MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂及应用

MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂及应用
【专利摘要】本发明属于血液病辅助诊断试剂领域，具体涉及一种MiR?17?5p恶性血液病辅助诊断试剂及应用，包括MiR?17?5p的qPCR上游引物，序列为：5’?GCCGCCAAAGTGCTTACA?3’以及MiR?17?5p的qPCR下游引物，序列为：5’?CAGAGCAGGGTCCGAGGTA?3’；还包括扩增内参U6的qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正向引物，序列为5’?ATTGGAACGATACAGAGAAGATT?3’；以及U6的qPCR反向引物，序列为5’?GGAACGCTTCACGAATTTG?3’。本发明作为一种辅助诊断试剂，灵敏度强，特异性高，目的是通过快速检测MiR?17?5p预估患者是否有恶性血液疾病的可能，对临床恶性血液病的诊疗和预后提供分子检测依据，具有较大的临床应用价值。
【专利说明】
M i R-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂及应用
技术领域
[0001] 本发明属于血液病辅助诊断试剂领域，具体设及一种MiR-17-5p恶性血液病辅助 诊断试剂及应用。
【背景技术】
[0002] 血液系统肿瘤已成为威胁人类生命的主要疾病之一，恶性血液病是一类难治性血 液系统肿瘤，其特点在于治疗棘手，生存期短，预后差，且具体发病机制至今尚未明了。在对 恶性血液病的干预治疗中，如果能对疾病做出早期诊断并达到良好的评估，对于改善患者 的临床缓解率及预后评估提供有效的帮助，提高生存与治愈率。
[0003] MicroRNAs (miRNAs)是一类长度约19-24nt的非编码单链RNA，通过碱基互补配对 的方式与祀基因3'UTR区部分或完全互补，剪切祀基因的转录产物或者抑制转录产物的翻 译，从而调控转录后祀基因的表达。近年来研究发现，miRNAs与血细胞分化调控及血液肿瘤 的发生、发展、诊断和治疗等密切相关，运也提示我们从miRNAs入手可能为恶性血液病的诊 断和治疗提供新的思路和手段。
[0004] 恶性血液病包括骨髓异常增生综合征(MDS)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓性 白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM) W及再生障碍性贫血(AA)等。MiR-17在基因组水平上定位 于人类染色体13q31.3，本研究主要WMDS、AML W及CML为例，阐明MiR-17-5p表达量的检测 对于恶性血液病早期诊断的意义。实验中我们发现与正常人样本相比，MiR-17-5p在恶性血 液病患者中表达明显上调，提示MiR17-5p可能作为恶性血液病诊疗的有效祀点。
[0005] 目前越来越多的研究表明miRNAs在恶性血液病的风险评估和发病机制中发挥着 重要的作用，目前针对恶性血液病的诊断尚无明确的分子标记物。

【发明内容】

[0006] 针对上述问题，本发明的目的之一是提供一种灵敏度强、特异性高、能快速检测 MiR-17-5pW预估患者是否有恶性血液疾病的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂。
[0007] 本发明的目的之二是提供MiR-17-5p在制备恶性血液病辅助诊断试剂中的应用。 [000引为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为:MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试 剂，其特征在于，包括MiR-17-5p的qPCR上游引物，序列为:5' -GCCGCCAAAGTGCTTACA-3 ' W及 MiR-17-5p的qPCR下游引物，序列为：5 ' -CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3 ' ；还包括扩增内参U6的 qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正向引物，序列为5 ' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' ； W及U6的qPCR反向引物，序列为5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
[0009] 还包括MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物，逆转录引物均具有茎环结构。上述 逆转录引物是采用CN200610027217.7的专利的原理设计而成的。
[0010] 所述的MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物为逆转录反应体系的一部分，MiR-17-5P逆转录引物和U6逆转录引物胆存液均为lOuM，使用时将MiR-17-5p逆转录引物和U6逆 转录引物胆存液等比例（同体积)混合，稀释10倍制成浓度为IuM的逆转录引物混合液。上述 胆存液的溶剂为蒸馈水。U6是一类核小分子RNA，U6逆转录引物W运类小分子RNA为模版逆 转录后得到cDNA，在qPCR体系中作为内参。值得一提的是，逆转录引物不局限于本发明的逆 转录引物，任意能扩增出MiR-17-5p或U6的cDNA(后续用于MiR-17-5p或U6的qPCR)的逆转录 引物均能实现发明目的，该部分引物的设计为现有技术，不再寶述。
[0011] 逆转录反应体系总体积是20ul，具体如下：
[0012]
[0013] 另：5 X反应缓冲液包括 250mM IYis-HCl pH 8.3、250mM KClJOmM MgCbSOmT DDT; X为RNA模板的体积。
[0014] 还包括分离单核细胞W及总RNA提取试剂;分离单核细胞所需试剂:淋己细胞分离 液和1640培养基;RNA提取所需试剂:① PBS缓冲液，浓度为0.0IM，pH7.4;②氯仿，纯度为 99.7 % ;③异丙醇，纯度为99.7 % ;④乙醇，浓度为95 %，其中含5 %的0.1 %DEPC溶液;⑤ DPEC溶液，0阳口农度为0.1 %。
[0015] qPCR反应体系如下，每个反应管总体积是20ul:
[0016]
[0017] 若是MiR-17-5p反应管，则qPCR引物是MiR-17-5p qPCR上游引物和下游引物;逆转 录反应产物为采用MiR-17-5p逆转录引物得到的反应产物；
[001引若是内参U6反应管，则qPCR引物是U6qPCR上游引物和下游引物;逆转录反应产物 为采用U6逆转录引物得到的反应产物。
[0019] 本发明作为一种辅助诊断试剂，灵敏度强，特异性高，目的是通过快速检测MiR-17-5P预估患者是否有恶性血液疾病的可能，对临床恶性血液病的诊疗和预后提供分子检 测依据，具有较大的临床应用价值。同时拟采用细胞增殖、细胞分化、流式分析、基因忍片、 双巧光素报告酶基因等体外研究手段，掲示MiR-17-5p在恶性血液病中发挥的功能和调控 机制，W及作为相关辅助诊断的依据。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明的恶屯、血液病辅助诊断试剂的使用流程图；
[0021] 图2为MiR-17-5p扩增曲线图；
[0022] 图3为MiR-17-5p溶解曲线图；
[0023] 图4为MDS样本与正常人样本MiR-17-5p的检测对比图；
[0024] 图 5 为MDS 相对高危组(MDS-RA 邸）与低危组(MDS-U/RAS/RA/RARS/RCMD)之间 MiR-17-5P的检测对比图；
[0025] 图6为AML样本与正常人样本MiR-17-5p的检测对比图；
[0026] 图7为恶性血液病(MDS/AML/CML)之间MiR-17-5p的检测对比图。
【具体实施方式】
[0027] W下将结合附图和实施例详细地说明本发明所设及实施例的技术方案。
[0028] MiR-17在基因组水平上定位于人类染色体13q31.3，MiR17-5p的具体位置为X染色 体：1391350605-1391350688。
[0029] 实验流程
[0030] 根据图1，恶性血液病辅助诊断试剂的使用流程如下:特异的茎环逆转录引物与定 量PCR引物的设计及合成;骨髓样品通过Ficoll密度梯度离屯、法提取单核细胞;单核细胞总 RNA的提取;RNA定量及质量检测；使用茎环引物进行逆转录(RNA: 500ng/体系）；qRT-PCR检 测分析。
[0031] 采用化noDrop2000超微量分光光度计检测RNA浓度及OD值，0D260/280值在1.8~ 2.0之间；茎环逆转录引物是一种专口设计的茎环结构引物，"茎"部分的碱基的互补和堆积 能增加 RNA-DNA杂交复合物的热稳定性，茎环结构的空间约束力相比于传统的线性逆转录 引物来说，更有助于提高反应的特异性，MiR17-5p逆转录引物与MiR17-5p 3 '端特异性结合 后，在逆转录酶作用下进行逆转录反应。
[0032] 一、引物设计和合成
[0033] 实验中所设及的逆转录引物和qPCR引物均委托苏州吉玛基因公司合成，MiR-17-5p及内参U6 qPCR引物序列（均为DM)如表1:
[0034] 表1 MiR-17-5p及内参U6 qPCR引物序列
[0035]
[0036]
[0037]
[003引二、分离单核细胞W及总RNA的提取
[0039] 通过Ficoll密度梯度离屯、法从骨髓样本中分离出单核细胞，并从单核细胞提取总 RNA;具体如下：
[0040] 单核细胞分离步骤：
[0041] ①在试管中加入5-6ml淋己细胞分离液，在上层缓慢地加入骨髓或外周血，使骨髓 或外周血与淋己细胞分离液形成一层清晰的分界，220化pm/min离屯、20min;
[0042] ②使用吸管吸取白膜层。加入IOml 1640培养基（即RPMI-1640细胞培养基）吹打洗 涂后1000 rpm离屯、，弃上清，再次加入适量1640培养基将沉淀的细胞吹打混匀。
[0043] ③显微镜下计数，调整细胞浓度到2 X lO^ml。加入等量的"冻存保护液"，使细胞 终浓度为1 X lO^ml。将细胞吹打混匀后分装到冻存管中，冻存管放入程控降溫盒中，最后 将程控降溫盒置于-80°C冰箱中过夜。冻存保护液由9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO 混合而成，份数为体积份数。
[0044] RNA提取所需试剂：
[0045] ① PBS缓冲液，浓度为0.0 lM，pH7.4
[0046] ②氯仿，纯度为99.7 %
[0047] ③异丙醇，纯度为99.7 %
[004引④乙醇，浓度为95 %(其中含5%的0.1% DEPC溶液）
[0049] ⑤DPEC溶液，浓度为0.1 %，W上百分比为溶剂占总溶液的体积百分数。
[0050] 氯仿和异丙醇的纯度指的是氯仿或异丙醇占整个溶液的体积百分比；乙醇的浓度 指乙醇占整个溶液的体积百分比，整个溶液还含体积百分比为5%的DEPC溶液，其中DEPC溶 液中DEPC的体积百分比为0.1 % ,DEPC溶液的溶剂为水。
[0化1] 总RNA提取步骤：
[0052] 1、将冻存管中体积为Iml的单核细胞W 1300化pm离屯、8分钟，弃去上清，用Iml 0.OlM PBS(pH 7.4)吹打悬浮后再W13000巧m离屯、8分钟，收集沉淀；
[0化3] 2、用Iml TRIzol充分吹打悬浮沉淀，直至沉淀溶解，加入200ul纯度为99.7%的氯 仿溶液，上下摇晃30S，不要太剧烈，完全混合后静置2min，13000巧m离屯、Smin;
[0054] 3、离屯、后吸取上清液，尽量避免吸到下层液体，再加入同等体积的浓度为99.7% 的异丙醇，吸打混合后静置2min，13000巧m离屯、Smin;
[005引 4、尽量吸弃上清，加入500ul 95%乙醇（含5%体积的0.1%DEPC)吹打后再 13000rpm离屯、Smin，倒掉乙醇，待EP管中乙醇挥发后用含0.1 % DEPC溶液溶解，-80摄氏度冻 存。
[0056] S、反转录
[0057] WmRNA为模板，逆转录50化g RNA合成第一链。
[005引 20ul逆转录体系，反应条件：
[0061 ]另：5 X反应缓冲液包括 250mM IYis-HCKpH 8.3)、250mM KClJOmM MgCl 巧 OmT DDT。
[00日9] ^前恍苗/太玄("位而咎巧/太壬口具、*n了.
[0060：
[0062] 反应条件：
[0063] 1、65°C 5分钟
[0064] 2、25°C 5分钟 [00化]3、42°C 60分钟
[0066] 4、70°C 5分钟
[0067] 四、SYBR巧光定量检测
[0068] W逆转录产物为模板进行q-PCR反应
[0069] qPCR反应体系如下(每个反应管总体积是20ul):
[0070]
[0071] 若是MiR-17-5p反应管，则qPCR引物是MiR-17-5p qPCR上游引物序列：5'-GCCGCCAAAGTGCTTACA-3 ' 和下游引物序列：5 ' -CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3 ' ；逆转录反应产物 为采用MiR-17-5p逆转录引物得到的反应产物。
[0072] 若是内参U6反应管，则qPCR引物是U6qPCR上游引物序列：
[0073] 5 ' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ' 和下游引物序列：
[0074] 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，逆转录反应产物为采用U6逆转录引物得到的反应 产物。
[00巧]qPCR反应条件如下：
[0076] Stepl:50°C 2分钟
[0077] Step2:95°C 10 分钟
[0078] 循环数:40,包括W下2个步骤：
[00 巧]St邱3:95 °C 15秒
[0080] 6(TC 1 分钟。
[0081] 五、本发明的检测效果
[0082] 从扩增曲线（图2)看出，本发明的扩增体系及条件应用合理;溶解曲线（图3)中单 一的溶解峰也表明产物单一特异性较好。其中扩增曲线横坐标表示qPCR扩增的循环数，纵 坐标表示随着循环数的增加 PCR产物扩增量。
[0083] 溶解曲线横坐标表示溶解分析的溫度区间，纵坐标表示扩增产物与染料结合的一 个溶解峰值，是一个巧光信号值。在定量PCR实验中，常用溶解曲线来进一步分析反应产物 的特异性。通常是在整个反应结束后，加设一段升溫降溫程序，由于SYBR GREEN是一种非特 异性结合DNA双链的染料，扩增后也可能和反应中的引物二聚体或杂带非特异性结合，而释 放巧光信号，会导致仪器检测的信号不仅仅是目的基因，所W需要在反应结束后设定一个 升溫过程，然后慢慢把溫度降下来，由于不同DNA片段的解链溫度不同，运时若PCR产物纯， 则只会出现一个巧光溶解峰，因为只对应一个溫度值;若有引物二聚体或其他非特异性条 带，则会在其他溫度处出现另外的溶解峰，运是一种PCR扩增特异性的检测方法。分析时并 不是将扩增产物溶解在溶液中，直接是qPCR程序扩增完后在仪器上添加的一个溶解分析。
[0084] 六、MiR-17-5p在各类样本中的表达
[00化](I)MDS样本与正常人样本MiR-17-5p的检测对比，结果见图4。
[0086] 20例正常人样本，27例确诊的MDS样本，统计学分析P<0.001，表明MDS样本中MiR-17-5P表达量与正常人相比，显著上调。
[0087] (2)MDS 相对高危组(MDS-RAEB)与低危组(MDS-U/RAS/RA/RARS/RCMD)之间MiR-17-5p的检测对比，结果见图5。
[008引 20例正常人样本，27例确诊的MDS样本，其中11例MDS-RA邸高危患者，16例MDS-U/ RAS/RA/RARS/RCMD型患者，统计学分析P<0.0 l，实验数据表明MDS高危患者中，MiR-17-5p表 达量相较于低危组也有明显上调。
[0089] (3)AML样本与正常人样本MiR-17-5p的检测对比，结果见图6。
[0090] AML样本共19例，其中Ml型7例，M2型3例，M2a型3例，M5型1例，M化型5例;AML患者与 正常人相比，MiR-17-5p平均上调4倍。
[0091] (4)恶性血液病(MDS/AML/CML)之间MiR-17-5p的检测对比，结果见图7。
[0092] 图7表示在MDS、AML、CML群体样本中，MiR-17-5p的相对表达量高于正常样本群体， P<0.0 l，有显著的统计学意义。图4-7纵坐标表示MiR-17-5p的相对表达量。
[0093] W上数据均显示，在恶性血液病如急性髓细胞白血病(AML)、骨髓异常增生综合征 (MDS)患者和慢性髓性白血病(CML)样本中，MiR-17-5p均呈现出异常上调趋势。
[0094] MicroRNA在恶性血液病中的研究逐年增多，其在生物体内的调控功能也越来越凸 显，由于目前生物标志物主要是功能蛋白和特定基因或SNP，起重要调控作用的MicroRNA作 为诊断标记物研究相对较少，导致其在临床诊断中的作用被忽略。我们的研究发现，在恶性 血液疾病中，MiR-17-5p均有明显上调趋势，明显高于正常人群，同时MDS不同类型之间有一 定差异，我们的结果中看出高危组样本平均表达量也高于低危组样本，提示MiR-17-5p的表 达可能对推断MDS的病程有潜在的指导意义，而MDS较之AML上调倍数更为明显；同时，针对 恶性血液病细胞中的功能实验也验证了 MiR-17-5p可能参与调控细胞增殖、周期和分化等 重要的生物学过程。因此，在对恶性血液病有一定的早期诊断作用的研究基础上，鉴于MiR-17-5P可能成为恶性血液病的早期诊断的辅助诊断指标，本发明从实际应用出发，我们试图 运一操作简单、灵敏度高且特异性强的检测MiR-17-5p表达的手段引入恶性血液病的辅助 诊断中，对临床恶性血液病的诊疗和预后提供分子检测依据，具有较大的临床应用价值。
[0095] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可W做出若干改进和变形，运些改进和变形 也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，包括MiR-17-5p的qPCR上游引物， 序列为：5 ' -GCCGCCAAAGTGCTTACA-3 ' 以及MiR-17-5p的qPCR下游引物，序列为：5 ' -CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3 ' ；还包括扩增内参U6的qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正 向引物，序列为5 ' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ' ；以及U6的qPCR反向引物，序列为5 ' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。2. 根据权利要求1所述的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，还包括 MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物，逆转录引物均具有茎环结构。3. 根据权利要求1所述的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，所述的 MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物为逆转录反应体系的一部分，MiR-17-5p逆转录引物 和U6逆转录引物贮存液均为10uM，使用时将MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物贮存液 等比例混合，稀释10倍制成浓度为IuM的逆转录引物混合液。4. 根据权利要求3所述的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，逆转录反 应体系总体积是20ul，具体如下： 浓度 加样体积/用量 MiR-；1.7-5p、物iii!合液 IuM 1.2ul RNA 投板 500ng(xul) dNTP IOmM 2ul 反转录酶 200U/ul Iul RNA 酶抑制剂 200U/ul Iul 5 X反应缓冲液 4u_l 无核酸酶蒸馈水 （10·8-χ)υΙ 另：5Χ 反应缓冲液包括250mM Tris-HCl pH 8.3、250mM KCl、20mM MgCl2 50mT DDT;x 为RNA模板的体积。5. 根据权利要求1所述的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，还包括分 离单核细胞以及总RNA提取试剂；分离单核细胞所需试剂:淋巴细胞分离液和1640培养基； RNA提取所需试剂:①PBS缓冲液，浓度为0.0IM，pH7.4;②氯仿，纯度为99.7 % ;③异丙醇，纯 度为99.7 % ;④乙醇，浓度为95 %，其中含5 %的0.1 %DEPC溶液;⑤DPEC溶液，DPEC浓度为 0.1%〇6. 根据权利要求1所述的MiR-17_5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，qPCR反应 体系如下，每个反应管总体积是20ul: 加样体积/用量 逆转录反应产物 〇.5ul Taq 1? (SYBR Premix Ex Taq 2 X) IOui 炎)bi；.丨 1;:?料（ROX Reference 50X} 0.4ul qPCR上游引物和下游引物的混合物(IOuIVI) 0.4ul 无核酸酶蒸馏水 8.7ul; 若是MiR-17_5p反应管，则qPCR引物是MiR-17_5p qPCR上游引物和下游引物;逆转录反 应产物为采用MiR-17-5p逆转录引物得到的反应产物； 若是内参U6反应管，则qPCR引物是U6qPCR上游引物和下游引物;逆转录反应产物为采 用U6逆转录引物得到的反应产物。 7 .MiR-17-5p在制备恶性血液病辅助诊断试剂中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105838804SQ201610319085
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】宋耀华, 吴德沛, 何杨, 杨舒婷
【申请人】苏州大学