羊源性成分的lamp检测方法的引物、检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学领域，公开了一种羊源性成分的LAMP检测方法的引物和用这种引物检测的方法，以及包含这种引物的试剂盒。所述引物的序列如SEQ ID NO.1～4所示。所述试剂盒包括引物、DNA提取试剂、2×反应液RM、Bst DNA聚合酶、荧光染料和阴性对照。本发明建立的羊源性成分的LAMP检测方法和试剂盒具有特异性好、灵敏度高、快速、费用低廉等优点，可应用于动物组织及其加工品中羊源性成分的快速检测。
【专利说明】
羊源性成分的LAMP检测方法的引物、检测方法和试剂盒
技术领域
[0001 ]本发明涉及分子生物学中羊源性成分的LAMP检测方法，特别涉及羊源性成分的 LAMP检测方法的引物和用这种引物检测的方法，以及包含这种引物的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 早在20世纪80年代，国外就已经重视对动物源性成分的检测并对其开展了鉴别的 研究。而我国在近几年随着国内居民收入增加，人们对肉制品的需求量，特别是羊肉的需求 量持续上涨。但由于羊肉价格高，不法分子使用廉价的肉比如猪肉、鸡肉、鸭肉冒充羊肉以 此赚取利润。因此我们需要建立一种准确、快速、可靠的检测方法，这对保障消费者的合法 权益和为相关部门打击不法分子提供有利的技术支持有着重要的意义。目前为止检测方法 可分为物理、化学、免疫学和分子生物学这几类，具体例如色谱法、ELISA法、常规PCR法、实 时荧光PCR法等。其中以PCR方法最为准确、快速、灵敏。而由于实时荧光PCR法在时间、准确 性和灵敏度上等优势，使其成为了检测动物源性成分最常用的分子生物学法。但此方法需 要依靠昂贵的设备，成本负担较重，且设备较笨重，无法离开实验室进行使用。
[0003] 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification)是2000年由 日本荣研株式会社的学者No tomi博士等人发明的一项新的DNA扩增技术。传统的PCR技术离 不开反复升降温这个耗时耗能的过程，且反应程序设定也较繁琐。相比之下，LAMP技术克服 了这些问题。根据LAMP技术的原理，它可实现在恒温条件下（一般在60~65°C)快速连续扩 增，实现了实验过程快速、简便，仪器设备简单、便携，检测结果特异性强、灵敏度高的优点。 LAMP扩增结果可用实时荧光法，通过实时荧光PCR仪(Real-Time PCR System)进行实时观 察，也可在反应结束后加入钙黄绿素荧光指示剂用肉眼观察，呈绿色表明发生了扩增，橙色 则表示未发生扩增。
[0004] LAMP反应原理如下：模板DNA在65°C左右处于动态平衡状态，在Bst酶作用下引物 与其中一条链互补配对延伸时，另一条链就会解离。LAMP整个反应分三步完成，即起初反应 物模板的合成;循环扩增阶段;延伸和再循环。首先是反应模板合成阶段：内引物FIP和模板 链的F2c结合启动互补链的合成。F3再和模板链上的F3c结合，通过Bst酶启动链置换反应， 与模板DNA形成双链结构，并且释放出FIP合成延长单链。FIP延长单链5'端F1序列与Flc序 列碱基互补形成茎环结构。以之前置换的与模板DNA互补的FIP延长单链作为模板，BIP启动 互补链的合成，形成双链DNA。然后B3再插入此双链DNA中，和FIP延长链的B3c结合，启动链 置换反应，释放出两端分别含互补区域(一端Flc和F1互补，一端Blc和B1互补）的DNA，形成 哑铃状结构。该结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。其次是循环扩增阶段:在哑铃状结 构中，以F1区段的3'末端为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与 哑铃结构环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应。解离由F1区段合成的双链核酸。同样， 在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。最后是延伸和再循环阶段:在环状结构上存在 单链形式B2c，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增。经过一系列扩增阶段，形成了链 长延伸一倍的新产物链和锤状结构，并将进一步以相同方式延伸。随后再循环反应，茎的长 度和环的个数都逐渐增加，最后的产物为茎环DNA组成的混合物，即含有若干倍茎长度茎环 结构和类似花椰菜的结构。其中，若在体系中添加两条环引物Loop F和Loop B可加速扩增 反应。
[0005] 钙黄绿素是一种荧光指示剂。在原有LAMP反应试剂的基础上添加钙黄绿素和氯化 锰后，可以衍生出另外一种更为简便的可视化LAMP，一步即可完成LAMP扩增及结果判定。将 钙黄绿素与锰离子混合，会使钙黄绿素荧光淬灭，溶液显现橙色。把这种混合的荧光指示剂 加入LAMP体系中，在LAMP扩增反应进行当中，产生的大量的焦磷酸根(P2〇740，夺去了与钙 黄绿素结合的锰离子，形成焦磷酸锰沉淀。之后，钙黄绿素由于失去了锰离子而发出绿色荧 光，使得溶液呈现绿色，肉眼即可观察。这种可视化LAMP不但简化了产物检测方法，使得 LAMP扩增和产物检测一步完成，而且不开盖的操作还降低了产物对检测地点污染的潜在威 胁。
[0006] 至今为止，国内外对羊源性成分（山羊、绵羊)采用LAMP技术来检测鉴别鲜有报道。 综上所述，需要建立一种可检测两种羊源性成分的LAMP检测方法，为羊源性成分的检测提 供更多选择。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供特异性好、灵敏度高的羊源性成分的LAMP检测方法的引物。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种羊源性成分的LAMP检测方法。
[0009]本发明的另一目的是提供一种检测羊源性成分的试剂盒。
[0010]为达到上述目的之一，本发明采用以下技术方案： 羊源性成分的LAMP检测方法的引物，所述引物包括： 引物FIP: 5 ' -TGCTGAAGATGGCGGTATATAGAGATAAACCCCGATAAACCTCA-3 ' ；（ SEQ ID N0 · 1) 引物BIP:5' -GCTCAATCACAACACATAAAGACGTAAGGTAGAAAATGTAGCCCAT-3,；(SEQ ID NO.2) 引物F3:5'-TCTAGAGGAGCCTGTTCT-3'；（SEQIDN0·3) 引物B3:5'-GTCATTAATTTCATAATGGCTTTCG-3'（SEQIDN0·4)。
[0011 ] -种羊源性成分的LAMP检测方法，包括以下步骤： 51、 提取待测样品DNA; 52、 配制LAMP检测反应体系，反应体系包括以上所述的引物； 53、 以S1的DNA为模板进行LAMP扩增反应，用实时荧光法鉴定结果。
[0012] 进一步地，所述反应体系为：2 X反应液RM 12 · 5yL，引物FIP、BIP各1 · OyL，引物F3、 B3各 1 · OyL，Bst DNA聚合酶 1 · OyL，荧光染料0 · 5yL，DNA模版2 · OyL，补水至25yL。
[0013] 进一步地，所述引物FIP、BIP的浓度是40ymol/L，所述引物F3、B3的浓度是5ymol/ L〇
[0014] 进一步地，所述扩增反应的程序为：保温阶段63°C 30s，1个循环；循环阶段63°C 15s，63 °C 45s，60个循环。
[0015] -种检测羊源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括以上所述的引物。
[0016] 进一步地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、2X反应液RM、Bst DNA聚合酶、荧光染 料。
[0017] 2X反应液RM含有dNTPs和缓冲液。
[0018] 本发明有以下有益效果： 为了对肉制品中羊源性成分进行有效鉴定，本发明根据羊的线粒体DNA(mtDNA)序列， 使用分子生物软件LAMP Designer设计了一套引物，用来建立羊源性成分LAMP检测方法。结 果表明，LAMP检测方法对肉制品中羊源性成分的检测特异性良好，且方法的灵敏度高，可检 测到100拷贝的数量级。对送检样品检测的结果与标准方法得出的结果一致。本发明的检测 方法和试剂盒可应用于动物组织及其加工品中羊源性成分的快速检测。
[0019] 本发明在设计引物时，羊线粒体基因上的外引物跨度为220bp左右，这样即使肉制 品经过高温、高压等加工，样品不至于因 DNA片段受损或因设计的片段在该部位不存在而出 现漏检的情况。
【附图说明】
[0020] 图1是实施例2中LAMP检测方法对羊肉样品的检测结果； 图2是实施例2中LAMP检测方法的特异性试验结果； 图3是实施例2中LAMP检测方法的灵敏度试验结果； 图4是实施例2中LAMP检测方法对送检样品的检测结果。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明： 实施例1 羊源性成分的LAMP检测方法的引物 按照LAMP引物设计原则，根据GenBank数据库中绵羊和山羊的线粒体基因组序列，进行 多序列比对，在线粒体基因上寻找一段高度保守区作为扩增对象，然后通过分子生物学软 件LAMP Dsigner设计引物。引物由上海辉睿生物科技有限公司合成，采用HPLC纯化方式。合 成后的引物用超纯水稀释成1 OOpmo 1/yL溶液，-20 °C保存备用。引物序列见表1。
[0022] 表1羊源性成分LAMP引物
实施例2 羊源性成分的LAMP检测方法 DNA提取试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit为美国OMEGA公司产品，LAMP扩增体系的2 X反应液RM、Bst DNA聚合酶、荧光染料均为广州迪澳生物科技有限公司产品。2 X反应液RM 含有dNTPs和缓冲液。
[0023] ABI ViiA7 Real-Time PCR System、ABI 7500 Fast Real-Time PCR System和 9700 PCR System，均为为美国Applied Biosystems公司产品。Alpha Imager HP凝胶成像 分析系统为美国Alpha Innotech公司产品。SIGMA 3-18 K小型高速冰冻台式离心机，为德 国Sartorius公司产品。NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer紫外分光光度计为美国 NanoDrop Technologies公司产品。
[0024] 1、标准方法的建立 实验室保存和外购的动物组织样品共18份，其中包括牛肉（黄牛肉、牦牛肉、水牛肉各 两份）、猪肉、羊肉（绵羊肉、山羊肉各一份）、鸡肉、鸭肉、鹅肉、狗肉、梅花鹿角、骆驼、水貂皮 张、狐狸皮张、驴肉。
[0025] 18份样品均使用了国家标准、行业标准和CNAS认可标准《脊椎动物源性成分PCR鉴 别方法》(ZHJS 001-2006)来验证，结果见表2。
[0026] 表2样品验证结果 2、提取样品DNA
样品为绵羊和山羊样品。
[0027] DNA的提取方法按照DNA提取试剂盒说明书中关于组织DNA提取要求进行，具体步 骤如下： (1) 将30mg左右的组织样品加入1 · 5mL离心管； (2) 加200yL TL Buffer和25yL 0B溶液到样品中，漩涡震荡混匀以裂解样品； (3)将1.5mL离心管放入55°C的恒温水浴锅中20~30分钟，中途可拿出样品摇晃，效果更 好； ⑷时间到后将离心管放于离心机中，以10000 X g的速度离心5分钟； (5) 将上清液用移液器吸出到新的1.5mL离心管中，注意不要吸到沉淀层； (6) 加220yL BL溶液到离心管中，混匀后放入70°C的恒温水浴锅中10分钟； (7) 加220yL的100%酒精于离心管中，混匀后用移液器全部吸出到DNA mini Column管， 并将其插到2mL Collection Tube管，离心一分钟； (8) 取出后换新Collection Tube管，加500yL HBC溶液到mini Column管，离心30秒； (9) 取出后再换新Collection Tube管，加700yL DNA Wash Buffer溶液到mini Column 管，离心30秒； (10) 重复第(9)步； (11) 将Col lection Tube管液体倒掉，再空转2分钟； (12) 把mini Column管转移到1.5mL离心管中，加200yL Elution Buffer于室温2分钟； (13) 离心一分钟，DNA溶液转移到了 1.5mL离心管中，丢弃mini Column管； (14) 将DNA溶液储存于-20°C中。
[0028] 获得的DNA模板的260/280比值均在1.8~2.0之间，浓度在200~500ngAxL。提取的 DNA质量和浓度较高，适合后续的扩增反应。
[0029] 3、LAMP反应体系 反应体系为:2 X反应液RM 12.5yL，内引物FIP、BIP各1. OyL，外引物F3、B3各1. OyL，Bst DNA聚合酶1. OyL，荧光染料0.5yL，DNA模版2. OyL，补水至25yL。最后加20.0 yL的封闭液以避 免体系挥发和产物污染。
[0030] 内引物FIP、BIP的浓度是40μL?〇 1 /L，外引物F3、B3的浓度是5μL?〇 1 /L。
[0031] DNA模版由绵羊肉和山羊肉提取而得。
[0032] 4、样品检测 利用实时荧光法，将样品DNA作为模板用ABI ViiA7 Real-Time PCR System进行LAMP 扩增，并实时观察扩增曲线。
[0033] 扩增反应的程序为：设定保温阶段63°C 30s，l个循环;循环阶段63°C 15s，63°C 45s，60个循环。
[0034] 在63°C 45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。
[0035] 结果如图1所示，曲线1为山羊，曲线2为绵羊，曲线3为阴性对照(水，下同）。除阴性 对照未发生扩增，绵羊和山羊均发生扩增;且荧光信号到达设定的域值时所经历的时间相 差不大，说明设计的引物对其扩增效果一致。
[0036] 5、特异性试验 为了验证设计引物对羊源性成分检测的特异性，用上述反应体系和条件，以13份非羊 肉样品（黄牛肉、牦牛肉、水牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、狗肉、梅花鹿角、骆驼、水紹皮张、 狐狸皮张、驴肉各一份)和2份羊肉样品（山羊、绵羊）的DNA为模板进行扩增。以山羊肉为阳 性对照的试验结果如图2所示，曲线1为阳性对照山羊肉，曲线2~15依次是黄牛肉、牦牛肉、 水牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、狗肉、梅花鹿角、骆驼、水貂皮张、狐狸皮张、驴肉、阴性对 照。除了山羊的DNA有明显的扩增曲线外其他样品均无扩增。以绵羊肉为阳性对照的试验结 果也显示了检测方法具有特异性。
[0037] 6、灵敏度试验 取绵羊的样品DNA，分别用外引物F3、B3进行扩增，反应程序均为：94°C 4min ; 94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，35个循环;72°C 5min。将产物用电泳检测，有目的条带的PCR产物 送北京六合华大基因科技股份有限公司武汉分公司、广州分公司进行测序鉴定，并以羊的 重组质粒作为阳性标准品。将重组质粒用紫外分光光度计测定质粒浓度，根据阿伏伽德罗 常数换算为目的基因的拷贝数，以10倍梯度稀释至10拷贝ΛΛ，对梯度稀释的阳性对照进行 LAMP反应检测。
[0038] 将用外引物扩增的产物克隆成质粒进行10倍的梯度稀释，稀释好的质粒按照上面 的体系和条件，用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System进行结果观察，结果如图3所示， 曲线1为1〇9拷贝，曲线2为108拷贝，曲线3为107拷贝，曲线4为10 6拷贝，曲线5为105贝，曲线6 为1〇4拷贝，曲线7为103拷贝，曲线8为102拷贝，曲线9为10 1拷贝，曲线10为阴性对照。可知羊 源性成分检测的最低检测浓度均达到了 100拷贝的数量级。
[0039] 7、送检样品的检测 通过以上灵敏度试验，发现检测方法的灵敏度都在100拷贝的数量级，且均在50个循环 之前就有扩增曲线，50min之后为无效扩增，故将LAMP的反应时间设定为50min。调整反应时 间后，先后对31份送检样品进行检测，部分样品的检测结果如图4所示，曲线1~4均为送检样 品，曲线5为阴性对照。使用上述标准方法同时进行样品检测，LAMP方法与标准方法检测结 果符合率为100%。
[0040] 本实施例通过使用实时荧光法对建立的检测方法进行了通用性测试，结果发现在 羊源性成分检测中对于2种不同种的羊的DNA都可很好地扩增出来。在灵敏度方面，引物的 灵敏度都较高，羊源性成分的检测可以达到1〇〇拷贝的数量级，这对于羊角或其它线粒体 DNA含量较少部位的检测具有实用性。在灵敏度试验中发现在50min以后也没有荧光曲线出 现，在实际应用中无参考价值，故将LAMP反应的时间设定在50min较为合理。
[0041 ]综上，本发明的LAMP检测方法特异性好、灵敏度高，可快速检测动物组织及其加工 品中是否含有羊源性成分。
[0042] 实施例3 检测羊源性成分的试剂盒 引物:如表1所示，内引物FIP、BIP的浓度是40ymol/L，外引物F3、B3的浓度是5ymol/L。
[0043] DNA提取试齐丨」：美国OMEGA公司产品E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit。
[0044] LAMP扩增体系：具有链置换活性的Bst DNA聚合酶、2 X反应液RM、焚光染料均为 广州迪澳生物科技有限公司产品；2 X反应液RM含有dNTPs和缓冲液。
[0045] 阴性对照:水。
[0046] 以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应 涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1. 羊源性成分的LAMP检测方法的引物，其特征在于，所述引物包括： 引物FIP: 5 ' -TGCTGAAGATGGCGGTATATAGAGATAAACCCCGATAAACCTCA-3 ' ； 引物BIP:5' -GCTCAATCACAACACATAAAGACGTAAGGTAGAAAATGTAGCCCAT-3，； 引物F3:5 ' -TCTAGAGGAGCCTGTTCT-3 ' ； 引物B3:5 ' -GTCATTAATTTCATAATGGCTTTCG-3 '。2. -种羊源性成分的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 51、 提取待测样品DNA; 52、 配制LAMP检测反应体系，反应体系包括权利要求1所述的引物； 53、 以S1的DNA为模板进行LAMP扩增反应，用实时荧光法鉴定结果。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应体系为:2 X反应液RM 12.5yL，引 物FIP、BIP各l.OyL，引物F3、B3各 1.0yL，Bst DNA聚合酶l.OyL，荧光染料0.5yL，DNA模版2.0 yL，补水至25yL。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物FIP、BIP的浓度是40ymol/L，所述 引物F3、B3的浓度是5ymol/L。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述扩增反应的程序为：保温阶段63°C 30s，1个循环;循环阶段63 °C 15s，63 °C 45s，60个循环。6. -种检测羊源性成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引 物。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、2 X反 应液RM、Bst DNA聚合酶、荧光染料。
【文档编号】C12Q1/68GK105838807SQ201610332595
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】罗宝正, 赵福振, 邵建宏, 薄清如, 王小玉, 彭玉芬, 黄海超, 陈敬
【申请人】珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心