一种用于小叶紫檀分子鉴定的标准基因及分子鉴定方法
【专利摘要】小叶紫檀（Pterocarpus santalinus），又名檀香紫檀，为蝶形花科紫檀属植物。因为材质优良，加之分布区域小、成材周期长，其市场价格不断攀升。在巨大的利益驱使下，小叶紫檀的假冒品泛滥，如何准确鉴定小叶紫檀成为小叶紫檀交易市场上的最大难题。本发明提供一种用于小叶紫檀分子鉴定的标准基因及分子鉴定方法，应用该方法来鉴定小叶紫檀，具有快速、准确、对样品损伤小等特点。
【专利说明】
一种用于小叶紫檀分子鉴定的标准基因及分子鉴定方法
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及植物分子鉴定的标准基因及分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002]小叶紫檀(Pterocarpus santalinus)，又名檀香紫檀，为蝶形花科紫檀属植物。小叶紫檀坚实厚重，木质细腻，密度较大，棕眼较小，稳定性优，纹理漂亮，韧性好，耐雕琢，产于印度南部及附近的狭窄区域。小叶紫檀木色呈深紫，历来为皇室贵族家具专用木材，价格昂贵，居各木之首，被称为“帝王之木”。十八世纪法国皇家路易十八所使用家具，其材质也是选用上等小叶紫檀，在《红木国标》中确定的红木树种中，小叶紫檀为红木之首。小叶紫檀生长极其缓慢，一棵成材的小叶紫檀要生长几百年甚至上千年，因出材率极低，资源奇缺，又有“寸檀寸金”之说。
[0003]因为材质优良，加之分布区域小、成材周期长，其市场价格不断攀升。在巨大的利益驱使下，小叶紫檀的假冒品泛滥，如何准确鉴定小叶紫檀成为小叶紫檀交易市场上的最大难题。现在大多采用显微解剖及荧光观测法来鉴定小叶紫檀，其操作过程复杂，对样品损伤严重，而且随着造假技术的进步，这些方法的鉴定准确率也得不到保证。
【发明内容】
[0004]为解决上述问题，本发明提供一种用于小叶紫檀分子鉴定的标准基因及分子鉴定方法，应用该方法来鉴定小叶紫檀，具有快速、准确、对样品损伤小等特点，具体技术方案如下。
[0005](I)获取用于小叶紫檀分子鉴定的标准基因
根据DNA条形码技术原理，采用PCR扩增方法，确保条带的纯度及可靠性。测序结果通过手工校对、序列拼接，并确保所得序列为标准序列。从采集的小叶紫檀样品提取基因组DNA，参考植物条形码DNA片段选取原则，利用引物进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增出样品对应的psbK-psbl基因，将扩增产物测序后分析比对，优选引物序列扩增小叶紫檀样品的psbK-psbl基因序列片段作为标准基因，基因序列为序列表所示(531个碱基)。
[0006](2)用psbK-psbl基因序列鉴定小叶紫檀的方法，分为四个步骤:
第一步，取样并提取DNA;
第二步，利用PCR反应扩增psbK-psbl基因序列；
第三步，对扩增产物进行测序；
第四步，将得到的序列与权利要求1中的psbK-psbl基因序列进行同源性比对，当同源性碱基比例小于95%时，排除该物种为小叶紫檀的可能，当同源性碱基比例大于或等于95%时，该样本是小叶紫檀的概率是X 100%。
【具体实施方式】
[0007]实验中，用5个不同来源的小叶紫檀样本，用TIANGENE公司DNA提取试剂盒提取样本DNA。采用的正向引物:TTAGCCTTTGTTTGGCAAG，反向引物:AGAGTTTGAGAGTAAGCAT，PCR扩增条件为94°C预变性4min，接下来94°C变性45s，50°C退火45 s，72°C延伸1.5min，一共进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。获得产物经测序后比对，样本间的同源性都保持在99%以上，获得序列与其他物种通过在线比对，其同源性都在52%以下。
[0008]序列表:
CTGCTGTAAGTTTTCGATGAGATCTTGAATTTGAATAAATGTCCTAAAAAAATTCGGAATTTATTCGAAAACA
AAAATTCGAACATTTTAACAATTTAAAAGATCAGATAAGTCTTACAGTGTGAATCCTCGATTCAAATATTGAAATTT
TTGGATAGACAAAAAAAATCTGGACCATCTCATTATTCCCTCATTCTTACGTTTTTTCCACTGAGAAATCCTTCTAT
TTTTAGATTTGTATTAGATTTGAGTCCACCACCAGTACCTGGGTTGTGGATATGAAAGAAAATCTTTTGTAATACAA
ATATTGGTAATAGTATATTGGTATTGGTAATACTATATTGGTAATAGTAATAAAGGGCTCGGCTCTTCCTACAAAGA
AAGAAATTTCCGAATTTTTTTTTCTATTTCCTTGAAATCACTTCATTTCTTAGAAACTTTGTATCAAAAGAAACATA
ATGTGTTATATAAGAGAATCTATTCTCTTTTCTCATTCTCTGTCGTTTTTTTTTTAATCTTGGAGATTTTGTA。
【主权项】
1.一种用于小叶紫檀分子鉴定的标准基因，其特征在于其氨基酸序列为序列表中的序列。2.—种用权利要求1中的标准基因鉴定小叶紫檀的方法，分为四个步骤: 第一步，取样并提取DNA; 第二步，利用P C R反应扩增P s b K - P s b I基因序列，前后引物序列分别为:TTAGCCTTTGTTTGGCAAG ^ AGAGTTTGAGAGTAAGCAT； 第三步，对扩增产物进行测序； 第四步，将得到的序列与权利要求1中的psbK-psbl基因序列进行同源性比对，当同源性碱基比例小于95%时，排除该物种为小叶紫檀的可能，当同源性碱基比例大于或等于95%时，该样本是小叶紫檀的概率为X 100%。
【文档编号】C12N15/11GK105838806SQ201610326119
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】王兵益, 杨时宇, 廖礼彬, 李体初
【申请人】中国林业科学研究院资源昆虫研究所