与黄瓜白粉病抗性主效qtl共分离的ssr分子标记的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一个与黄瓜白粉病抗性主效QTL共分离的SSR分子标记，命名为SSR?N2。SSR?N2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的SSR分子标记具有高稳定性，可以简便、快速地应用于黄瓜苗期白粉病抗性单株的辅助筛选，为白粉病抗性的分子标记辅助育种奠定了基础，这将大大加快黄瓜白粉病抗性分子育种的进程。同时，这个共分离的分子标记也为黄瓜白粉病抗性主效QTL的克隆奠定基础。
【专利说明】
与黄瓜白粉病抗性主效QTL共分离的SSR分子标记
[0001 ]本发明是发明名称为"与黄瓜白粉病抗性主效QTL共分离的SSR分子标记"，申请号 为2014103823068,申请日为2014-8-6的在先申请的分案申请。
技术领域
[0002]本发明涉及基因工程技术，具体涉及与黄瓜白粉病抗性主效QTL共分离的SSR分子 记 D
【背景技术】
[0003] 黄瓜(Cucumis sativus L.)为萌芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属一年生草本蔓生攀 缘植物。黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一，占全国蔬菜 面积的10%左右。黄瓜不仅作为重要的蔬菜作物历来备受育种家的重视，并且黄瓜染色体 数目较少2n = 2x=14,基因组较小，特别在2009年，黄瓜基因组的成功测序为黄瓜作为萌芦 科的模式植物进行分子生物学研究提供了极大便利。
[0004] 在黄瓜生产中，面临许多疾病的危害，其中白粉病是最为严重的病害之一。黄瓜白 粉病是由专性寄生菌(Podosphaera xanthii)引起的真菌病害，能在整个黄瓜生育期发病， 主要危害叶片，严重时可危害茎蔓，特别是在生长中后期发病严重，使植株提早拉秧，造成 严重的产量损失。田间施药，造成农药残留，影响果实品质，危及食品安全，并且会污染环 境。长期施药还会促进白粉病菌生理小种产生抗性，从而增加防治难度，增加种植户生产成 本。培育抗病的黄瓜品种是解决白粉病危害的最好方法。常规的抗病育种耗时长，需要经过 多代杂交和回交过程;病害发生和环境条件密切相关，需要专门的病圃进行接种鉴定;这些 都增加了培育黄瓜抗病品种的难度。
[0005] 分子育种可以大大加快育种进程，显著缩短育种周期。现代生物技术的迅猛发展， 为抗病育种开辟了新的途径，利用生物技术培育抗病品种已成为目前的热点。分子育种的 前提是获得相关性状的功能基因或与其紧密连锁的分子标记。利用分子标记分析体系，在 遗传群体上鉴定抗病遗传规律，同时结合分子标记遗传连锁图谱，定位和克隆白粉病抗性 基因，研究其功能和抗性的分子调控机制，可以为黄瓜抗性基因的分子标记辅助育种及分 子设计育种提供理论依据。利用与抗病基因紧密连锁的分子标记，开展分子标记辅助选择 育种，可将多个抗病基因整合到一个品种，显著提高育种效率，缩短育种时间，而且大幅度 提高了抗病的力度和持久性，这对于培育出满足种植者需求的黄瓜抗病新品种具有重要意 义。
[0006] 虽然萌芦科作物黄瓜白粉病的发生比较普遍和严重，但是关于其白粉病抗性基因 定位的研究相对较薄弱，尚未找到与白粉病抗性基因/QTL共分离的标记，更不用说基因的 克隆及抗性分子机制的研究，目前停留在主效基因/QTL定位的阶段。由于诸多报道表明黄 瓜白粉病抗性由多个隐性基因控制，研究者对其进行了QTL的分析。2006年，Sakata等利用 97株黄瓜抗感组合的重组自交系群体，首次定位了黄瓜抗白粉病性状的QTL;在4个连锁群 上检测到6个与温度相关的QTL，其中在LGII上的一个主效QTL在20°C和26°C下均表现出抗 性。Liu等(2008a)利用黄瓜高感白粉病自交系S94和高抗白粉病自交系S06构建的F2:3家系 进行了 QTL定位，共检测到5个白粉病抗性QTL，分布于连锁群1、2、5上，单个QTL的贡献率介 于3.4%~45 %之间；还通过这两亲本构建的重组自交系共检测到4个白粉病抗性QTL，分别 位于连锁群1、2、4、6上，单个011的贡献率介于5.2%~21.0%之间〇^116七&1.，200813)。沈 刚平（2009)应用ISSR( inter-simple sequence repeats)和SRAP( sequence-related amplified polymorphism)标记技术，以高感白粉病黄瓜品种D8和高抗白粉病黄瓜品种 了1阳的？2群体检测到控制黄瓜白粉病抗性的2个QTL，均位于第3连锁群上，贡献率为7.6% 和13.5%。张圣平等（2011)以1(8(抗病）\1(18(感病）组合的？2和?2:3家系为研究对象，共检 测到4个白粉病抗性的QTL。最近，Fukino等(2013)利用重组自交系检测到9个QTL，分别位于 染色体1、3、4、5、6上，单个〇11的贡献率介于5%~44%之间，其中4个位点的效应通过剩余 杂合体(residual heterozygous lines，RHLs)得到了证实。He等(2013)利用F2:3家系对黄 瓜下胚轴、子叶和真叶的白粉抗性同时进行了QTL分析，结果在1、3、4、5号染色体上检测到6 个QTL，单个QTL的贡献率介于6.1%~74.5%之间；其中2个主效0孔位于5号染色体的40〇1 的区间内，解释21.0-74.5%的贡献率，下胚轴抗性QTL对黄瓜白粉抗性起到了最重要的作 用。
[0007] 上述多数研究表明，黄瓜对白粉病的抗性由多个基因共同作用，而且抗性基因表 现为隐性效应，这些因素增加了抗病基因精细定位和分离的难度。由于黄瓜白粉病对黄瓜 生产影响很大，对黄瓜白粉病抗性基因的研究很多，但是目前尚未有该抗病基因克隆和分 子机制研究的报道，已获得的连锁标记遗传距离较远，不利于分子标记辅助育种的开展，阻 碍了抗病品种分子育种的进程。因此，寻找与黄瓜白粉病抗性基因/QTL紧密连锁、共分离的 分子标记，对其进行精细定位、分离与克隆，这不但能够为其抗病分子育种提供良好的技术 支撑，也为揭开黄瓜白粉病抗性的分子机制奠定基础。
【发明内容】
[0008] 本发明是申请号为2014103823068,申请日为2014-8-6的在先申请的分案申请。
[0009] 本发明的目的，在于克服QTL定位难度大的问题，提供一个与黄瓜白粉病抗性主效 QTL pm5.1共分离的共显性SSR分子标记。本发明利用BSA(Bulked Segregant Analysis)和 QTL定位法，找到一个控制白粉病抗性的主效QTL。为了精细定位此主效QTL，我们构建了含 主效QTL的染色体片段代换系（Chromosome Segment Substitution Lines，CSSL)及其回交 分离群体。通过精细定位及标记的开发，得到三个与黄瓜白粉病抗性主效QTL共分离的SSR 标记，以便分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记可简便、快速、高通量地应用 于育种实践。
[0010] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0011] 一个与黄瓜白粉病抗性主效QTL共分离的SSR分子标记，命名为SSR-N2,其核苷酸 序列如SEQ ID N0.1所示。
[0012] 上述SSR-N2由上游引物SSR-N2-F和下游引物SSR-N2-R PCR扩增得到，所述上游引 物SSR-N2-F的序列为5 ' -CTTCATTGTTGATTTCCAGGC-3 '，所述下游引物SSR-N2-R的序列为5 ' - TGTTACGACCTATAACCACAAAAT-3'。
[0013]本发明用BSA和QTL定位法，利用?2群体找到一个控制白粉病抗性的主效QTL。为了 精细定位此主效QTL，利用不断回交的方法构建了含主效QTL的染色体片段代换系 (Chromosome Segment Substitution Lines，CSSL)及其回交分离群体。通过对回交分离群 体BCsFi，BC2F2的抗性鉴定分析，白粉病抗性已变为单孟德尔因子遗传，即由单基因控制，抗 性为隐性遗传。通过精细定位，抗性基因定位到标记UW065021与UW065094之间，物理距离 170kb。通过黄瓜基因组序列，在其中间开发SSR标记，最后得到三个与黄瓜白粉病抗性主效 QTL共分离的SSR标记，分别被命名为SSR-N1，SSR-N2，SSR-N3。3个共分离SSR分子标记为共 显性标记，能够区分纯合体和杂合体，将有利于白粉病抗性育种的分子标记辅助体系的建 立，可简便、快速、高通量地应用于育种实践。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:常规传统的抗病育种耗时长，需要经 过多代杂交和回交过程;病害发生和环境条件密切相关，需要专门的病圃进行接种鉴定;这 些都增加了培育黄瓜抗病品种的难度。由于白粉病菌为专性寄生菌，抗性鉴定需要接种，且 发病后植株容易死掉；而且白粉病抗性基因多表现为隐性效应，常规方法回交育种需要回 交一代后再自交一代来确认抗性基因的渗入，这些因素都增加了白粉病抗性育种的周期和 难度。本发明的共分离SSR分子标记为共显性，可在黄瓜苗期鉴定植株，并能够区分纯合子 和杂合子，回交渗入过程中省去了每代自交的步骤，用分子标记来跟踪抗性基因，既省时也 准确，所以可用于黄瓜白粉病抗性的分子标记辅助育种，大大加速黄瓜白粉病抗性育种的 进程。同时共分离标记也将促进白粉病抗性QTL/基因的克隆，从而为揭示白粉病抗性形成 的分子机制奠定基础。
【附图说明】
[0015] 图1是分子标记SSR-N1的聚丙烯酰胺凝胶电泳效果；
[0016] 图2是分子标记SSR-N2的聚丙烯酰胺凝胶电泳效果；
[0017] 图3是分子标记SSR-N3的聚丙烯酰胺凝胶电泳效果。
[0018] 图中所示，S1001为抗病亲本;S05为感病亲本;Fjf表两亲本杂交后代;R和S分别 代表BC2F2回交分离群体中随机挑选的抗病和感病植株的检测结果。
【具体实施方式】
[0019] 一、黄瓜白粉病抗性主效QTL/基因的鉴定 [0020] 1.群体构建与抗性鉴定
[0021]初步的抗性QTL定位用的是F2群体，抗病亲本是S1003,感病亲本是S1001，它们都 属于华北类型的黄瓜自交系。两亲本杂交产生的Fl代自交产生F2代群体。白粉病抗性鉴定所 使用的菌种是从上海交通大学温室发病的黄瓜植株上分离得到的。随机选择148株^代个 体在苗期进行抗性鉴定。从感病幼苗上采集纯化的白粉病菌，用无菌水制成孢子悬浮液，调 至浓度为1 X 1〇5个· ml/1。在黄瓜第三片真叶刚展开时把调配好的孢子悬浮液均匀喷到真 叶上，以不成水滴状为准。接种培养12d后调查发病情况。植株的发病情况根据Morishita等 (2003)划分为5个等级。0级和1级视为抗病，2级以上视为感病。
[0022] 根据发病调查，S1003为高抗，S1001为高感，Fi为感病，偏向于感病亲本;F2群体抗 病性呈现双峰分布，且发病趋势偏向于感病，中间类型较少，说明存在隐性的主效基因控制 白粉的抗病性。
[0023] 2. BSA法和QTL分析确定主效基因的染色体位置
[0024] 因此我们采取BSA法先对抗性主效基因所在的染色体区域进行了分析。从F2分离 群体中分别随机选取高抗和高感个体各10株，建立抗、感基因池。用780对在染色体上平均 分布的SSR引物对两个亲本及两个基因池进行筛选。
[0025] SSR反应体系为基因组DNA 30ng，引物0.2ymol/L，200ymol/L dNTPs，2mmol/L MgC12，lyl 10XPCR reactions buffer，0.5U TaqDNA聚合酶，总反应体系为lOyLPCR扩增 程序为：94°C5min;35 个循环：94°C30s，55-60°C30s，72°C30s;72°C5min。扩增产物用6% 变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为1 X TBE，45W恒功率，电泳1.5h-2h。
[0026] 电泳后进行银染。银染方法为:将带胶的玻璃板放入固定液中，在摇床上轻轻摇动 至指示剂颜色褪去，其中固定液的组成为:冰醋酸、无水乙醇、蒸馏水的体积比为1:10:100; 用超纯水洗lmin-3min;将冲洗后的胶板放入染色液中摇动半小时，其中染色液的组分为 2g/L硝酸银;将染色后的胶板放入超纯水中漂洗5s后放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇 动至条带清晰，放入自来水中冲洗3min;室温下干燥，干燥后拍照，其中显影液是在1L蒸馏 水中加入15g NaOH和3ml甲醛混匀得到的。
[0027] 通过BSA筛选，在第五染色体长臂末端的连续7个SSR标记在池间表现为多态性，因 此白粉病抗性主效基因位于这个区域内。为了进一步确定抗性主效基因的位置，我们进行 了 QTL分析。从黄瓜7条染色体上平均的选择了 73个多态性SSR标记对148株内代个体进行了 电泳分析。使用JoinMap 3.0构建连锁图谱，其中L0D 2 5.0，采用Kosambi函数将重组率转化 为遗传图距。将F2群体单株三个叶片等级的均值作为植株抗病的病情指数进行QTL作图。 QTL分析使用QTL Cartographer 2.5，采用复合区间作图法((ΠΜ)进行QTL作图。通过QTL分 析的结果，在第五染色体的长臂末端找到一个主效QTL pm5.1，这与BSA法得出的位置吻合， 因此我们确定这个位置存在一个控制白粉病抗性的主效QTL。
[0028]二、回交分离群体的构建和主效QTL的精细定位
[0029] 由于亲本S1003与S1001都为华北类型黄瓜，亲缘关系近，多态性标记少，因此构建 回交分离群体时采用了高感白粉病的欧洲温室类型黄瓜自交系S05作为供体亲本。结合MAS 通过多代回交后自交，构建了仅主效QTL pm5.1区域分离的回交群体BC3Fi，BC2F2。分别对2 个BC3Fi群体（114株，480株)和BC2F2群体(483株)的抗性鉴定，抗、感比例经过卡方分析符合 1:1和1: 3，因此，抗性QTL已经转化为单孟德尔因子，即单基因控制，且抗病为隐性遗传。通 过主效QTL区域已开发的分子标记对这1074个单株进行连锁分析，结果将抗病基因精细定 位到SSR标记UW065021与UW065094之间，物理距离170kb。通过黄瓜基因组序列，在其中间开 发了 15对SSR标记，结果只有3对在亲本间有多态性，即分子标记SSR-N1，SSR-N2，SSR-N3。通 过群体连锁分析，最后得出这三个SSR分子标记与黄瓜白粉病抗性主效QTL共分离，即群体 的抗病植株带型全部和抗病亲本带型一致，而感病植株带型全部为感病亲本或者Fi的带 型。
[0030] 图1是分子标记SSR-N1的聚丙烯酰胺凝胶电泳效果，图2是分子标记SSR-N2的聚丙 烯酰胺凝胶电泳效果，图3是分子标记SSR-N3的聚丙烯酰胺凝胶电泳效果。
[0031]
【主权项】
1. 一个与黄瓜白粉病抗性主效QTL共分离的SSR分子标记，命名为SSR-N2，其核苷酸序 列如SEQ ID N0.1所示。2. 根据权利要求1所述的与黄瓜白粉病抗性主效QTL共分尚的SSR分子标记，其特征在 于，所述SSR-N2由上游引物SSR-N2-F和下游引物SSR-N2-R PCR扩增得到，所述上游引物 SSR-N2-F的序列为5 ' -CTTCATTGTTGATTTCCAGGC-3 '，所述下游引物SSR-N2-R的序列为5 ' -TGTTACGACCTATAACCACAAAAT-3'。
【文档编号】C12N15/11GK105838812SQ201610341936
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年8月6日
【发明人】何欢乐, 聂京涛, 蔡润, 潘俊松, 杨俊俊, 彭佳林
【申请人】上海交通大学