一种应用于肿瘤基因的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种应用于肿瘤基因的检测方法，包括以下步骤：1）、选定肿瘤基因检测片段；2）、将步骤1）选定的肿瘤相关基因片段固定在载体上；3）、由样品中提取总RNA完成标记和逆转录；4）、将步骤3）标记的样品片段与步骤2）的固定在载体上的基因片段杂交；5）、获得步骤4）杂交结果。采用本发明所述基因检测方法能够实现肿瘤疾病的早期诊断，反应结果可用肉眼判断，可极大地降低分析诊断的成本。
【专利说明】
一种应用于肿瘤基因的检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种基因检测方法，具体涉及一种应用于肿瘤基因的检测方法。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤一癌症是一种常见且严重威胁人类生命的疾病。国内外近年的统计资料显示，肿瘤发病率仍有逐年增加的趋势。据国家卫生部门统计，九十年代我国肿瘤发病率已上升为0.127%。虽然近年来世界各国在肿瘤疾病研究方面已取得较大的进展，但总体上对肿瘤细胞的病变和转移以及药物对肿瘤细胞的作用机理等还不十分清楚，所以到目前为止仍以预防和早期诊断、早期治疗为主。因此，本领域迫切需要一种对肿瘤疾病进行早期诊断和研究的方法和工具。
[0003]生物芯片技术是20世纪90年代发展起来的一项高新技术，其高通量、快速、高效地分析生物信息的能力使其在揭示肿瘤发生、发展的规律，在肿瘤早期诊断、个体化治疗及预后判定等方面具有其他方法不可比拟的优势，因而也被视为人类攻克癌症等恶性疾病的新希望。同时可望使恶性肿瘤的早期诊断、药物筛选、基因突变确认，以及及时、快速、准确地预测肿瘤的转移复发等医学研究领域发生革命性进步，从根本上提高肿瘤诊断和治疗水平。
[0004]目前利用生物芯片检测肿瘤相关基因一般包括以下步骤:
芯片构建-样品制备-信号检测和分析。
[0005]目前，利用生物芯片检测肿瘤相关基因的方法存在以下缺点。
[0006]用于探针标记的放射性物质或荧光物质对人体和环境均具有一定的危害性。标记的模板RNA为mRNA，mRNA的分离纯化过程较烦琐，且mRNA本身在此过程中易被降解。
[0007]探针与芯片的杂交结果需要用昂贵的激光共聚焦扫描仪进行判读，较高的成本影响了芯片的实际应用。
[0008]基于此，实验室研发人员研究开发了一种应用于肿瘤基因的检测方法。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种应用于肿瘤基因的检测方法，具有高通量、准确定量、灵活性强、成本低的等特点。
[0010]—种应用于肿瘤基因的检测方法，包括以下步骤:
1)、选定肿瘤基因检测片段；
2)、将步骤I)选定的肿瘤相关基因片段固定在载体上；
3)、由样品中提取总RNA完成标记和逆转录；
4)、将步骤3)标记的样品片段与步骤2)的固定在载体上的基因片段杂交；
5)、获得步骤4)杂交结果。
[0011]进一步地，为了更好的实现本发明，所述肿瘤相关基因片段是SD01-93。
[0012]进一步地，为了更好的实现本发明，所述逆转录时使用的引物是针对肿瘤相关基因特异性片段的寡核苷酸反向引物。
[0013]进一步地，为了更好的实现本发明，所述标记时使用的引物是12-18nt的寡聚胸腺嘧啶引物。
[0014]进一步地，为了更好的实现本发明，所述所使用的引物是PN01-82。
[0015]进一步地，为了更好的实现本发明，所述步骤5)完成杂交后还进行显色反应。
[0016]本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果:
(I)本发明所采用的方法中用一次逆转录反应标记多个肿瘤基因探针，并以样品总RNA作为检测样本，可快速检测样品中是否有肿瘤基因。
[0017](2)本发明所采用的检测方法应用到肿瘤基因检测中可方便有效地检测样品中是否存在肿瘤相关基因，实现对肿瘤疾病的早期诊断。
[0018](3)本发明所采用针对肿瘤基因的检测方法，可通过显色反应反映出来，且反应结果可用肉眼判断，极大确认样品中是否有肿瘤基因的成本。
【具体实施方式】
[0019]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
[0020]实施本发明检测方法时首先要制备检测用芯片。本发明的检测用芯片可以使用本领域技术人员熟知的常规载体制备，例如玻璃片、尼龙膜、硅片等均可用作本发明检测用芯片的载体。
[0021]载体上固定的肿瘤相关基因可以是已知的任何肿瘤相关基因，这些肿瘤相关基因可以从诸如Genebank等公共数据库中获得。
[0022]在本发明的一个实施方案中，从Genebank等人类基因组公用数据库中筛选出一系列肿瘤相关基因，以其特异的编码序列(CDS)为对象，通过计算机辅助搜索，以编码序列中最后的100个碱基的5’端起，向3’端方向人工合成一段SOnt的碱基序列，用作肿瘤基因检测芯片的cDNA探针，连同看家基因一起固定在固相载体上，制备成肿瘤基因芯片。选择最后的100个碱基主要考虑到逆转录反应的起始效应，逆转录反应的5 ’端向3 ’端延伸时，先合成的cDNA片段即是与固定在膜上的SOnt的碱基序列互补的一段，因此，这样的选择有利于后面的杂交步骤。
[0023]在本发明的优选实施方案中，本发明的检测用芯片上固定有80个肿瘤相关基因和2个看家基因，这些基因及其5 ’端向3 ’端的80个核苷酸序列为现有序列。
将这些cDNA片段固定在固相载体上的方法可以采用本领域技术人员熟知的常规方法。
[0024]在本发明的优选实施方案中，肿瘤基因检测芯片为多斑点的膜芯片。肿瘤基因点样为80个，以平行重复点样，对照基因点样为2个看家基因。共计167个点。
[0025]实施本发明的检测方法中的第三个步骤是提取样品总RNA，逆转录并同时进行地高辛或其他等效样品标记。这里所述的样品可以是任何生物样品，包括血液、组织等。由样品中提取总RNA可以使用本领域技术人员熟知的任何方法。
[0026]在本发明的检测方法中，对样品总RNA进行逆转录过程中同时完成标记。本发明中可以使用无污染、对人体无害的任何标记方法。在本发明的优选实施方案中使用的是地高辛标记。
[0027]逆转录过程中所用的逆转录引物为针对上述肿瘤相关基因特异性片段的寡核苷酸反向引物以及12_18nt的寡聚胸腺嘧啶(oligo dT)引物，其中12_18nt的寡核苷酸引物与20nt的反向引物联合应用。20nt的引物可结合于肿瘤相关基因特异性片段上，从而引发DNA合成反应。12-18nt的寡核苷酸引物-oligo dT可结合于肿瘤相关基因mRNA的polyA+区域，从而引发DNA合成反应。其联合应用可提高逆转录反应的效率。20nt反向引物为编码序列最后100个碱基的3 ’端起向5 ’端方向的20个碱基的互补序列。
[0028]在本发明的优选实施方案中，使用的针对上述肿瘤相关基因特异性片段的寡核苷酸反向引物为现有序列。
[0029]本发明的检测方法中的第三个步骤是使标记的样品总RNA与步骤2)中制备的检测芯片在适宜条件下杂交并读出杂交结果。核酸杂交是本领域技术人员熟知的过程，可以使用任何合适的杂交方式。合适的核酸杂交条件取决于芯片所使用的载体和固定的核苷酸片段以及使用的探针。
[0030]杂交完成后通过显色反应显示杂交结果。肿瘤基因显色为不同浓度的斑点，对照基因点亦出现杂交斑点。杂交结果代表肿瘤基因在人体内的复制表达水平，能进行肿瘤发生、发展的诊断和预后。
[0031]杂交结果可以通过用肉眼观察判断，或者通过扫描仪检测并定量。可以通过用肉眼观察芯片上显色斑点颜色来判断肿瘤芯片中基因表达差异。半定量检测是用扫描仪获得数字图像，软件分析杂交条带或斑点的相对光密度值。也可通过计算机检测靶基因和内参照基因光密度比值，通过比值计算可得出肿瘤基因的表达差异。
实施例
[0032]1、肿瘤相关基因检测芯片的制备 I〕人工合成SD1-93的核苷酸序列；
2)点膜:
将人工合成的探针进行稀释，调整浓度为0.5微克/微升，用微量移液器转移到384孔微孔板中，用 VP384.5a 点膜仪(V&P Scientifics Corp.)点膜。
[0033]3〕固定:
将点膜后的滤膜在80度真空环境下，烘烤30分钟，然后在紫外交联仪内65毫焦/cm2进行交联固定，制备成肿瘤基因芯片。
[0034]2、样品总RNA提取、逆转录和标记
I〕常规方法从样品中提取总RNA ( Chomczynski，P.and Sacchi , N.( 1987)Anal.B1chem.162:156)
2〕逆转录和标记
取两只无菌的200 IPCR管，分别制备溶液A和B。
[0035]A)样品总 RNA(0.25g/l)41 Oligo dT、基因特异性引物(每种引物2pmol)混合物 31 ddH20(RNase&DNase-free) 31 加热到72C温浴2分钟，然后降温到42C。
[0036]B)5X First Strand Buffer61 0.lmol/L DTT 31 dNTP混合物 31 Dig-dUTP(lnmol/l) 31 逆转录酶Superscript II(200U/1) 11 ddH20(RNase&DNase-free) 41 42C温浴2分钟，然后同溶液A混合。
[0037]42C反应2小时。
[0038]3、杂交和显色杂交:
A)预杂交:
I)将膜芯片装入杂交袋中，加入1ml杂交液。尽可能将袋内空气挤压出来，加热封口，将其浸入42 °C的水浴中温育2小时。
[0039 ] 2) 100 °C加热1分钟使探针变性，迅速在冰水浴中骤冷。
[0040]3)将杂交袋剪开一角，换1ml预热的新鲜杂交液，加入探针，尽可能将袋内所有空气挤压出去，加热封口。
[0041 ] 4)将杂交袋浸入42 0C的水浴，杂交过夜。
[0042]5)取出膜芯片并将其置入一个盛有2XSSC和0.1%SDS的托盘内，于室温洗涤4次，每次5分钟。
[0043]6)将膜芯片转移至一个盛有0.2XSSC，0.1 % SDS的平底塑料盒中，洗涤2次，每次30分。
[0044]7)将膜芯片置于一叠纸巾上，以除去大部分液体。
[0045]2、显色:
1)将膜芯片置入封闭液中封闭30分钟
2)加入2毫升抗地高辛抗体稀释液(稀释度为1:3000)
3)用10毫升的洗涤液洗涤3次，每次15分钟
4)加入2毫升的检测缓冲液10分钟
5)加入I毫升NBT/BCIP底物溶液，平铺于膜上用塑料纸盖好，避光，反应时间至阳性参照有清晰的斑点出现为止。
[0046]6)用水冲洗终止反应。
[0047]杂交结果用肉眼检测或扫描仪检测及定量。
[0048]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1.一种应用于肿瘤基因的检测方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)、选定肿瘤基因检测片段； 2)、将步骤I)选定的肿瘤相关基因片段固定在载体上； 3)、由样品中提取总RNA完成标记和逆转录； 4)、将步骤3)标记的样品片段与步骤2)的固定在载体上的基因片段杂交； 5)、获得步骤4)杂交结果。2.根据权利要求1的一种应用于肿瘤基因的检测方法，其特征在于:所述肿瘤相关基因片段是SD01-93。3.根据权利要求2的一种应用于肿瘤基因的检测方法，其特征在于:所述逆转录时使用的引物是针对肿瘤相关基因特异性片段的寡核苷酸反向引物。4.根据权利要求2的一种应用于肿瘤基因的检测方法，其特征在于:所述标记时使用的引物是12-18nt的寡聚胸腺嘧啶引物。5.根据权利要求3或4的一种应用于肿瘤基因的检测方法，其特征在于:所述所使用的引物是PNO1-82。6.根据权利要求1的一种应用于肿瘤基因的检测方法，其特征在于:所述步骤5)完成杂交后还进行显色反应。
【文档编号】C12Q1/68GK105838816SQ201610376189
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】黄平, 欧阳小峰, 毛家丽, 涂大连
【申请人】四川金域医学检验中心有限公司