一种病毒基因组引物及用该引物检测病毒基因组的方法

一种病毒基因组引物及用该引物检测病毒基因组的方法
【专利摘要】本发明涉及一种引物，尤其是涉及一种病毒基因组引物及运用其检测病毒基因组的方法。一种病毒基因组引物，包括如SEQ ID NO:1?SEQ ID NO:8所示的八条核苷酸序列。采用了本发明所述的病毒基因组的引物，克服了现有技术中采用传统随机引物RP检测灵敏度低的缺点，通过分析NCBI病毒库中所有参考病毒基因组序列，筛选出能够广泛识别参考病毒基因组的寡核苷酸序列，并在该序列的基础上建立了一种病毒基因组检测技术，既满足广泛识别病毒基因组的最基本的需要，又达到提高检测病毒基因组的灵敏度的更高目标。
【专利说明】
一种病毒基因组引物及用该引物检测病毒基因组的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种引物，尤其是涉及一种病毒基因组引物及运用其检测病毒基因组 的方法。
【背景技术】
[0002] 2009年，Victoria，J.G等人在国外著名杂志Journal of Virology上发表了一篇 关于新型肠道病毒发现的文章 （Metagenomic analyses of viruses in stool samples from children with acute flaccid paralysis.J Virol,2009.83(9):p.4642_51)，公开 了一种能够非特异识别和扩增未知病毒基因组的方法，该方法利用随机引物RP能够识别所 有病毒的核苷酸序列的特点，对不明病因的病例标本进行检测，从而对不明疾病的病因进 行诊断，但是利用随机引物RP的未知病毒检测方法的灵敏度普遍偏低，只能检测到至少含 有1〇5个病毒颗粒的临床样本，这就极大地限制了该方法直接在临床诊断中的应用，究其原 因，主要是由于随机引物RP中二聚体的广泛大量存在，大大降低了随机引物RP中有效引物 的浓度。
[0003] 有鉴于此，特提出本发明。

【发明内容】

[0004] 本发明提供一种可以广谱的识别和扩增病毒基因组的引物以及包含该引物的试 剂盒。
[0005] 另一方面，本发明提供该病毒基因组引物和该试剂盒在检测病毒基因组方面的应 用。
[0006] 另一方面，本发明提供一种运用病毒基因组引物检测病毒基因组的方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是:一种病毒基因组引物， 包括如SEQIDN0:1-SEQIDN0:8所示的八条核苷酸序列。 SEQ ID NO: 1 GACCATCTAGCGACCTCCACCTNCTNYT; SEQ ID NO:2 GACCATCTAGCGACCTCCACCTNTTRYT;
[0008] SEQ ID N0:3 GACCATCTAGCGACCTCCACTTRCTNYT; SEQ ID N0:4 GACCATCTAGCGACCTCCACTTRTTRYT; SEQ ID N0:5 GACCATCTAGCGACCTCCACAGYAGYYT; SEQ ID N(3:6 GACCATCTAGCGACCTCCACAGYTCNYT;
[0009] SEQ ID N(3:7 GACCATCTAGCGACCTCCACTCNAGYYT; SEQ ID NO:8 GACCATCTAGCGACCTCCACTCNTCNYT;
[0010] 兼并碱基 N: A/T/C/G; R: A/G; Y: C/T。
[0011] 如上所述的病毒基因组引物在检测病毒基因组方面的应用。
[0012] -种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的病毒基因组引物。
[0013] -种如上所述的试剂盒在检测病毒基因组方面的应用。
[0014] 用如上所述的病毒基因组引物检测病毒基因组的方法，包括如下步骤：
[0015] 1)合成如权利要求1所述的病毒基因组引物；
[0016] 2)对样本前处理和消化；
[0017]用离心机离心5分钟，取上清液用0.22μπι的滤器过滤，将得到的样本采用70U的 DNase I，8U的TURBO DNase和50yg的RNase Α在37°C温度下消化90分钟；
[0018] 3)第一链的合成；
[0019]提取样本中包含的DNA病毒/RNA病毒的核酸成分，溶解到20yL无核酶的去离子水 中，生成核酸提取液;同时将提取到的核酸提取液，用权利要求1所述的病毒基因组引物，对 病毒的RNA基因组进行逆转录，生成DNA第一链；
[0020] 4)第二链的合成和PCR反应；
[0021] 将步骤3)得到的病毒的核酸提取液和第一链溶液，采用如权利要求1所述的病毒 基因组引物扩增得到DNA第二链；
[0022] 将DNA第一链和DNA第二链组成的DNA双链液进行抽提；
[0023] 将抽提后的DNA双链液用SEQ ID N0:9引物进行PCR反应；
[0024] 5)PCR产物的克隆和序列测定；
[0025] 将PCR产物连接到载体上构建克隆库，通过蓝白斑筛选有插入的克隆并进行测序；
[0026] 蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法:是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α- 互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β- 半乳糖苷酶基因（lacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了 一个多克隆位点(MCS)，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨 基端而不影响功能，这种载体适用于可编码半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此， 宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白 质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒 之间实现了互补，称为互补。由互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生 色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位 点后，几乎不可避免地导致无互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白 色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化 菌平板37°C温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
[0027] 6)数据的处理和分析；
[0028]将测序得到的核苷酸序列进行剪切，去除载体部分的序列，并剔除不含有SEQ ID N0:9引物序列的核苷酸序列，与数据库进行比对，找到最匹配的病毒种/株后，综合分析所 有的序列信息，判断该样本中含有的病毒种类。
[0029] 进一步的，所述步骤4)中PCR反应条件如下：1个循环的95°C5min，35个循环的95°C 158〇。，50。(：1586。，721€211^11，1个循环的721€711^11。
[0030]采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果:采用了本发明 所述的病毒基因组的引物，克服了现有技术中采用传统随机引物RP检测灵敏度低、对临床 样本中低浓度的病毒酿别效果差的缺点，通过分析NCBI病毒库中所有参考病毒序列，筛选 出能够广泛识别参考病毒基因组的寡核苷酸序列，并在该序列的基础上建立了一种病毒基 因组检测技术，能够检测到临床样本中浓度更低的病毒基因组序列，既满足广泛识别病毒 基因组的最基本的需要，又达到提高检测病毒基因组的灵敏度的更高目标。
【附图说明】
[0031]图1是本发明病毒基因组引物与随机引物RP灵敏度的比较图。
【具体实施方式】
[0032]以下结合具体实施例和附图对本发明做进一步解释说明。
[0033]本发明是在传统随机引物聚合酶链式反应(rPCR)的基础上，将本发明筛选的病毒 基因组引物(PVGPs)代替rPCR中的随机引物RP，来检测病毒基因组的方法，具体技术方案如 下：
[0034] 1、合成病毒基因组引物
[0035] 本发明涉及共计八组包含兼并碱基的核苷酸引物，每组引物合成量为5~100D(见 下表），根据其合成量用相应体积的TE溶液溶解成1 ΟΟμΜ浓度的引物溶液，根据每组引物包 含的引物条数，计算PVGPs混合液中应该含有每组引物的体积，将这八组引物溶液按照下表 最后一列的体积混合，即本发明的PVGPs。本发明PVGPs中每条引物的浓度是相等的（均为 2.78μΜ)，具体过程如下表1所示：
[0036] 表1病毒基因组引物的合成和配制
[0037]
[0039] 2、样本前处理和消化
[0040]为了尽量去除样本中的细胞成分、细菌成分和较大颗粒物质，需要对样本进行前 处理。用离心机在最高的转速，如13,000转/分钟、离心5分钟，取上清液用0.22μπι的滤器 (Millipore)过滤。
[0041 ] 为了将破碎细胞和细菌基因组的DNA和RNA去除，需要对样本进行DNase/RNase鸡 尾酒消化处理。米用70U的DNase I (Takara)，8U的TURBO DNase (Invi trogen)和50yg的 RNase A(Takara)在37°C温度下消化90分钟。
[0042] 3、病毒的核酸提取及RNA病毒的逆转录
[0043] 将消化后的样本按照PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit(Invitrogen，病毒DNA/ RNA纯化试剂盒)的产品说明书操作，提取样本中包含的DNA病毒/RNA病毒的核酸成分，并最 终溶解到20yL无核酶的去离子水中，生成核酸提取液。
[0044] 若要检测样本中的RNA病毒，需要按照Superscript III RT kit(Invitrogen)的 产品说明书，采用本发明的PVGPs对病毒的RNA基因组进行逆转录，生成cDNA链(第一链），然 后用E.coli RNase H(Invitrogen)与cDNA链在37°C作用20分钟，去除其中的RNA链，生成 cDNA 液。
[0045] 4、第二链的合成和聚合酶链式反应(PCR)
[0046] 采用病毒的核酸提取液和cDNA溶液，使用Klenow fragment(Invitrogen)试剂，采 用本发明的PVGPs合成DNA第二链。所生成的DNA双链采用酚氯仿溶液进行抽提，重悬到20yL 无核酶的去离子水中，生成DNA双链液。
[0047] PCR反应需要按照AmpliTaq Gold(Invitrogen)的产品说明书，采用SEQ ID N0:9 引物对DNA双链液进行扩增，反应条件如下：1个循环的95°C5min，35个循环的95°C 15sec，50 。(：158〇。，721€211^11，1个循环的721€711^11。
[0048] 所述的SEQ ID 从):9引物为6厶0^1'0^6〇6厶0^0^(：。
[0049] 5、PCR产物的克隆和序列测定
[0050] PCR产物按照Pu丨·eLink'SQuick Gel Extraction Kit(Invitrogen)的说明书，切 胶回收l〇〇bp~1000bp之间的片段；按照ΤΟΡΟ1?ΤΑ cloning vector(Invitrogen)的说明 书，将PCR产物连接到载体中构建克隆库。转化感受态细菌DH5abacterial cells(Takara)， 通过蓝白斑筛选有插入的克隆进行测序。
[0051] 6、数据的处理和分析
[0052]将测序得到的核苷酸序列进行剪切，去除载体部分的序列，并剔除不含有SEQ ID NO: 9序列的核苷酸序列，采用BLAST程序(http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/Blast.cgi)与 美国国立生物技术信息中心(NCBI)的nr/nt数据库进行比对，找到最匹配的病毒种/株，然 后综合分析所有的序列信息，判断该样本中含有的病毒种类。
[0053]对本发明病毒基因组引物PVGPs和随机引物RP采用上述方法，对不同浓度模式病 毒，以脊髓灰质炎病毒(human poliovirus)疫苗株为例，分别进行检测，结果发现，如图1所 示，在高浓度病毒组（1 X 106PFU/100yL和1 X 105PFU/100yL)，两种引物对脊髓灰质炎病毒的 识别能力上不存在显著差异（P分别为0.172和0.674，α = 〇.〇5);在低浓度病毒组IX 104PFU/100yL时，本发明病毒基因组引物PVGPs在随机挑选的50个克隆中脊灰病毒的识别 率为58 %，比传统的随机引物RP的识别率8 %有显著提高（X2 = 26.046，p = 0.000，α = 0.05);在最低浓度病毒组1 X 103PFU/100yL时，本发明引物PVGPs仍然能够检测到12%的脊 灰病毒基因组，而RP根本检测不到。以上结果说明依赖本发明病毒基因组引物PVGPs比依赖 随机引物RP具备更高的灵敏度。
[0054]为了能够反映本发明在所有的参考病毒基因组上的扩增效果，本发明还在现有的 参考病毒基因组序列上进行模拟扩增，即以每条病毒基因组为模板，用本发明的PVGPs进行 正反向的识别，根据病毒基因组与PVGPs结合结果、将每条可能扩增的片段按照不同的片段 长度（1 ~99bp、100 ~399bp、400 ~699bp、700 ~999bp、1000~1299bp、1300 ~1599bp、1600 ~1899bp、1900~2199bp和2 2200bp)进行统计，其中所述的病毒基因组为4244个，按照不 同的病毒类型分为六类，六类病毒类型如下:double_strand DNAWsDNAhirusesjingle- strand DNA(ssDNA)viruses , double-strand RNA(dsRNA)viruses , single-strand positive RNA(ssRNA( + ))virus , single-strand negative RNA(ssRNA(-))virus and retrovirus (RT) virus。模拟扩增的结果显示，几乎所有的病毒基因组都能够被PVGPs识别 扩增，除了以下5个病毒的基因组，如ssDNA病毒中的Mulard duck circovirus(accession: NC_005053，来源于鸭子，长 2kb)，Circovirus-l ike genome SAR_A( access ion: NC_013030， 来源于马尾藻海，长 1.74kb)，Acartia tonsa copepod circovirus isolate 154_D11 (accession: NC_020099，来源于海洋烧足类，长1 · 67kb)，dsRNA病毒中的Gremmeni el la abietina RNA virus MS2(accession:NC_006444，NC_006445和NC_006446,来源于针叶林， 长1.19kb~1.78kb)和ssRNA( + )病毒中的Saccharomyces 23S RNA narnavirus(GI: 21557568,来源于酵母，长2.89kb)。可见PVGPs能够识别并扩增已知几乎全部的病毒基因组 包括来自各种动物、植物、细菌及真菌等物种的病毒。
[0055]本发明的病毒基因组引物(PVGPs)比传统的随机引物RP能够更灵敏地检测到样本 中少量的病毒核酸序列，这一发明使病毒基因组引物检测技术在临床传染病例的病原诊断 尤其是未知病原的诊断上能够得以广泛应用。
[0056]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种病毒基因组引物，其特征在于，包括如SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:8所示的八条核 苷酸序列。2. 权利要求1所述的病毒基因组引物在检测病毒基因组方面的应用。3. -种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的病毒基因组引物。4. 权利要求3所述的试剂盒在检测病毒基因组方面的应用。5. 用权利要求1所述的病毒基因组引物检测病毒基因组的方法，其特征在于，包括如下 步骤： 1) 合成如权利要求1所述的病毒基因组引物； 2) 对样本前处理和消化； 用离心机离心5分钟，取上清液用0.22μπι的滤器过滤，将得到的样本采用70U的DNase I，8U的TURBO DNase和50yg的RNase A在37°C温度下消化90分钟； 3) 第一链的合成； 提取样本中包含的DNA病毒/RNA病毒的核酸成分，溶解到20yL无核酶的去离子水中，生 成核酸提取液；同时将提取到的核酸提取液，用权利要求1所述的病毒基因组引物，对病毒 的RNA基因组进行逆转录，生成DNA第一链； 4) 第二链的合成和PCR反应； 将步骤3)得到的病毒的核酸提取液和第一链溶液，采用如权利要求1所述的病毒基因 组引物扩增得到DNA第二链； 将DNA第一链和DNA第二链组成的DNA双链液进行抽提； 将抽提后的DNA双链液用SEQ ID N0:9引物进行PCR反应； 5 )PCR产物的克隆和序列测定； 将PCR产物构建克隆库，筛选有插入的克隆并进行测序； 6)数据的处理和分析； 将测序得到的核苷酸序列进行剪切，去除载体部分的序列，并剔除不含有SEQ ID N0:9 引物序列的核苷酸序列，与数据库进行比对，找到最匹配的病毒种/株后，判断该样本中含 有的病毒种类。6. 如权利要求5所述的检测病毒基因组的方法，其特征在于，所述步骤4)中PCR反应条 件如下：1 个循环的 95°C5min，35 个循环的 95°(：1586(3,50°(：1586(3,721€2111丨11，1个循环的721€ 7min〇
【文档编号】C12N15/11GK105838827SQ201610347518
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】李仁清, 黄芳, 吴疆, 庞星火, 贺雄, 邓瑛, 马彦, 刘秀颖, 龚成, 陈萌, 邹清华
【申请人】北京市疾病预防控制中心