鸡mhc b-g座位全序列测定和snp检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了鸡MHC B?G座位全序列测定和SNP检测方法及试剂盒，属于生物技术领域。检测方法包括：（1）引物设计：设计鸡MHC B?G座位全序列测定的特异性引物，特异性引物包括SEQ ID NO 1?12；（2）DNA提取：从鸡全血中提取DNA；（3）PCR扩增；（4）琼脂糖胶电泳检测；（5）对目的片段进行克隆、测序；（6）SNP分析：所获序列用Clustalw软件进行比对，与Genbank基因序列进行比较，统计单倍型和单核苷酸多态性（SNP）。试剂盒，包括6对特异性引物信息SEQ ID NO 1?12，灭菌双蒸水，dNTP，Taq酶，PCR扩增缓冲液。本发明为测定鸡MHC B?G座位基因全序列，分析鸡MHC B?G座位遗传多样性提供了技术平台。
【专利说明】
鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及MHC B-G座位全序列测定试剂盒及其SNP检测方法，本发明主要用于分 析鸡MHC B-G座位全序列遗传多样性，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 鸡MHC位于16号染色体上，又称为B复合体，分为2个区域，一个是含有典型M肥基因 的BF/化区域和决定红细胞抗原的BG区域，BF/BL区分别相当于哺乳动物基因的I类抗原和 n类抗原;B-G区编码产物又称IV类抗原，为禽类所特有；另一个是遗传不连锁的基因簇Y (Restriction fragment poIymorphism-Rfp-)(Schierman and Nordskog，1961)。鸡MHC B-G座位全长6425bp，存在丰富的变异位点，获得MHC B-G座位全长序列，并进行SNP分析对 于研究鸡免疫能力及群体遗传多样性具有重要意义。
[0003] MHC基因的变异可反映基因组水平的变异，通过MHC基因的变异分析，可有效地评 估品种遗传多样性的水平。MHC基因的变异水平常常被认为是脊椎动物机体免疫系统识别 外来寄生物(细菌、病毒、寄生虫等)能力的重要部分。因此，MHC基因被认为是群体遗传学和 保护遗传学研究中最新的基因系统（hangoulis et al.,1999;Jacob et al.,2000)。
[0004] 单核巧酸多态性（single nucleotide polymo;rphism，SNP)指在基因组水平上由 单个核巧酸的变异所引起的DNA序列多态性，是可遗传的变异中最常见的一种。本发明采用 PCR扩增原理，克隆、测序，序列分析和同源性比较，并进行序列拼接，分析基因 SNP位点。
【发明内容】
[0005] 为了解决W上技术问题，本发明提供一种MHC B-G座位全序列测定试剂盒及SNP检 测方法，其特征在于准确性高、快速、价格低廉。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种MHC B-G座位全序列SNP检测方法，包括W下步 骤：
[0007] (1)引物设计:设计鸡M肥B-G座位全序列测定的特异性引物，特异性引物包括SEQ ID NO 1-12,沈Q ID NO 1-12见表 1;
[000引表1 MHC B-G座位引物信息 [00091
[00101
[0011] (2)DNA提取:从鸡全血中提取DM;
[001 ^ (3似步骤(2)提取的DNA进行PCR扩增，获得目的片段;MHC B-G座位特异性引物在 梯度PCR仪上进行；
[OOK] (4)PCR反应结束后，琼脂糖胶电泳检测反应是否成功，是否是目的片段；
[0014] (5)对目的片段进行克隆、测序
[0015] PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶，使用胶回收试剂盒回收，连接到 pMD18-T载体上，转化于D册a大肠杆菌感受态细胞，涂布于Amp/X-gal-IPTG/LB平板上克 隆，挑取单个白色菌落进行培养，挑选鉴定为阳性的克隆，送生物公司双向测序；
[0016] (6) SNP 分析
[0017] 通过C虹omas软件读取,通过双向重复测序进行校正，所获序列用Clus化Iw软件进 行比对，与Genbank基因序列进行比较，统计单倍型和单核巧酸多态性(SNP)。
[0018] 本发明中步骤(3) PCR反应条件设置见表2:
[0019] 表2 PCR扩增反应程序
[0020]
[0021] 6对引物的退火溫度55-60°C。
[0022] BGl引物扩增对应基因序列
[0023]
[0035]
[0036] 其中MHC B-G座位引物信息见表1，PCR反应体系（2加 L体系）；
[0037] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0038] 第一，本发明MHC B-G座位全序列测定试剂盒及SNP检测方法，准确性可靠、快速、 特异性强、价格低廉，能实现多重反应、自动化程度高。
[0039] 第二，MHC基因的变异可反映基因组水平的变异，通过M肥基因的变异分析，可有效 地评估品种遗传多样性的水平。MHC基因的变异水平常常被认为是脊椎动物机体免疫系统 识别外来寄生物(细菌、病毒、寄生虫等)能力的重要部分。
[0040] 第S ,MHCB-G区编码产物又称IV类抗原，为禽类所特有；鸡MHC B-G座位全长 642化P，存在丰富的变异位点，获得MHC B-G座位全长序列比较困难，分析MHC B-G座位全基 因序列SNP位点对于研究鸡免疫能力及群体遗传多样性具有重要意义，具有潜在的应用价 值和社会效应。
【附图说明】
[0041 ]图1是本发明测序峰图与序列比较图；
[0042] 其中：峰图下方大写字母为测序基因序列，峰图上方小写字母为Genbank红色原鸡 基因序列，标注红色碱基处为突变位置，Y代表C/T突变，R代表A/G突变。横坐标代表基因序 列的位置。
【具体实施方式】
[0043] 本发明专利结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，运些实施例仅用于说 明目的，而不用于限制本发明范围。
[0044] 实施例:狼山鸡MHC B-G座位全序列测定及SNP检巧巧法
[0045] 狼山鸡属蛋肉兼用型鸡种。原产江苏如东、南通两县。全国各地均有饲养。狼山鸡 是我国古老的优良地方品种，并在世界家禽品种中负有盛名。
[0046] 目前我国采用保种场和基因库保种，如东县狼山鸡保种场进行原地保护，国家级 地方鸡种基因库(江苏)于2002年引种进行异地保护。狼山鸡遗传性能稳定，繁殖力、抗病力 及适应性强，肉质品味鲜美，香气浓郁，致密香嫩，深受消费者欢迎。
[0047] 翅静脉采集30只狼山鸡全血，应用传统的苯酪/氯仿法提取DNA，并将DNA浓度稀释 到 50ng/]il。
[004引本发明中狼山鸡MHC B-G座位全序列测定试剂盒，包括：
[0049]
[0050] 检测方法中MHC B-G座位全序列测定条件的优化
[(K)引](1)引物设计:根据GenBank上登录的红色原鸡MHC B-G座位序列，利用PrimerS. 0 设计扩增6425bp全序列的特异性引物，经过PCR预扩增和条件优化，最终选择6个特异性引 物，引物信息见表1。
[0052] (2似提取的DNA进行PCR扩增，获得目的片段。M肥B-G座位特异性引物在梯度PCR 仪上进行。
[0053] PCR反应体系（25uL体系），参照狼山鸡M肥B-G座位全序列测定试剂盒，包括(1) [0化4]
[0055] 在20化1的PCR薄壁管中，按照上述PCR反应体系加入各试剂，充分混匀后短暂离 屯、，在梯度PCR仪上进行
[0056] (3)PCR反应结束后取化1反应产物在2%琼脂糖胶，IXT肥中电泳，检测反应是否 成功，是否是目的片段。
[0057] (4)对目的片段进行克隆、测序
[0058] PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶，使用胶回收试剂盒回收，连接到 PMD18-T载体上，转化于D册a大肠杆菌感受态细胞，涂布于Amp/X-gal-IPTG/LB平板上克 隆，挑取单个白色菌落进行培养，挑选鉴定为阳性的克隆，送上海生物技术有限公司进行双 向测序。
[0059] (5) SNP分析:通过chromas软件读取，通过双向重复测序进行校正，序列拼接，所获 序列用Clus化Iw软件进行比对，与Genbank基因序列进行比较，统计单倍型和单核巧酸多态 性(SNP)O
[0060] BGl引物扩增对应基因序列
[0061] TCATATTCTCCCCACACTTCTTCCCCATATTCTTTCCAAATCCTCTTCCCCATCTCCTCCACCGTCTCTTTCTCACA GTCCTTCCTCTCTCTCCCTAAATTCTTCCCCCCTCCTCTTCTCCAGCACAGATGGCCTTCACATCGGGCTGCAACCA CCCCAGTTTCACCCTCCCCTGGAGGACCCTCCTGCCTTATCTCGTGGCTCTGCACCTCCTCCAGCTGGGATCAGGTA
【主权项】
1. 鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法，其特征是，包括以下步骤： (1)引物设计:设计鸡MHC B-G座位全序列测定的特异性引物，特异性引物包括SEQ ID NO 1-12； (2 )DNA提取:从鸡全血中提取DNA; (3) PCR扩增：以步骤(2)提取的DNA通过所述特异性引物SEQ ID NO 1-6进行PCR扩增， 获得目的片段;MHC B-G座位特异性引物的PCR扩增在梯度PCR仪上进行； (4) 琼脂糖胶电泳检测：PCR反应结束后，琼脂糖胶电泳检测反应是否成功，是否是目 的片段； (5) 对目的片段进行克隆、测序：PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶，使用胶 回收试剂盒回收，克隆，挑取单个白色菌落进行培养，挑选鉴定为阳性的克隆，双向测序； (6) SNP分析:将步骤(5)所获序列用Clustalw软件进行比对，与Genbank基因序列进行 比较，统计单倍型和单核苷酸多态性SNP。2. 根据权利要求1所述的鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法，其特征是，步骤 (3)所述PCR扩增的反应体系为： (1) DNA 模板 50ng/ul 3yL， (2) 10 XBuffer缓冲液 2.5yL， (3) dNTP 2.5mM/each 0.5yL, (4) Taq酶5U/yL 0.5yL, (5) 灭菌 ddH2〇 18yL， (6) 正反向引物混合物SEQ ID NO 1-12 0.5yL〇3. 根据权利要求2所述的鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法，其特征是，步骤 (3)所述PCR扩增的反应条件为:95°C预变性lOmin，然后35个循环的95°C变性20-30s， 退火55-60°C 20-30 s，72°C 20-30s，然后72°C 5min，4°C保存；特异性引物SEQ ID NO 1-12的退火温度55-60° C。4. 根据权利要求1、2或3所述的鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法，其特征是， 步骤(2)所述提取的DNA通过所述特异性引物SEQ ID NO 1-12进行PCR扩增后的长度分别为 1351、989、1520、959、1495、1090。5. -种应用权利要求1-4所述的鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法的试剂盒， 其特征是，所述试剂盒包括特异性引物SEQ ID NO 1-12。
【文档编号】C12Q1/68GK105838798SQ201610280765
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月30日
【发明人】屠云洁, 邹剑敏, 束婧婷, 章明, 单艳菊, 姬改革, 龚建森, 张笛
【申请人】江苏省家禽科学研究所