Kcnk2基因的新用图

文档序号:10483845阅读:474来源:国知局
Kcnk2基因的新用图
【专利摘要】本发明涉及KCNK2基因的新用途,具体涉及KCNK2基因及其表达产物作为肿瘤标志物在诊治乳头状甲状腺癌中的应用。为了能更精确诊断甲状腺癌,避免漏诊、误诊,发明人基于测序和数据分析筛选肿瘤分子标志物,结果表明,本发明KCNK2基因可用于制备甲状腺乳头状癌辅助诊疗制剂,具有很好的临床应用价值。
【专利说明】
KCNK2基因的新用途
技术领域
[0001] 本发明设及生物医药领域,具体的本发明设及KCNK2基因的新用途,更具体设及 KCNK2基因及其表达产物作为肿瘤标志物在诊治乳头状甲状腺癌中的应用。
【背景技术】
[0002] 乳头状癌是临床上常见的甲状腺癌的一种,约占所有甲状腺癌的90%。诊断甲状 腺癌检查主要依靠超声检查,是甲状腺癌原发病灶诊断最有价值的方法之一。超声检查亦 有一定的误诊率,临床医师要了解特殊类型甲状腺癌的超声表现,如囊性甲状腺乳头状癌、 弥漫性甲状腺乳头状癌,临床极易与甲状腺囊肿或淋己细胞性甲状腺炎相混淆。细针针吸 细胞学活检(FNA)是评估甲状腺结节最精确且性价比最高的方法。不过也存在漏诊,FNA的 漏诊原因时将其归纳为:穿刺针太细,细胞学检查的标本量不足;与甲状腺肿瘤大小及内部 组织情况有关,甲状腺肿瘤体积越小,定位越困难,穿刺细胞学检查诊断率越低,特别对于 内部有液化的甲状腺肿瘤,穿刺针穿入囊内后只抽出液体,无组织细胞,对诊断无意义;细 胞学诊断对于细胞形态改变突出的疾病最能发挥作用,但对W组织结构改变为主的病变则 有困难。
[0003] 如何精确诊断甲状腺癌,避免漏诊、误诊的现象,是目前临床中亟待解决的问题。 分子生物学的兴起,提供了一个新的解决途径,通过分子检测辅助诊断甲状腺癌,W达到精 准诊疗的目的。鉴于此,发明人采用先进的化Seq 2500对甲状腺乳头状癌(PTC)病例样本和 健康人群进行测序,并对获得的数据进行深加工,筛选出差异显著表达的KCNK2基因。为了 验证KCNK2与甲状腺乳头状癌的关系,又进行了定量实验及慢病毒载体构建及功能验证,结 果表明KCNK2可用于制备甲状腺乳头状癌辅助诊疗制剂,本研究为临床甲状腺乳头状癌的 辅助诊疗提供基础,具有很好的临床应用价值。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供检测KCNK2基因或蛋白在制备甲状腺癌诊断制剂中的应 用。
[0005] 进一步,甲状腺癌为甲状腺乳头状癌。
[0006] 为实现上述目的,发明通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到基因 KCNK2,进 而通过RT-PCR验证了 KCNK2与甲状腺癌具有很好的相关性,可用于制备甲状腺癌辅助诊疗 制剂,具有重要的临床应用价值。
[0007] 进一步,甲状腺的诊断制剂包括用巧光定量PCR方法、基因忍片方法检测甲状腺癌 组织中KCNK2基因的表达。
[000引用于巧光定量PCR方法检测甲状腺癌中KCNK2基因的产品含有一对特异性扩增 KCNK2基因的引物;基因忍片包括与KCNK2基因的核酸序列杂交的探针。
[0009]优选的,巧光定量PCR方法检测基因 KCNK2,采用特异的上游引物和下游引物,上游 引物序列为SEQ ID NO. 1,下游引物序列为SEQ ID NO.2。
[0010] 进一步,检测KCNK2蛋白的化ISA法为使用化ISA检测试剂盒。试剂盒中的抗体可采 用市售的KCNK2单克隆抗体。进一步,所述的试剂盒包括:包被KCNK2单克隆抗体的固相载 体,酶标抗体,酶的底物,蛋白标准品,阴性对照品,稀释液,洗涂液,酶反应终止液等。
[0011] 进一步,检测KCNK2蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒,抗体可采用市售的KCNK2 单克隆抗体。进一步,胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一 步,胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗KCNK2单克隆抗体、质控区(C) 喷点有免疫球蛋白IgG。
[0012] 巧光定量PCR法是通过巧光染料或巧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记 跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可W对产物进行分析,计算待测样品模板的 初始浓度。巧光定量PCR的出现,极大地简化了定量检测的过程,而且真正实现了绝对定量。 多种检测系统的出现,使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率,反应快速、重复 性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[OOU] 基因忍片又称为DNA微阵列化NA microarray),可分为S种主要类型:1)固定在聚 合物基片(尼龙膜,硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或CDNA片段,通常用同位素标记的祀 基因与其杂交,通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列, 通过与巧光标记的祀基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核巧酸探针 阵列,与巧光标记的祀基因杂交进行检测。基因忍片作为一种先进的、大规模、高通量检测 技术,应用于疾病的诊断,其优点有W下几个方面:一是高度的灵敏性和准确性;二是快速 简便;=是可同时检测多种疾病。
[0014] 进一步,甲状腺癌的诊疗制剂包括用免疫方法检测甲状腺乳头状癌中KCNK2蛋白 的表达。优选所述免疫检测方法检测甲状腺乳头状癌中KCNK2蛋白表达的为western blot 和/或化ISA和/胶体金检测方法。
[0015] 酶联免疫吸附实验化LISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等,具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测I gM抗体、应用亲和素和 生物素的化ISA。化ISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶化RP)或者碱性憐酸 酶(AP)O
[0016] 常用的免疫胶体金检测技术:(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片,可用胶体金标记的抗体进行染色,也可在胶体金标记的基础上,W银显影液增强标记, 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面,可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合, 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作 载体,先将抗原或抗体点于膜上,封闭后加待检样本,洗涂后用胶体金标记的抗体检测相应 的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体W条带状固定在膜上,胶体金 标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上,当待检样本加到试纸条一端的样本垫上 后,通过毛细作用向前移动,溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应,当移动至固定的 抗原或抗体的区域时,待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留,聚集 在检测带上,可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条,使用十分方便。
[0017] 本发明的目的在于提供一种检测甲状腺乳头状癌的基因检测试剂盒,试剂盒检测 基因 KCNK2,采用特异的上游引物和下游引物,上游引物序列为SEQ ID NO.1,下游引物序列 为沈Q ID NO.2。
[0018] 进一步,该PC时式剂盒适合于目前存在市场上的所有类型巧光定量基因扩增仪,灵 敏度高,定量快速准确、稳定性好,具有良好的应用前景。
[0019] 进一步,上述巧光定量PC时式剂盒组分包括:特异性引物、内参引物、巧光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物,上游引物序列为SEQ ID NO.1, 下游引物序列为SEQ ID NO. 2。所述内参引物为GAPDH内参引物,上游引物序列为SEQ ID NO.3,下游引物序列为沈Q ID NO.4。
[0020] 本发明目的是提供了一种甲状腺乳头状癌蛋白检测试剂盒,检测试剂盒检测 KCNK2蛋白。进一步的,试剂盒还包括其他检测试剂。
[0021] 本发明目的是提供了一种检测甲状腺乳头状癌的基因忍片,基因忍片包括与 KCNK2基因的核酸序列杂交的探针。
[0022] 本发明的目的在于提供促进KCNK2基因或蛋白表达试剂在制备抗甲状腺癌制剂中 的应用。
[0023] 进一步,甲状腺癌为甲状腺乳头状癌。
[0024] 进一步,抗甲状腺癌制剂抑制甲状腺癌细胞的增殖。
[0025] 进一步,抗甲状腺癌制剂抑制甲状腺癌细胞的迁移。
[0026] 优选的,采用构建过表达载体等方法促进KCNK2基因或蛋白表达。
[0027] 本发明的目的在于提供一种抗甲状腺乳头状癌制剂,抗甲状腺乳头状癌制剂促进 甲状腺乳头状癌细胞中KCNK2基因的表达。
【附图说明】
[002引图1是KCNK2基因在癌组织及正常组织中相对表达量图化CNK2mRNA相对表达情况) [0029 ]图視细胞增殖曲线图(两组细胞增殖曲线)
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可W理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 W对运些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0031] 实施例1病例的收集
[0032] 取5例甲状腺乳头状癌病例样本及8例健康对照组织。病例样本为术中冰冻快速病 理W及术后石蜡慢病理确认为甲状腺乳头状癌的患者,选择经甲功八项和甲状腺彩超检查 确认的。
[0033] 实施例2高通量测序及分析
[0034] 使用T反Izo蜡R e a g e n t提取样本RNA,RNA提取后琼脂糖凝胶电泳,进而通过 Nano化oplOOO分光光度计检测RNA样品的提取情况,RNA-seq测序的样品要求:0D260/0D280 为I.8-2.2。
[0035] 采用111皿ina公司的化Seq 2500高通量测序平台进行高通量转录组深度测序,测 序后运用化St-QC软件对测序数据的质量进行整体评估,包括碱基的质量值分布,质量值的 位置分布,GC含量情况,PCR dupl i cat ion含量情况,kmer的frequency等。在差异基因表达 分析时,根据得到的FPKM值,采用国际公认算法邸Seq进行差异筛选。其中,筛选时,L0G2FC〉 1或<-l,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能,我们对差异表达基因进行了 Gene Onlogy和信号通路分析,并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析。最 后,综合W上数据分析结果,结合检索文献情况,本发明选取了在甲状腺乳头状癌组下调表 达显著的基因 KCNK2作为研究对象。
[0036] 实施例3甲状腺乳头状癌组及对照组KCNK2基因表达情况
[0037] 一、材料和方法 [003引 1、材料
[0039] 取2013年5月到2015年11月期间在医院因甲状腺肿瘤住院手术,选取45例甲状腺 乳头状癌组织及18例健康对照组织,对其进行分组及编号。
[0040] 2、方法
[0041 ] 2.1甲状腺乳头状癌组及对照组总RNA的提取
[0042] 使用TRizo化Reagent提取样本RNA,操作参考说明书,具体如下:
[0043] 收集样本后冻存于液氮,取出后把组织放入已预冷的研鉢中进行研磨,待组织样 本成粉末状后:
[0044] ①加入Trizol,室溫静置5min;
[0045] ②每毫升Trizol加0.2ml氯仿,用力振荡离屯、管,充分混匀,室溫下放置5-lOmin;
[0046] ③4°C120(K)巧m高速离屯、15min后EP管分3层,吸取上层水相到另一新离屯、管管中, 注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管,加入等体积的-20°C预冷过的异丙醇, 充分颠倒混匀,冰上静置IOmin;
[0047] ④4 °C 1200化pm高速离IOmin后小屯、弃掉上清液,加入75%DEPC乙醇洗沉淀,振荡 混合,4°C12000巧m高速离屯、5min;
[004引⑤弃去乙醇液体,室溫下放置5分钟W充分惊干沉淀,加入20-40微升DEPC处理过 的水溶解沉淀;
[0049] ⑥用Nano化OP2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度,冻存于-7(TC。
[0050] 2.2-步法Real-Time PCR [0化1] 2.2.1仪器及分析方法
[0052] 用ABI 7500型巧光定量PCR仪,采用2-A A CT法进行数据的相对定量分析。
[0053] 2.2.2引物设计
[0化4] 采用在线引物设计软件,基因序列参照NCBI:NM_001017424,引物设计后由 invitrogen公司合成。具体引物序列如下:
[0化5] KCNK2基因引物:
[0056] 5'-ATTCGCATCATCTCAACAAT-3'(SEQ ID N0.1)
[0057] 5'-ACTCCAGCCTTCTATGTG-3'(沈Q ID N0.2)
[0化引扩增长度为96bp。
[0化9] GAPDH基因引物:
[0060] 5'-TCTCTGATTTGGTCGTAT-3'(SEQ ID N0.3)
[0061] 5'-TTGATGGCAACAATATCC-3'(SEQ ID N0.4)
[0062] 扩增长度为78bp。
[0063] 叫traSY服一步法巧光定量PCR试剂盒(货号:CW2624S)操作步骤:
[0064] 1.将RNA模板、引物、2 XUltraSYBR One Step Buffer、UltraSYBR One Step EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
[00化]2.反应体系:
[0066]
[0<
[0068] 3.满旋震荡混匀,短暂离屯、,将溶液收集到管底。
[0069] 4 . RT-qPCR反应条件(巧光定量PCR为两步法),反转录45 °C IOmin ;预变性96 °C 5111111;30个循环(变性95°(:103,退火和延伸601:453);反应结束后4°(:恒溫。
[0070] 二、实验结果
[0071] 实时定量PCR扩增曲线整体平行性好,表明各反应管的扩增效率相近,扩增曲线拐 点清楚,极限平而无上扬现在,曲线指数期斜率较大,说明扩增效率较高;样本扩增产物溶 解曲线为单峰,表明扩增产物唯一,是特异性扩增;根据qRT-PCR的相对定量公式:2- A Ct X 100%,比较KCNK2基因在甲状腺乳头状癌组和正常组中的表达水平。结果显示(具体见图 1):KCNK2在癌组织中的表达水平显著低于对照组,约为对照组的五分之一,W上结果验证 了高通量转录组表达数据的整合分析KCNK2在甲状腺乳头状癌组织中低表达的结果。
[0072] 实施例4构建重组慢病毒表达载体
[0073] 一、材料
[0074] TPC-I细胞株、293T细胞株购自上海慧颖生物科技有限公司。
[00巧]二、实验方法
[0076] 1.重组质粒的构建
[0077] 针对基因 KCNK2(NM_001017424)的序列,设计扩增目的基因的引物序列,引物含有 交换配对碱基W及Age I酶切位点。进行PCR扩增,纯化PCR产物,将PCR产物交换入线性表达 载体后进行重组质粒的构建,加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的摩尔数比例为1:3。 通过T4DNA连接酶将经双酶切线性化的慢病毒空载体GV208空载体和退火形成的双链DNA片 段在适当的缓冲液中进行连接反应,16°C过夜连接,获得的重组慢病毒载体命名为GV208-KCNK2〇
[0078]将连接产物转化到大肠杆菌感受态中,转化后涂布在AMP抗性的LB培养基上,37°C 倒置培养箱中解育,挑取长出的菌落进行PCR鉴定。使用慢病毒载体的通用引物进行菌落 PCR鉴定转化子W及测序鉴定。
[00巧]2.慢病毒载体包装 [0080] 细胞复苏
[0081 ] 迅速取出放于液氮罐中TPC-I、293T细胞的冻存管,放入37°C恒溫水浴锅中,快速 摇动,在两分钟内使管内冻存液完全融化。将两只冻存管放入离屯、机中,l〇(K)rpm/min离屯、 3min后,快速转移至细胞室,进行酒精消毒后,在无菌超净台中吸弃旧液,分别加入含血清 的RPMI-1640,DMEM培养基各1ml,轻轻吹打细胞。转入50T培养瓶,然后加入适量的培养液进 行培养。第二天观察细胞状态并进行换液。
[0082] 细胞培养
[0083] TPC-U293T细胞分别用含10%胎牛血清的RPM1640培养液和DMEM培养液,大小为 50ml的培养瓶中进行培养,并放置于条件为5%的C〇2浓度、恒溫37°C的培养箱中培养,两到 =天后进行换液。
[0084] 细胞冻存
[0085] 当细胞处于对数生长期并铺满瓶壁达80 % -90 %时,用PBS洗涂S次,然后加入适 量膜酶进行消化,待细胞出现轻微脱落时,立即加入1ml培养液终止消化,之后轻轻吹打细 胞直至吹散成单细胞悬液,然后转移至离屯、管中,800巧m/min离屯、5min,吸弃旧液,加入刚 配制的细胞冻存液,轻轻吹打细胞直至混匀,分装入冻存管中进行封口、标记。冻存时注意 缓慢降溫:4°C条件下30min,转入-20°C条件下化,然后在-80°C条件下过夜。第二天转入液 氮罐中长期保存。
[00化]DNA载体共转染293下细胞
[0087] (1)转染前一天,将对数生长期的293T细胞用PBS洗两遍,然后加入膜酶进行消化, 镜下细胞计数后用含10%FBS的培养基调整细胞浓度至6 X IO5个/ml,转移至细胞培养皿 中,然后置于37°C,5%C02培养箱中培养。当观察到细胞密度达到80%左右时可用于转染。
[0088] (2)当细胞达到转染要求时,需提前化将细胞培养基更换为无血清无抗生素培养 基。
[0089] (3)进行转染时,向一无菌Ep管中加入所制备的GV208-KCNK2载体20ug, 抑elperl. 0载体15ug,pHelper2.0载体IOug的DNA链接液,与相同体积的Opti-MEM培养基混 合,调整总体积至2.5ml,混合混匀,室溫解育5min。
[0090] (4)向一无菌离屯、管中加入IOOug Lipofeetamine2000,与2.4ml0pti-MEM培养基 混合后轻轻进行混匀,室溫下解育5min。
[0091] (5)接下来要在5分钟之内将(3)和(4)中的两管液体轻轻地进行混合均匀,然后室 溫解20min。
[0092] (6)将(5)中形成的DNA与Lipofeetamine2000混合液加入培养有293T细胞的培养 皿中,将混合液轻轻充分混匀,置于37°C,5%C02培养箱中培养。
[0093] (7)培养化后倒掉培养基,向每瓶细胞加 PBS进行洗涂,重复一遍,然后加入含有 10%FBS的新鲜培养基25ml,在培养箱内继续培养48小时。
[0094] 病毒的收获、浓缩
[00M] (1) 4化后从培养箱中取出培养皿,收集上清液。
[0096] (2)将上清液在4°C,400化pm离屯、IOmin后,用0.45um滤器进行过滤,然后用移液器 将过滤后的上清液转移至40ml超速离屯、管中。
[0097] (3)从离屯、管中吸取过滤液至过滤杯中,盖紧盖子,然后将过滤杯小屯、插入过滤液 收集管中。
[0098] (4)组合好收集管后直接置于离屯、机上,调整至4000巧m离屯、lOmin。
[0099] (5)离屯、机停止转动后,取出离屯、装置W及收集管,将滤过液收集杯分开。
[0100] (6)当过滤杯与收集管分开后将过滤杯倒扣在样品收集杯上,100化pm离屯、2min, 之后移开过滤杯,在样品收集杯上观察到的残留液体即为病毒浓缩液,分装后在-80°C低溫 中冰箱中保存。
[0101] 病毒滴度测定
[0102] (1)测定滴度前一天,将293T细胞接种于预先准备好的96孔板,选择10个孔进行接 种,使每孔细胞为4 X IO4扩个,体积为IOOul。
[0103] (2)对病毒滴度进行测定时,准备好10个无菌的化管,然后用移液器向各个化管加 入90u 1无血清的DMEM培养基。
[0104] (3)迅速从-80°C冰箱中取出一管GV208慢病毒原液,向准备好的第一个化管中加 入IOul,轻轻吹打混匀,然后再向第二个化管中加入IOul,W此类推直至第十个化管。
[0105] (4)用移液器小屯、从每个细胞培养孔中吸掉90ul培养基,然后按1-10依次进行编 号,并加入相对应号码的己稀释好的病毒溶液,确认编码无误后置于培养箱中培养24小时。
[0106] (5)24小时后向每个细胞培养孔轻轻加入IOOul的完全培养基,注意不要吹起细 胞。
[0107] (6)第5天时,巧光显微镜下观察各个培养孔中细胞的巧光表达情况,并对巧光细 胞进行计数,根据相对应孔的稀释倍数即可计算出病毒滴度,然后进行记录比较。
[0108] 3.重组质粒慢病毒载体表达效果测定
[0109] (1)准确把握好目的细胞换液时间,使进行病毒感染时细胞状态处于对数生长期。
[0110] (2川欠集状态最佳的细胞并离屯、,然后加入含10%FBS的新鲜培养基,并接种于6孔 板内,根据细胞计数情况使每孔细胞数约为5X 104。
[0111] (3)根据慢病毒感染TPC-I细胞的MOI值(M0I值=1 ),计算所需要加入病毒液,用含 10%FBS的培养基将每孔总体积补足至2ml,放入培养箱培养12小时后进行换液。
[0112] (4)将感染后的细胞72h后从培养箱中取出,倒置巧光显微镜下对GFP表达情况进 行观察,同时与白光视野下细胞数目进行对比,估算转染效率。
[0113] (5)实验过程中还要设置不加病毒液的空白对照组和加入阴性对照病毒液的阴性 对照组,并各设置=个复孔。
[0114] 4. RT-PCR 检测 KCNK2mRNA 的表达情况
[0115] (n收集转染空载体对照和转染KCNK2的慢病毒4她后的TPC-I细胞,用化izol分别 提取各组细胞总RNA,然后,一步法Real-Time PCR,具体操作参照实施例3。
[0116] S、实验结果
[0117] 重组质粒经PCR鉴定、酶切鉴定双重确认后,送测序公司测序,测序结果与Genbank KCNK2(NM_001017424)的序列比对,结果完全一致,表明重组质粒构建成功。
[0118] 选取慢病毒载体pGV-208,抑elperl. 0,pHelper2. OS质粒共同转染293T细胞,转 染4她后在巧光显微镜下观察293T细胞发出的绿色巧光。对浓缩后的慢病毒进行测定,巧 光显微镜下计数各孔中发出巧光的细胞数换算得到病毒滴度约为5 X IO8TlVml。
[0119] 通过Real-Time PCR检测到相应基因的Ct值,经计算目的基因 KCNK2与内参基因 GAPDH的扩增效率一致。计算各组细胞KCNK2mRNA的相对表达水平,W阴性对照组为标准化 样品,其余组为该组KCNK2基因表达量相对于标准组的倍数关系,W阴性对照组为1,其余实 验组与阴性对照组的比值反映 KCNK2的过表达效果。经计算得知阴性对照组KCNK2mRNA的相 对表达量为1,实验组为15.12,统计结果显示携带有KCNK2基因的实验组表达量明显高于阴 性对照组(P<〇.〇〇〇l)。
[0120] 实施例5KCNK2基因过表达对TPC-I细胞生物学功能的影响
[0121] -、实验方法
[0122] 1.检测细胞增殖
[0123] 取对数生长期的各组细胞经膜蛋白酶消化成单细胞悬液,调整TPC-I细胞密度为1 X IO3个/ml。向两组各4个96孔板中的各孔中加入细胞悬液,使目的细胞数达2 X IO3个。细胞 贴壁后,取化,24h,4化,7化后时间段,超净台中向每孔中加入10微升CCK-8溶液,细胞培养 箱内继续解育化。设定酶联免疫检测仪的波长为45化m,测定各个孔吸光度(OD值)。WOD值 为纵坐标,时间点为横坐标,绘制实验组和阴性对照组细胞的生长曲线,对两组细胞的增殖 情况进行对比统计。
[0124] 2. Transwe 11细胞迁移实验
[0125] (1)将己分组的各组细胞培养24小时后,进行消化、离屯、收集,在对细胞进行计数 后用无血清的培养液稀释细胞,使细胞数为2 X IO5个,然后吸取200微升细胞悬液加入 Transwell小室上室中,下室均加入600微升的含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基,每组 细胞均设置3个复孔。置于入恒溫37°C,5%的C〇2浓度的培养箱中解育2地。
[0126] (2)将解育好的小室取出,用医用棉签小屯、地拭去上室内的细胞W及液体,超净台 内惊干。将小室置于4%多聚甲醒中浸泡30分钟,可W使细胞固定的效果。细胞固定完成后 用PBS冲洗3遍,惊干后加入0.1 %的结晶紫溶液进行染色,时间为30分钟。染色结束后取出 小室用PBS液再次冲洗3遍,惊干后在倒置显微镜下进行观察,先了解下小室内细胞的整体 情况,然后高倍镜下随机选取巧个视野,对每个视野内的细胞量进行计数并计算处出平均 细胞数。
[0127] 二、实验结果
[012引阴性对照组和实验组细胞分别于接种后第1-5天,按照CCK-8检测试剂盒说明书进 行操作,然后通过酶标仪检测各组细胞的密度(OD)值,统计各组细胞OD值绘制细胞的生长 曲线,两组结果进行对比后显示实验组生长曲线较平缓,细胞生长速度较阴性对照组显著 降低(p<0.05),运表明KCNK2基因的过表达具有抑制TPC-I细胞增殖的作用,具体见图2。
[01巧]Transwell小室迁移结果显示,在实验组与阴性对照组进行比较发现实验组穿透 滤过膜细胞数量明显减少。统计结果显示两组差异具有统计学意义(P<〇.01)。结果表明过 表达KCNK2基因后TPC-I细胞的迁移运动能力减弱。
[0130]本发明采用高通量测序筛选出甲状腺乳头状癌致病相关基因 KCNK2,结合分子细 胞生物学实验验证,证实了 KCNK2是甲状腺乳头状癌密切的标志物。本发明为甲状腺乳头状 癌临床诊疗提供了新的祀标,具有很好的临床应用前景。
【主权项】
1. 检测KCNK2基因或蛋白的制剂在制备甲状腺癌诊断制剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用,其特征在于,甲状腺癌为甲状腺乳头状癌。3. 根据权利要求1所述的应用,其特征在于,甲状腺癌诊断制剂包括用荧光定量PCR方 法、基因芯片方法检测KCNK2基因的表达。4. 根据权利要求3所述的应用,其特征在于,用于荧光定量PCR方法检测甲状腺癌中 KCNK2基因的产品含有一对特异性扩增KCNK2基因的引物;基因芯片包括与KCNK2基因的核 酸序列杂交的探针,优选的,特异性扩增KCNK2基因的引物序列为SEQ ID N0.1和SEQ ID Ν0·2〇5. 根据权利要求1所述的应用,其特征在于,甲状腺癌诊疗制剂包括用免疫方法检测 KCNK2蛋白的表达,优选的,用ELISA或胶体金方法检测KCNK2蛋白表达。6. 促进KCNK2基因或蛋白表达试剂在制备抗甲状腺癌制剂中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用,其特征在于,甲状腺癌为甲状腺乳头状癌。8. 根据权利要求6所述的应用,其特征在于,抗甲状腺癌制剂抑制甲状腺癌细胞的增 殖。9. 根据权利要求6所述的应用,其特征在于,抗甲状腺癌制剂抑制甲状腺癌细胞的迀 移。10. 根据权利要求6所述的应用,其特征在于,采用构建过表达载体的方法促进KCNK2基 因或蛋白表达。
【文档编号】G01N33/577GK105838799SQ201610284031
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】李曙光, 杨承刚, 边洋
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
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