一种与梨果皮颜色性状连锁的分子标记及其应用
【专利摘要】一种与梨果皮颜色性状连锁的分子标记及其应用，所述分子标记为序列特异性扩增区分子标记，其标记位点命名为ZFRI130?16，位于基因组组装Scaffold NW?008988130.1的922024bp?922149bp处，所述分子标记位点位于所述序列特异性扩增区分子标记扩增产物的内部，其上游引物序列为：5'?CACTTTCGAAGCCAACAAAT?3'，下游引物序列为：5'?GGGCAAACTGGGAAACTG?3'。以及一种包含上述引物对的红皮梨辅助选育试剂盒。本发明分子标记能够对‘满天红’ב红香酥’供试群体中的所有红梨单株进行选择，选择效率达到100％。扩大验证发现，该标记在‘玉露香’ב满天红’组合310个已结果的子代群体中的正确率达到91.3％以上，在34个优系和13个品种中的总正确率达到97.87％，可作为梨红皮性状的标记进行育种选择应用，具有很好的应用前景。
【专利说明】
一种与梨果皮颜色性状连锁的分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于梨遗传育种与分子生物学领域，涉及一种与梨果皮颜色性状连锁的分 子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 梨是国际性的大宗水果，也是我国的主要水果之一，其果实营养丰富，味美多汁， 香甜可口，深受人们喜爱。我国是东方梨种的主要起源地，梨的种类和品种资源十分丰富。 对梨而言，其果皮颜色是最能吸引人们注意的果实性状，是果实品质和商品性的重要组成 部分。近年来，健康消费的观念日益深入人心，红色果皮的梨被认为具有更高的健康价值而 受到市场青睐，红色果皮梨品种的选育也日益受到各国梨育种研究机构的重视。
[0003] 目前，育种人员在梨育种工作中主要采用的是传统的杂交育种手段，杂交种子培 育成苗度过数年的童龄期并结果后，再对所有杂种单株生长结果性状进行后期评价，根据 评价结果选择留下和淘汰杂种单株。该方法育种周期长，占地面积大，耗时耗力，育种效率 低。分子生物学迅速发展并与作物遗传育种学科相结合，产生了分子标记辅助选择育种技 术，使得对传统杂交育种获得的杂种单株进行提早选择、高效选择成为可能。
[0004] 梨的红皮/绿皮性状是受主效基因控制和微效多基因调控的数量性状，表现为红 皮和绿皮分离规律类似质量性状，但红皮性状着色程度变异范围相对较广。开发梨红皮/绿 皮性状分子标记并用于分子标记辅助选择育种，可以大大提高红皮梨育种选择效率，节约 杂交单株种植养护和调查考种的成本，促进我国梨育种从常规育种向分子育种手段转变。
【发明内容】
[0005] 解决的技术问题
[0006] 为了解决梨遗传育种中存在的周期长、效率低的问题，本发明提供了一种与梨果 皮颜色性状连锁的分子标记和应用。
[0007] 技术方案
[0008] -种与梨果皮颜色性状连锁的分子标记，该分子标记为序列特异性扩增区（SCAR) 分子标记，命名为ZFRI130-16,所述分子标记位点位于砀山酥梨基因组组装Scaffold NW- 008988130.1的922024bp-922149bp处，所述位点位于所述SCAR分子标记扩增产物的内部， 基于所述分子标记的引物对，上游引物序列为:5 '-CACTTTCGAAGCCAACAAAT-3 ' ；
[0009] 下游引物序列为:5 ' -GGGCAAACTGGGAAACTG-3 '。
[0010] 所述的分子标记在梨果皮颜色性状辅助选择育种中的应用。
[0011] 所述的分子标记在梨红皮/绿皮性状辅助选择育种中的应用。
[0012] 所述的分子标记在东方梨红皮/绿皮性状辅助选择育种中的应用。
[0013] 此外，还包括一种红皮梨辅助选育试剂盒，所述试剂盒中含有上述的引物对。
[0014] 有益效果
[0015] 满天红"和"红香酥"是中国农业科学院郑州果树研究所选育的2个著名的红皮梨 品种，在我国推广应用面积较大。这两个品种常被育种单位用作红皮梨育种的亲本，表现出 良好的亲本遗传特点。本发明对'满天红' X '红香酥'杂交组合群体用ZFRI130-16分子标记 进行分析，该SCAR标记能够对供试群体中的所有红皮梨单株进行选择，选择效率达到 100%。扩大群体进行验证发现，该标记在'玉露香' X '满天红'组合310个已结果的子代群 体中的正确率达到91.3%以上，在34个优系和13个品种中的总正确率达到97.87 %，可作为 梨红皮性状的标记进行育种选择应用，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图获得其他的附图，其中
[0017] 图1分子标记ZFRI130-16在红皮梨和绿皮梨中的带型图；
[0018]图2分子标记ZFRI130-16在'满天红'X '红香酥'杂交组合中的扩增结果图；两边 泳道为marker，大小为lOObp;以及
[0019]图3分子标记ZFRI130-16与梨红皮/绿皮性状位点(Rg)的连锁图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受以下实施例的限 制。
[0021] 实施例1 [0022] 1材料来源
[0023] 供试材料为中国农业科学院郑州果树研究所新乡试验基地定植的5年生'满天红' X '红香酥'杂交组合群体共348个单株及2份亲本材料。
[0024] 2 方法
[0025] 2.1表型鉴定
[0026] 对'满天红' X '红香酥'杂交组合群体单株进行连续2年的红皮、绿皮性状表型调 查，调查结果用于后续分子标记验证分析。
[0027] 2.2PCR 反应
[0028]用ZFRI130-16分子标记对提取的DNA进行扩增，PCR采用20yL的反应体系，扩增该 SCAR标记的引物对如表1，反应体系组成和PCR反应程序见表2和表3:
[0029] 表1SCAR标记引物序列
[0030]
[0031] 表2PCR反应体系
[0032]
[0033]
[0034]
[0035]
[0036] 2.3PCR产物电泳
[0037] 取lyL扩增产物经8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，电泳缓冲液为0.5 X TBE，电压150V，电泳2h。电泳结束后，按照本实验室的PAGE银染程序进行染色。聚丙烯酰胺 凝胶银染染色后，置于灯箱上拍照。照片用于条带统计。
[0038] 2.4遗传距离计算
[0039]性状与标记的遗传距离利用Joinmap4.0软件进行计算，利用MapChart绘制性状与 标记间的连锁图。
[0040] 3结果
[0041 ] 3.1杂交组合红皮/绿皮性状调查结果
[0042]对'满天红' X '红香酥'组合的348个单株中已经结果的单株进行红皮/绿皮性状 的调查，共调查了293个单株的果实，其中红皮梨117个，绿皮梨176个，表现一定程度的偏分 离。
[0043] 3.2SCAR标记ZFRI130-16与红皮/绿皮性状位点的遗传距离
[0044]利用339个单株的表型数据及其在ZFRI130-16位点的基因型数据进行遗传距离分 析，结果表明，2?1?1130-16位点与红皮/绿皮性状位点的遗传距离为2.6(3111，计算结果用 MapChart画图，结果如附图3所示。
[0045] 3.3SCAR标记ZFRI130-16对红皮杂种单株的选择能力
[0046] 统计引物ZFRI130-16在已经结果的293个单株中的基因分型情况，结果表明，293 个单株中扩增出红色带型的单株有128个，扩增出绿色带型的单株有165个，117个红皮单株 在ZFRI130-16引物位点全部表现红色带型，另外11个表现红色带型的单株均为绿色果皮 (均为第一年结果）。表明ZFRI130-16标记能够将该组合红色单株全部筛选出来。
[0047] 4结论
[0048] 通过上述步骤即可简单快速地区分红皮梨单株与绿皮梨单株，成功地将分子标记 辅助选育技术应用于梨育种中红皮梨与绿皮梨的选育，显著降低育种的工作量，节省育种 时间，极大地提高了育种效率。
[0049] 实施例2
[0050] 1.采集'玉露香'X '满天红'组合458个单株刚萌发的幼叶，小心洗净擦干，提取 DNA〇
[0051 ] 2.用ZFRI130-16分子标记对提取的DNA进行扩增，PCR采用20yL的反应体系，扩增 该分子标记的引物对同实施例1。
[0052] 3.对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并对电泳结果进行条带统计，统计红皮/ 绿皮单株的带型。
[0053] 4.结果表明，ZFRI130-16标记能将310个已结果单株中的283个单株的皮色准确区 分出来，准确率达到91.3 %以上。
[0054] 5.通过上述步骤即可简单快速地区分红皮梨与绿皮梨，成功地将分子标记辅助选 育技术应用于梨育种中红皮梨与绿皮梨的选育，显著降低育种的工作量，极大地提高了育 种效率。
[0055] 实施例3
[0056] 1.采集来源于'幸水' X '红香酥'、'早美酥' X '红香酥'、'中梨1号' X '红香酥'以 及'新世纪' X '红香酥'等杂交组合共计34个优系以及'早白蜜'、'早美酥'、'中梨1号'、'中 梨2号V中梨3号V中梨4号V七月酥V八月酥'、'鹳梨V早酥V鸭广梨V砀山酥'、 '黄金梨'等13个品种刚萌发的幼叶，小心洗净擦干，提取DNA。
[0057] 2.用ZFRI130-16分子标记对提取的DNA进行扩增，PCR采用20yL的反应体系，扩增 该分子标记的引物对同实施例1。
[0058] 3.对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并对电泳结果进行条带统计，统计红皮/ 绿皮单株的带型。
[0059] 4.结果表明，ZFRI130-16标记能将34个优系中的33个和全部13个品种的皮色准确 区分出来，准确率达到97.87%。
[0060] 5.通过上述步骤即可简单快速地区分红皮梨与绿皮梨，成功地将分子标记辅助选 育技术应用于梨育种中红皮梨与绿皮梨的选育，显著降低育种的工作量，极大地提高了育 种效率。
[0061] 以上所述，仅为本发明的优选实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发 明披露的技术范围内，对本发明技术方案进行的简单变化或等效替换均落入本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种与梨果皮颜色性状连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为序列特异性 扩增区分子标记，所述分子标记位点命名为ZFRI130-16,位于基因组组装Scaffold NW-008988130.1的922024bp-922149bp处，所述分子标记位点位于所述序列特异性扩增区分子 标记扩增产物的内部，所述分子标记的上游引物序列为:5 ' -CACTTTCGAAGCCAACAAAT-3 '，下 游引物序列为:5 ' -GGGCAAACTGGGAAACTG-3 '。2. -种如权利要求1所述的分子标记在梨果皮颜色性状辅助选择育种中的应用。3. -种如权利要求1所述的分子标记在梨红皮/绿皮性状辅助选择育种中的应用。4. 一种如权利要求1所述的分子标记在东方梨红皮/绿皮性状辅助选择育种中的应用。5. -种红皮梨辅助选育试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如权利要求1所述的引 物对。
【文档编号】C12Q1/68GK105838800SQ201610291802
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】薛华柏, 李秀根, 张慧蓉, 杨健, 王龙, 王苏珂, 苏艳丽
【申请人】中国农业科学院郑州果树研究所