一种斑茅育种材料的筛选方法
【专利摘要】本发明提供了一种斑茅育种材料的筛选方法，包括以下步骤：收集斑茅资源，并对其进行表型性状的变异分析与性状间相关性分析；提取斑茅的基因组DNA作为模板，采用SCoT标记引物进行扩增，聚丙烯电泳检测扩增产物，获得DNA指纹图谱；对斑茅资源进行多态性分析和J遗传相似性系数分析，并构建UPGMA系统树；根据不同斑茅资源的不同生态位置、表型变异特点与系统树进行综合分析，得到筛选材料。采用本发明的技术方案，结合使用表型性状的变异分析与分子标记技术，使得筛选结果更灵敏、精确；综合评价了斑茅种质资源的利用潜力，筛选出了斑茅育种材料，为甘蔗育种服务。
【专利说明】
-种斑茅育种材料的筛选方法
技术领域
[0001] 本发明属于农业育种技术领域，尤其设及一种斑茅育种材料的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 甘薦是我国最主要的糖料作物，也是广西最主要的经济作物。现代甘薦亲本主要 具有热带种、细茎野生种(割手密)和印度种等=种血缘，在数十年"高贵化"育种进程中，甘 薦遗传基础变得逐渐狭窄。因此，加大力度利用甘薦野生资源拓宽甘薦遗传基础被认为是 甘薦育种获突破的关键途径之一。
[0003] 斑茅是甘薦重要的野生种质，具有抗旱、耐瘡、耐溃、抗病、抗虫性强等优点，目前 是世界各甘薦研究机构重点研究的热点。传统的育种选择是对表型性状的变异进行选择， 但有些重要性状无法在早期检测出来，且表型选择容易受到环境的干扰。分子标记技术可 W从进行DNA角度出发，根据基因组遗传多态性进行分析，能提高选择的准确度，缩短育种 周期，提高育种效率和选择的可靠性，相当简便。
[0004] 斑茅具有丰富的表型性状，单独进行表型变异来分析斑茅的利用潜力，容易受环 境影响而最终影响斑茅利用潜力。然而，当前对斑茅种质资源进行利用性评价，往往只进行 表型性状的调查与分析，而没有将表型变异结果结合分子水平上的遗传分析相结合，也无 法获得基因型差异较大的斑茅材料等信息。
【发明内容】
[0005] 针对W上技术问题，本发明公开了一种斑茅育种材料的筛选方法，将表型性状与 分子标记技术相结合并进行分析，可有效利用斑茅种质资源。
[0006] 对此，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种斑茅育种材料的筛选方法，包括W下步骤：
[000引步骤Sl:收集斑茅资源，并对其进行表型性状的变异分析与性状间相关性分析； [0009]步骤S2:提取斑茅基因组DNA作为模板，采用SCoT标记引物进行扩增，聚丙締电泳 检测扩增产物，获得DNA指纹图谱；
[0010]步骤S3:对斑茅资源进行多态性分析和遗传相似性系数分析，并构建UPGMA系统 树；
[0011] 步骤S4:根据不同斑茅资源的不同生态位置、表型变异特点与系统树进行综合分 析，得到筛选材料。
[0012] 作为本发明的进一步改进，步骤S2中，还包括对SCoT引物进行筛选，筛选出多态性 高、分布均匀和集中25化P-1000 bp区域的斑茅专用标记引物，采用斑茅专用标记引物进行 扩增。
[OOU]作为本发明的进一步改进，所述斑茅专用标记引物包括SCoTl引物、SCoT2引物、 SCoT24 引物、SCoT25 引物、SCoT26 引物、SCoT27 引物、SCoT28 引物、SCoT29 引物、SC〇T30 引物、 SCoT31引物、SCoT35引物、SCoT36引物、SCoT37引物、SCoT39引物、SCoT42引物中至少一种； 其中，所述SCoTl的氨基酸序列为SEQ ID NO: I，所述SCoT2的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2,所 述SCoT24的氨基酸序列为SEQ ID N0:3,所述SCoT25的氨基酸序列为SEQ ID N0:4,所述 SCo26的氨基酸序列为SEQ ID N0:5,所述SCoT27的氨基酸序列为SEQ ID N0:6,所述SCoT28 的氨基酸序列为SEQ ID N0:7,所述SCoT29的氨基酸序列为SEQ ID N0:8,所述SC〇T30的氨 基酸序列为SEQ ID N0:9,所述SCoT31的氨基酸序列为SEQ ID ^:10，所述5(：〇135的氨基酸 序列为SEQ ID NO: 11，所述SCoT36的氨基酸序列为SEQ ID NO: 12,所述SCoT37的氨基酸序 列为SEQ ID NO: 13,所述SCoT39的氨基酸序列为SEQ ID NO: 14,所述SCoT42的氨基酸序列 为沈Q ID NO: 15。
[0014] 作为本发明的进一步改进，步骤S3中，所述遗传相似性系数分析时，W相似系数为 0.73进行切割。
[0015] 作为本发明的进一步改进，步骤S2中，扩增时的反应体系为20iil，其中含10 X buffer (Mg2+) 2.0山、50ng DNA模板0.化 1、20皿01/L 引物、4. Ommo 1/L dNTP、0.2山浓度为抓/ iil的化q DNA聚合酶。
[0016] 作为本发明的进一步改进，扩增程序为:94°C预变性4min，95°C变性50s，50°C复性 40s，72°C延伸2min，36个循环，最后72°C延伸8min。
[0017] 作为本发明的进一步改进，步骤S2中，PCR产物采用6%非变性聚丙締酷胺胶进行 电泳分离。
[0018] 目标起始密码子多态性分子标记（sta;rt condon 1:argeted polymo;rphism,SCoT) 已被证实是一种分析农作物遗传多样性和聚类关系的有效方法，该标记是一种基于翻译起 始位点的目的基因标记技术，根据翻译起始位点ATG侧翼序列的保守性，设计单引物，通过 PCR扩增产生偏向候选功能基因区的显性多态性标记，由于用于标记分析的引物长度较长， 退火溫度较高，又是一种WPCR为基础的标记，因此，该技术不仅兼具了简便性、低成本、丰 富多态性和重复性好等优点，而且还能对目的基因进行标记。
[0019] 基因组DNA指纹图谱强调唯一性，运要求通过引物扩增出来的谱带具有较好的多 态性和特异性，才能有效鉴别作物种质资源。本发明的技术方案是首先从不同生态环境收 集斑茅种质资源，先开展大田比较试验进行表型性状的变异分析与性状间相关性分析;后 利用CTAB法对斑茅种质进行基因组DNA提取，利用多态性高、成熟有效的SCoT标记结合聚丙 締凝胶电泳技术，对扩增产物进行电泳检测，从多条引物中筛选出多态性高、分布均匀和区 域集中在25化P~1000 bp的引物15条。再进行斑茅种质资源的多态性分析、遗传相似性系数 分析及系统树构建分析;最后结合不同生态位置、表型变异特点与系统树，综合分析斑茅种 质资源的利用潜力。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0021] 单独进行表型性状的变异分析，往往由于环境影响大而影响结果的准确性，而 SCoT标记本身是检测性灵敏的技术，采用本发明的技术方案，结合使用表型性状的变异分 析与分子标记技术，使得结果更灵敏、精确;综合评价了斑茅种质资源的利用潜力，筛选出 了斑茅育种材料，为甘薦育种服务。
[0022] 同时，本发明的技术方案进一步将不同生态位置、表型变异特点与系统树综合分 析，筛选出生态环境差异较大、生物量较高且基因型差异较大的5份斑茅无性系作为甘薦育 种中的重点利用材料。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明SCoT29引物对斑茅无性系的ScoT检测结果图。
[0024] 图2是本发明50份斑茅无性系的UPGMA聚类图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0026] 操作流程:斑茅资源收集一大田表型分析试验一不同表现性状的变异分析一不同 表型性状间的相关性分析一提取斑茅基因组DNA-SCoT扩增一聚丙締凝胶电泳一统计分 析一获得DNA指纹图谱一斑茅资源的多态性分析一UPGMA系统树构建与分析一不同生态位 置、表型变异特点与系统树综合分析一重点利用材料筛选。
[0027] 具体方法和过程如下：
[0028] (1)从广西不同生态地区采集斑茅无性系50份，同时利用GI^仪器测量采集点的海 拔和经缔度，50份供试斑茅无性系的名称及来源如表1所示。
[0029] 表1供试斑茅无性系的名称及来源
[0030]
[0031]
[0032] (2)主要表型性状变异调查与分析
[0033] 采用桶栽种植，随机区组设计，3个重复。2014年2月2日种植，10月30日调查其株 高、茎径、穗长、穗节数等指标，分析斑茅无性系的数量性状变异。利用SAS软件对数量性状 进行变异系数(CV)分析，描述4个数量性状的离散程。
[0034] 如表2所示，50份斑茅无性系的4个数量性状变异幅度介于12.71 %-16.14%之间。 株高范围是219-404畑1，平均为337cm;茎径范围是0.56-1.07畑1，平均为0.82cm;穗长范围是 40.2-80.4cm，平均为59.7cm;穗节数范围是11-21节，平均为17节。不同材料之间存在一定 差异，表现出明显的形态多样性。变异幅度最大的是茎径，变异系数达16.14%;其次是穗 长，变异系数为15.97 % ;株高和穗节数变异系数分别为13.12 %和12.71 %。
[0035] 表2广西斑茅无性系形态学特征分析
[00371
[0038] 对不同来源的50份广西斑茅材料4个数量性状进行相关性分析，结果如表3所示， 株高与茎径、穗长均呈极显著正相关，相关系数分别为0.4468、0.328;茎径与穗节数呈极显 著正相关，相关系数为0.211，与穗长呈显著正相关，相关系数为0.0612;穗长与穗节数呈极 显著正相关，相关系数为0.4529。结果表明，随着斑茅不断长高，茎径变得越来越大;斑茅的 植株高度越高，其花穗也越长;茎径较大和花穗较长的斑茅，其穗节数就越多。
[0039] 表3广西斑茅形态学性状间的相关关系 [00401
[0041] 注:*表示显著相关;**表示极显著相关。
[0042] (3)斑茅基因组DNA提取
[0043] 采用CTAB提取各斑茅材料的基因组DNA。
[0044] (4)引物设计和筛选
[0045] 选用GUX01、GUX02、GUX03、GUX04、GUX05等50份斑茅材料，对46对SCoT引物进行初 步筛选，聚丙締电泳检测扩增产物。15对引物扩增出了较清晰的谱带，并具有良好的重复 性，其中分子量范围25化P-1000 bp之间谱带较好，部分结果见图1。
[0046] 从46对引物中筛选出15条引物（要求多态性和特异性好，谱带在250bp-1000bp分 布较集中且均匀，氨基酸序列如表4所示。
[0047] 表4 SCoT标记引物序列 [004引
[00加]选用GUX01、GUX02、GUX03、GUX04、GUX05等50份斑茅材料，提取其基因组DNA作为模 板，分别利用W上15条引物进行扩增，聚丙締电泳检测扩增产物(图1)。
[0051]反应体系为20山，其中含10Xbuffer(Mg2+)2.0i^l、DNA模板(50ng)0.?^l、20皿ol? レl引物、4.0mmol?レldNTP、0.化lTaqDNA聚合酶（5UA^l)。扩增程序为：94°C预变性 4min，95°C 变性 5〇3,50°(：复性4〇3,72°(：延伸2111111，36个循环，最后72°(：延伸8111111。？0?产物采 用6%非变性聚丙締酷胺胶进行电泳分离。
[0052]本着"不同引物中，同一个等位基因位点，多态性较丰富的引物结果入选"的原则， 从15对专用引物中筛选出336条谱带，范围在25化p-lOOObp，共检测到位点336个，其中多态 性位点284个，多态性检出率为83.93%。各引物多态性变幅为69.57 %-100%，多态性最高 的是引物SCoT24,达100.00%。多态性最低的是引物8(：〇135，为69.57%。每条引物检测的位 点数为17-30个，平均位点数为22个，其中多态性位点16-26个，平均为19个;总位点数和多 态性位点数最多的引物均为SCOT27，详见表5。
[0化3] 表5 15条SCoT引物的多态性 |；0化41
[0055] 参试的50份材料中，遗传相似系数在0.65-0.81之间，平均为0.71。遗传相似系数 最高是GUX09和GUXlO，为0.88;遗传相似系数最低是GUXlO和GUX30，为0.61。根据遗传相似 性系数，用UPGM进行聚类，构建50份斑茅无性系的分子系统树（图2)。在相似系数约0.73切 割时，所有供试材料可划分为4个类群。其中，GUX45、GUX49、GUX50为第I类群;GUX48为第n 类群;GUX38为第虹类群;GUX01、GUX02、GUX03等45份无性系为第IV类群。
[0056] 6.不同生态位置、表型变异特点与系统树综合分析，及重点利用材料筛选。
[0057] 从系统树中可知，自成一系的GUX38、GUX45、GUX48、GUX49、GUX50与绝大部分材料 的基因型差异较大，运些材料主要来自广西桂林市永福县、广西凭祥市、广西河池市融水县 下精坪村和广西百色市田阳县，运几个材料的株高在292-358cm之间，同时大多高于平均水 平，因此运些斑茅材料的生物量会处于较高水平(株高与茎径是斑茅生物量的主要影响因 子）。结合不同生态气候、生物量和基因型差异综合分析，筛选出GUX38、GUX45、GUX48、 GUX49、GUX50等5个优良，应作为甘薦育种中的重点利用材料。
[005引本发明通过表型变异调查，表明株高、茎径、穗长、穗节数等4个数量性状变异系数 介于12.71 %-16.14%之间，茎径的变异系数最大，为16.14%，其次是穗长，为15.97 %，最 小是穗节数，为12.71%，茎径的利用潜力最大。相关性分析表明，株高与茎径、穗长均呈极 显著正相关，相关系数分别为0.4468、0.328。茎径与穗节数呈极显著正相关，相关系数为 0.211。茎径与穗长呈显著正相关，相关系数为0.0612。穗长与穗节数呈极显著正相关，相关 系数为0.4529;通过15对引物336条谱带获得的斑茅基因组DNA指纹图谱，其中多态性位点 284个，多态性为83.93%，说明广西斑茅具有较丰富的遗传多样性;进行UPGMA聚类分析，50 份广西斑茅无性系遗传相似系数范围为0.65-0.81，在相似系数为0.73时，可划分为4个类 群，同一地区的广西斑茅无性系基本聚在同一类群，呈现出一定的地域性分布规律;最后将 不同生态位置、表型变异特点与系统树综合分析，筛选出生态环境差异较大、生物量较高且 基因型差异较大的5份斑茅无性系作为甘薦育种中的重点利用材料。
[0059]由上述实验结果可见，将表型变异与SCoT标记结合使用，使得结果有效而精确。筛 选出的15对斑茅种质的适宜引物，多态性和特异性好，谱带在25化P- 1000 bp分布较集中、均 匀。将不同生态位置、表型变异特点与系统树综合分析，筛选出了可在甘薦育种中重点关注 的斑茅种质材料。
[0060] W上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护犯i围。
【主权项】
1. 一种斑茅育种材料的筛选方法，其特征在于:包括以下步骤： 步骤S1:收集斑茅资源，并对其进行表型性状的变异分析与性状间相关性分析； 步骤S2:提取各斑茅基因组DNA作为模板，采用SCOT标记引物进行扩增，聚丙烯电泳检 测扩增产物，获得DNA指纹图谱； 步骤S3:对斑茅资源进行多态性分析和遗传相似性系数分析，并构建UPGMA系统树； 步骤S4:根据不同斑茅资源的不同生态位置、表型变异特点与系统树进行综合分析，得 到筛选材料。2. 根据权利要求1所述的斑茅育种材料的筛选方法，其特征在于：步骤S2中，还包括对 SCoT引物进行筛选，筛选出多态性高、分布均匀和集中250 bp - 1000 bp区域的斑茅专用 标记引物，采用斑茅专用标记引物进行扩增。3. 根据权利要求2所述的斑茅育种材料的筛选方法，其特征在于:所述斑茅专用标记引 物包括 SCoTl 引物、SCoT2 引物、SCoT24 引物、SCoT25 引物、SCoT26 引物、SCoT27 引物、SCoT28 引物、SCoT29 引物、SC〇T30 引物、SCoT31 引物、SCoT35 引物、SCoT36 引物、SCoT37 引物、SCoT39 引物、SC〇T42引物中至少一种;其中，所述SCoTl的氨基酸序列为SEQ ID N0:1，所述SC〇T2的 氨基酸序列为SEQIDN0:2，所述SCoT24的氨基酸序列为SEQIDN0 :3，所述SCoT25的氨基 酸序列为SEQ ID N0:4,所述SCo26的氨基酸序列为SEQ ID N0:5,所述SCoT27的氨基酸序列 为SEQ ID N0:6,所述SCoT28的氨基酸序列为SEQ ID N0:7,所述SCoT29的氨基酸序列为SEQ ID N0:8,所述SC〇T30的氨基酸序列为SEQ ID N0:9,所述SCoT31的氨基酸序列为SEQ ID NO: 10,所述SCoT35的氨基酸序列为SEQ ID NO: 11，所述SCoT36的氨基酸序列为SEQ ID NO: 12,所述SCoT37的氨基酸序列为SEQ ID NO: 13,所述SCoT39的氨基酸序列为SEQ ID NO: 14， 所述SCoT42的氨基酸序列为SEQ ID NO: 15。4. 根据权利要求1所述的斑茅育种材料的筛选方法，其特征在于：步骤S3中，所述遗传 相似性系数分析时，以相似系数为0.73进行切割。5. 根据权利要求1所述的斑茅育种材料的筛选方法，其特征在于：步骤S2中，扩增时的 反应体系为20 μL，其中含 10 X buffer(Mg2+)2.0 μ1、50 ng DNA模板0.5 μ1、20μL?〇1/1 引 物、4.0 mmol/L dNTP、0.2 μL 浓度为5 U/μΙ的Taq DNA聚合酶。6. 根据权利要求5所述的斑茅育种材料的筛选方法，其特征在于:扩增程序为:94 °C预 变性4 min，95°C变性50 s，50 °C复性40 s，72 °C延伸2 min，36个循环，最后72 °C延伸8 min〇7. 根据权利要求5所述的斑茅育种材料的筛选方法，其特征在于:步骤S2中，PCR产物采 用6%非变性聚丙烯酰胺胶进行电泳分离。
【文档编号】C12Q1/68GK105838810SQ201610339595
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】刘昔辉, 张荣华, 宋焕忠, 李杨瑞, 张革民, 杨柳, 方位宽, 谭宏伟
【申请人】广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所