模板 1 μ L 双蒸氷 11 w:L4. 根据权利要求2所述的一种无须轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测体系，其特征在 于:所述检测体系的反应参数为:变性，95°C，30s;扩增，95°(：，53;60°(：，3〇3,40个循环。5. 利用权利要求2所述检测体系对无须轄鱼物种进行实时巧光PCR特异性检测。
【文档编号】C12Q1/68GK105838787SQ201610204780
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】刘淑艳, 孙晓飞, 宋大贺, 万超
【申请人】刘淑艳, 孙晓飞, 宋大贺, 万超