用于定性检测白血病融合基因的引物、探针、试剂盒及方法

用于定性检测白血病融合基因的引物、探针、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，公开了一种用于检测白血病融合基因的引物和探针组合、含有该引物和探针组合的试剂盒以及采用该引物和探针组合或试剂盒进行白血病融合基因检测的多重荧光RT?PCR方法。本发明基于多重荧光RT?PCR技术，简单、快捷，灵敏度高。此外，本发明通过合理的引物和探针搭配，有效避免了引物与引物之间、引物与探针之间以及探针与探针之间的相互作用，减少了检测误差。采用本发明的检测方法可以全面地对45种白血病融合基因进行定性检测，有效缩短了检测时间，为临床白血病的诊断、疗效评价以及预后提供了非常重要的检测手段。
【专利说明】
用于定性检测白血病融合基因的引物、探针、试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于定性检测白血病融合基因的引物、 探针、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 白血病是儿童和青年中最常见的一种恶性克隆性疾病。多项研究表明大部分的白 血病患者中存在某种染色体结构的畸变(缺失、重复、倒位、易位等），这些是导致白血病发 生以及发展的重要原因。染色体结构的畸变，会导致原癌基因及抑癌基因的结构变异，使得 癌基因、原癌基因突变激活，抑癌基因缺失或失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。因而 不同的融合基因已经成为不同类型白血病的分子生物学特异性标志。如慢性髓细胞白血病 (CML)中的BCR-ABL1融合基因，急性早幼粒细胞白血病(APL)中的PML-RARA融合基因已成为 各自的分子标志并进一步成为治疗的靶标。2000年WHO关于白血病分型的标准中更是将其 中一些常见的异常归纳为白血病基本诊断的标准之一。鉴于白血病相关融合基因的检测对 于白血病诊断、分型、临床治疗选择、预后疗效评价以及微小残留病(MRD)检测上的临床价 值，融合基因检测技术的开发具有极大的临床意义和市场价值。
[0003] 目前，融合基因的检测方法主要包括染色体核型分析、荧光原位杂交技术以及聚 合酶链式反应(PCR)。与染色体核型分析和荧光原位杂交技术相比，PCR检测方法具有快速 有效、灵敏度高等优点，在临床上有较广的应用。多重PCR技术是指在同一个PCR体系中加入 多对引物，能够同时扩增出多个DNA片段。作为PCR重要的衍生技术，多重PCR可以同时扩增 多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，尤其是能够提高检测的灵敏度。 荧光RT-PCR是在逆转录之后进行实时荧光PCR检测，其主要优势在于用实时荧光PCR平台代 替普通的PCR以及电泳分析。实时荧光PCR具有如下优点：（1)闭管操作、封闭状态检测，减少 了模板污染和假阳性的可能；（2)无需对PCR产物进行后处理，操作更简便快速；（3)灵敏度 高，可以检测单拷贝基因；（4)特异性高，可通过探针与靶序列特异性的结合，特异性地检测 目的基因；（5)通过标准曲线和Ct值进行定量分析。2003年25个欧洲实验室通过EAC项目 (Europe Against Cancer Program)合作，对白血病中常见的10个融合基因的检测建立了 标准化的实时荧光RT-PCR方法，包括荧光PCR引物以及探针（Leukemia，2003,17,2318- 2357)。之后许多针对白血病融合基因的荧光检测方法都是在此项研究的基础上发展起来 的。
[0004] 然而，多重荧光RT-PCR技术需要在同一个PCR反应体系中加入多对引物，甚至是多 条探针，这样就增加了多对引物以及多条探针在反应体系中相互作用以及形成二聚体的几 率，从而降低了PCR反应的特异性和效率，甚至不能扩增出特异性目标产物。此外，随着人们 对白血病研究的不断深入，越来越多的白血病融合基因已被发现，当前检测白血病融合基 因的方法已经远远不能满足人们对于同时检测绝大部分融合基因的需求，亟需一种快速、 有效且易于标准化的能同时定性检测绝大部分白血病融合基因的方法。

【发明内容】

[0005] 本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的白血病融合基因数据库，重 新设计了用于检测白血病融合基因的检测引物和探针以及多重荧光RT-PCR方法。本发明的 检测方法快速、有效且易于对45种白血病融合基因进行标准化的高灵敏度定性检测。
[0006] 为此，本发明一方面提供了一种用于检测白血病融合基因的引物和探针组合，其 由SEQ ID N0.1-114所示的引物和探针组成。
[0007] 在本发明优选的实施方案中，该引物和探针组合进一步由第1-12组引物和探针组 成，其中第1组由SEQ ID N0.1-9所示的引物和SEQ ID N0.10-11所示的探针组成，第2组由 SEQ ID N0.12-16所示的引物和SEQ ID N0.17-18所示的探针组成，第3组由SEQ ID NO. 19- 27所示的引物和SEQ ID NO.28-29所示的探针组成，第4组由SEQ ID NO.30-35所示的引物 和SEQ ID NO. 36-38所示的探针组成，第5组由SEQ ID NO. 39-43所示的引物和SEQ ID NO.44-45所示的探针组成，第6组由SEQ ID NO.46-50所示的引物和SEQ ID NO.51-52所示 的探针组成，第7组由SEQ ID NO.53-59所示的引物和SEQ ID NO.60-62所示的探针组成，第 8组由SEQ ID N0.63-66所示的引物和SEQ ID N0.67-88所示的探针组成，第9组由SEQ ID NO.69-76所示的引物和SEQ ID NO.77-78所示的探针组成，第10组由SEQ ID NO.79-87所示 的引物和SEQ ID NO.88-89所示的探针组成，第11组由SEQ ID NO.90-99所示的引物和SEQ ID NO. 100-101所示的探针组成，第12组由SEQ ID NO. 102-111所示的引物和SEQ ID NO. 112-114所示的探针组成。
[0008] 本发明通过选择相关基因断裂位点上游序列和下游序列，来进行特异性多重荧光 RT-PCR引物和探针的设计。所设计的引物Tm值均在60°C附近，整合搭配各个引物，从而尽量 避免了引物二聚体的产生;探针Tm值均在70°C附近，避免了探针与其他非特异性序列之间 的结合，同时也避免了探针相互之间形成复杂的二聚体，提高了 PCR扩增的特异性和效率。
[0009] 针对45种白血病融合基因，本发明设计的具体引物和探针情况如表1所示。
[0010] 表1、本发明的引物和探针情况表
[0014]
[0015] 在本发明优选的实施方案中，部分探针的5'端连接荧光报告基团FAM，3'端连接荧 光淬灭基团TAMRA;其余探针的5 '端连接荧光报告基团J0E，3 '端连接荧光淬灭基团TAMRA; 内参基因 GAPDH探针的5'端连接荧光报告基团J0E，3'端连接荧光淬灭基团TAMRA。
[0016] 本发明另一方面提供了一种用于检测白血病融合基因的试剂盒，其包含本发明所 述的引物和探针组合。
[0017] 在本发明优选的实施方案中，试剂盒中全部引物的浓度为3pm〇lAU，全部探针的 浓度为 2ρηιο1/μ1。
[0018] 本发明另一方面提供了本发明所述的引物和探针组合在制备检测白血病融合基 因试剂盒中的应用。
[0019] 本发明再一方面提供了本发明所述的引物和探针组合，或者本发明所述的试剂盒 在检测白血病融合基因中的应用。
[0020] 本发明最后一方面提供了一种检测白血病融合基因的多重荧光RT-PCR方法，其包 含以下步骤：
[0021] 1、获取待测样品的cDNA。
[0022] cDNA合成可以采用Promega逆转录试剂盒，简要流程如下：
[0023] 取 1 ~5ug总RNA用于逆转录，取50ug/ml的Random Prime 1.5ul和 15ul的RNA产物， 70°C反应5min以促进RNA二级结构的打开，放置冰上至少2min。加入5 X Reaction Buffer 6uK25mM MgCl2 3.8uKPCR Nucleotide Mixl.5uK RNasinRibonuclease Inhibitor 0.3ul、GoScript? Reverse Transcriptaselul、Nuclease_Free Water 0.9ul至终体积 30ul 〇
[0024] 逆转录程序为：25°C5min ;42°C60min;70°C 15min。将获得的 cDNA 用Nuclease-Free Water进行相应地稀释(根据总RNA浓度进行计算），稀释后的cDNA用来进行融合基因的多重 荧光RT-PCR定性检测。
[0025] 2、采用本发明所述的引物和探针组合，或采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获 取的cDNA为模板，进行多重荧光RT-PCR扩增，并收集荧光信号。
[0026]在本发明的多重荧光RT-PCR检测中，20ul的反应体系包括：10ul的荧光PCR反应 液、lul的R0X Reference Dye、5ul的稀释后cDNA模板（Nuclease-Free Water作为阴性对 照）、2ul的引物探针混合液以及2ul的Nuclease-Free Water。
[0027] 在ABI 7500荧光PCR仪上运行程序为：先经过5〇1：21^11，95°(：1〇1^11;然后再经过95 °C 15sec，6CTC30sec，共 45 个循环。
[0028] 3、分析内参基因 GATOH的扩增结果，如果CT值小于30，检测过程有效，如果CT值大于 35,重新进行验证检测。
[0029]在本发明的多重荧光RT-PCR检测中，内参对照引物和探针采用人GAPDH基因，阴性 对照（水）中未添加 cDNA模板。只有内参基因 GAPDH的CT值小于30时，检测过程才有效，才进 入结果判读步骤。
[0030] 4、内参基因 GAPDH的CT值小于30时，进行白血病融合基因的结果判读。
[0031] 在采用本发明的多重荧光RT-PCR检测方法对待测样本进行检测后，只有当内参基 因 GATOH有J0E焚光信号，且其中1管中能够检测出FAM或J0E焚光信号，无模板对照品无信号 时，待测样本的检测结果才有效且呈阳性。
[0032] 在本发明优选的实施方案中，部分探针的5'端连接荧光报告基团FAM，3'端连接荧 光淬灭基团TAMRA;其余探针的5 '端连接荧光报告基团J0E，3 '端连接荧光淬灭基团TAMRA; 内参基因 GAPDH探针的5'端连接荧光报告基团J0E，3'端连接荧光淬灭基团TAMRA。
[0033]在本发明进一步优选的实施方案中，全部引物的浓度为3pm〇lAU，全部探针的浓 度为 2ρηιο1/μ1。
[0034] 由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。
[0035] 1、与现有的染色体核型分析和荧光原位杂交技术相比，本发明的检测方法基于多 重荧光RT-PCR技术，因此简单、快捷，灵敏度高。同时，本发明采用的多重荧光RT-PCR技术与 多重巢式RT-PCR相比，具有更高的灵敏度和特异性。
[0036] 2、本发明的检测方法通过合理的引物和探针搭配，可以有效避免引物与引物之 间、引物与探针之间以及探针与探针之间的相互作用，从而提高了特异性，降低了假阳性， 减少了检测误差。
[0037] 3、本发明的检测方法可以全面地对45种白血病融合基因进行高灵敏度的定性检 测，有效缩短了检测时间，为临床白血病的诊断、疗效评价以及预后提供了非常重要的检测 手段。
【附图说明】
[0038] 图1:具有代表性的白血病融合基因 （BCR-ABL1、CBFB-MYH11、PML-RARA和AML1- ΕΤ0)的断裂位点以及引物和探针设计位点结构示意图。
[0039] 图2:实施例1中采用白血病融合基因阳性细胞系和阴性细胞系检测本发明检测体 系特异性的荧光扩增曲线图。
[0040] 图3:实施例2中采用白血病融合基因阳性细胞系检测本发明检测体系重复性的荧 光扩增曲线图。
[0041] 图4:实施例3中采用白血病融合基因阳性细胞系和阴性细胞系检测本发明检测体 系灵敏性的荧光扩增曲线图。
[0042]图5:实施例4中采用本发明检测体系进行临床样本检测的荧光扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0043]下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本 发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发 明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0044]实施例1:利用融合基因阳性细胞系和阴性细胞系检测本发明检测体系的特异性 [0045] 本实施例以确定含有BCR-ABLl(p210)融合基因的K562阳性细胞系、AML1-ET0融合 基因的Kasumi细胞系以及不含融合基因的HL60阴性细胞系来验证本发明检测方法的可行 性及特异性。其中K562细胞系、Kasumi细胞系、HL60细胞系均购自北京鼎国昌盛生物技术有 限责任公司。
[0046]本实施例的具体检测方法如下：
[0047] 1、细胞培养
[0048] 按照细胞培养的标准操作培养K562细胞系、Kasumi细胞系以及HL60细胞系，置于 37 °C、5 % C02培养箱内培养。
[0049] 2、核酸提取
[0050] 建议使用TIANGEN RNAprep Pure Blood Kit试剂盒，按照试剂盒说明书操作来提 取细胞系中的RNA，之后立即进行逆转录。
[0051] 3、逆转录
[0052]建议使用Promega GoScript? Reverse Transcriptase试剂盒，按照试剂盒说明 书操作来获得cDNA。逆转录的cDNA用Nuclease-Free Water进行相应地稀释(根据总RNA浓 度进行计算），稀释后的cDNA用来进行荧光RT-PCR检测。
[0053] 4、多重荧光RT-PCR检测
[0054] (1)多重荧光RT-PCR检测
[0055] 20ul的反应体系中依次加入Nuclease-Free Water 2ul、稀释后的cDNA模板5ul、 ROX Reference Dye lul、引物探针混合液2ul、荧光PCR反应液10ul。
[0056] 在ABI 7500荧光PCR仪上运行程序为：先经过5〇1：21^11，95°(：1〇1^11;然后再经过95 °C 15sec，6CTC30sec，共 45 个循环。
[0057] 扩增过程中仪器自动收集荧光信号。
[0058] (2)数据收集处理和分析
[0059]荧光PCR扩增结束后，首先分析内参GATOH的扩增结果，如果其CT值小于30，表明整 个检测过程有效;如果其CT值大于35，则需要重新验证检测。
[0060] (3)结果检测
[0061] 本发明多重荧光RT-PCR检测体系特异性的扩增曲线结果参见说明书附图2。其中 图2A为K562阳性细胞系的融合基因检测结果，图2B为Kasumi阳性细胞系的融合基因检测结 果，图2C为HL60阴性细胞系的融合基因检测结果，图2D为阴性对照(水)的检测结果。
[0062] 从附图2可以看出，图2A、2B、2C中都可以检测到内参GATOH的荧光信号，且GAPDH的 Ct值都小于30，说明整个检测过程有效。K562阳性细胞系中含有BCR-ABL1的融合基因，R3中 特异性地检测到FAM标记的BCR-ABL1荧光信号，如图2A所示；Kasumi阳性细胞系中含有 AML1-ET0的融合基因，R9中特异性地检测到HEX标记的AML1-ET0荧光信号，如图2B所示； HL60阴性细胞系中不含融合基因，除了内参GAPDH的荧光信号外，R1-R12中均检测不到其他 的荧光信号，如图2C所示；阴性对照无模板，扩增不出内参基因 GATOH和融合基因，因而也检 测不到荧光信号，如图2D所示。
[0063] 由此可见，本实施例的检测结果与融合基因阳性细胞系及阴性细胞系的特性相一 致，表明利用本发明的检测体系可以特异性地进行白血病融合基因的定性检测。
[0064] 实施例2:利用融合基因阳性细胞系检测本发明检测体系的重复性
[0065] 本实施例同样以确定含有BCR-ABL1融合基因的K562阳性细胞系、AML1-ET0融合基 因的Kasumi细胞系来验证本发明检测体系的重复性。
[0066]具体检测方法如下：
[0067]采用与实施例1相同的多重荧光RT-PCR反应体系和反应条件，以K562cDNA和 Kasumi cDNA为模板，每个样本重复检测三次，重复性检测的荧光PCR扩增曲线参见说明书 附图3。其中图3A为K562阳性细胞系的融合基因检测结果，图3B为Kasumi阳性细胞系的融合 基因检测结果。如图3A所示，K562的阳性细胞系进行三次重复检测，均检测到内参GAPDH基 因和融合基因 BCR-ABL1的荧光信号，且GAPDH和BCR-ABL1的CT值吻合得很好；同样地， Kasumi的阳性细胞系的三次重复实验结果也相吻合。通过本实施例表明，利用本发明的检 测体系进行白血病融合基因的多重荧光RT-PCR定性检测具有很好的重复性。
[0068]实施例3:利用融合基因阳性细胞系和阴性细胞系检测本发明检测体系的灵敏度 [0069] 本实施例同样以确定含有BCR-ABLl(p210)融合基因的K562阳性细胞系、AML1-ET0 融合基因的Kasumi细胞系以及不含融合基因的HL60阴性细胞系来验证本发明检测体系的 灵敏性。具体检测方法如下：
[0070] 以HL-60细胞系（不含融合基因的阴性细胞系）分别对K562细胞系（含有BCR-ABL1 融合基因的阳性细胞系）和Kasumi细胞系（含有AML-ET0融合基因的阳性细胞系）进行 100 %、10 %、1%、1%〇、0 · 5%〇、0 · 25%〇、0 · 125%〇 (稀释后阳性细胞系与阴性细胞系的比例）的 稀释，用稀释好的混合细胞系提取RNA并逆转录成cDNA，进行多重荧光RT-PCR检测。
[0071] 采用与实施例1相同的多重荧光RT-PCR反应体系和反应条件，多重荧光RT-PCR的 扩增曲线参见说明书附图4。图4A 代表 100%Κ562、10%Κ562、1%Κ562、1%〇Κ562、0.5%〇Κ562、 0 · 25%〇Κ562和0 · 125%〇Κ562的荧光检测结果；图4B代表 100 %Kasumi、10 %Kasumi、1 % Kasumi、l%〇Kasumi、0 · 5%〇Kasumi、0 · 25%〇Kasumi 和0 · 125%〇Kasumi 的焚光检测结果。
[0072] 由此可见，当达到0.125%〇K562或0.125%〇Kasumi细胞（8000个HL60细胞中含有1个 K562或1个Kasumi细胞)时，本发明的多重荧光RT-PCR检测体系检测出的融合基因 BCR-ABL1 和AML 1 -ΕΤ0的CT值仍小于35，而相应的巢式RT-PCR方法却检测不到相应的融合基因。由此 表明，与巢式RT-PCR相比，本发明的多重荧光RT-PCR检测体系对白血病融合基因的检测灵 敏度远高于相应的巢式RT-PCR检测方法。
[0073]实施例4:采用本发明的检测体系进行临床样本的检测
[0074]本实施例采集临床白血病患者外周血或骨髓血样本，按照本发明的检测体系进行 45种融合基因的定性检测。其中检测到的融合基因的异构体包括8〇?481^1(?190)、8〇?- △81^(?210)、卩]\^-1^1^(1^型）、？]\^-1^1^(5型）、〇8卩8-]\〇^11(厶型）、511^^1^42厶-?8父1、 AML1-ET0、TEL-AML1、SET-CAN、DEK-CAN、MLL-ELL、MLL-AF^PMLL-AF6#。
[0075]利用本发明的多重荧光RT-PCR检测体系检测临床样本，操作步骤包括血液样本中 白细胞RNA提取、RNA逆转录为cDNA和多重荧光RT-PCR检测。具体的操作方法同本发明实施 例1。临床样本检测的荧光扩增曲线参见说明书附图5。其中图5A为采用本发明的多重荧光 RT-PCR检测到的4种融合基因异构体的荧光结果，包括BCR-ABLl(pl90)、BCR-ABLl(p210)、 PML-RARA(L型）和PML-RARA(S型）；图5B为采用本发明的多重荧光RT-PCR检测到的3种融合 基因异构体的荧光结果，包括CBFB-MYH11(A型）、SIL-TAL1和E2A-TOX1;图5C为采用本发明 的多重荧光RT-PCR检测到的4种融合基因异构体的荧光结果，包括AML1-ET0、SET-CAN、DEK- CAN和MLL-ELL。
[0076]由此可见，利用本发明的多重荧光RT-PCR检测体系，检测到的临床样本融合基因 的型别几乎覆盖了临床上常见的白血病融合基因，且检测结果与临床诊断相一致。
[0077]以上结果表明，本发明的多重荧光RT-PCR检测体系可以全面地进行白血病45种融 合基因的定性筛查。并且与巢式RT-PCR检测方法相比，本发明的多重荧光RT-PCR检测体系 具有较高的灵敏度和特异性，检测工序简单，大大缩短了检测时间，为白血病的诊断、化疗 及预后提供了一种更加全新快速简便的基因诊断技术，具有广泛的临床应用价值。
[0078]
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[0080]
[0081：
[0082]
[0083]
[0084]
[0085]
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[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
【主权项】
1. 一种用于检测白血病融合基因的引物和探针组合，其由SEQ ID NO.1-114所示的引 物和探针组成。2. 根据权利要求1所述的引物和探针组合，其进一步由第1-12组引物和探针组成，其中 第1组由SEQ ID NO. 1-9所示的引物和SEQ ID NO. 10-11所示的探针组成，第2组由SEQ ID NO. 12-16所示的引物和SEQ ID NO. 17-18所示的探针组成，第3组由SEQ ID NO. 19-27所示 的引物和SEQ ID NO.28-29所示的探针组成，第4组由SEQ ID NO.30-35所示的引物和SEQ ID NO.36-38所示的探针组成，第5组由SEQ ID NO.39-43所示的引物和SEQ ID NO.44-45所 示的探针组成，第6组由SEQ ID NO.46-50所示的引物和SEQ ID NO.51-52所示的探针组成， 第7组由SEQ ID NO.53-59所示的引物和SEQ ID NO.60-62所示的探针组成，第8组由SEQ ID NO.63-66所示的引物和SEQ ID NO.67-88所示的探针组成，第9组由SEQ ID NO.69-76所示 的引物和SEQ ID NO.77-78所示的探针组成，第10组由SEQ ID NO.79-87所示的引物和SEQ ID NO.88-89所示的探针组成，第11组由SEQ ID NO.90-99所示的引物和SEQ ID NO. 100-101所示的探针组成，第12组由SEQ ID NO. 102-111所示的引物和SEQ ID NO. 112-114所示 的探针组成。3. 根据权利要求1或2所述的引物和探针组合，其中部分探针的5'端连接荧光报告基团 FAM，3 '端连接荧光淬灭基团TAMRA;其余探针的5 '端连接荧光报告基团JOE，3 '端连接荧光 淬灭基团TAMRA;内参基因 GAPDH探针的5 '端连接荧光报告基团JOE，3 '端连接荧光淬灭基团 TAMRA〇4. 一种用于检测白血病融合基因的试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项所述的引物 和探针组合。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其中全部引物的浓度为3ρπι〇1/μ1，全部探针的浓度为 2ρηιο1/μ1 〇6. 权利要求1-3中任一项所述的引物和探针组合在制备检测白血病融合基因试剂盒中 的应用。7. 权利要求1-3中任一项所述的引物和探针组合，或者权利要求4或5所述的试剂盒在 检测白血病融合基因中的应用。8. -种检测白血病融合基因的多重荧光RT-PCR方法，其包含以下步骤： (1) 获取待测样品的cDNA; (2) 采用权利要求1-3中任一项所述的引物和探针组合，或采用权利要求4或5所述的试 剂盒，以步骤(1)中获取的cDNA为模板，进行多重荧光RT-PCR扩增，并收集荧光信号； (3) 分析内参基因 GAPDH的扩增结果，如果CT值小于30,检测过程有效，如果CT值大于35， 重新进行验证检测； (4) 内参基因 GAPDH的CT值小于30时，进行白血病融合基因的结果判读。9. 根据权利要求8所述的方法，其中部分探针的5 '端连接荧光报告基团FAM，3 '端连接 荧光淬灭基团TAMRA;其余探针的5'端连接荧光报告基团J0E，3'端连接荧光淬灭基团 TAMRA;内参基因 GAPDH探针的5'端连接荧光报告基团JOE，3'端连接荧光淬灭基团TAMRA。10. 根据权利要求8或9所述的方法，其中全部引物的浓度为3ρπι〇1/μ1，全部探针的浓度 为 2ρηιο1/μ1 〇
【文档编号】C12N15/11GK105838792SQ201610254799
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】郑仲征, 杜金伟, 张鹏, 王莉萍, 潘捷, 杜可明
【申请人】上海荻硕贝肯生物科技有限公司