具有增强的l-赖氨酸生产能力的棒杆菌属物种的微生物及使用其生产l-赖氨酸的方法
【专利摘要】提供了棒杆菌属物种的微生物以及通过使用该微生物生产L?赖氨酸的方法，所述微生物经修饰而过表达谷氨酸棒杆菌的NCg10862基因，从而具有增强的L?赖氨酸生产能力。KCCM11347P19911210KCCM11430P20130612
【专利说明】具有増强的L-赖氨酸生产能力的棒杆菌属物种的微生物及使 用其生产L-赖氨酸的方法 发明领域
[0001] 本发明设及具有增强的レ赖氨酸生产能力的属于棒杆菌属的微生物及通过使用 该微生物生产心赖氨酸的方法。
[0002] 发明背景
[0003] k赖氨酸是一类必需氨基酸，并且在饲料、医学和食物领域中使用。k赖氨酸主要 通过使用诸如大肠杆菌巧scherichia coli)或棒杆菌属(Corynebacterium)等微生物直接 发酵生产，并且在运点上，通过具有改善的产率的生产菌株的开发或者发酵工艺的改善来 改善k赖氨酸生产能力可W导致相当大的经济效果。
[0004] 就改善赖氨酸的生产效率的方法而言，已经使用扩增参与赖氨酸的生物合成途径 的基因或修饰基因的启动子W提高参与赖氨酸生物合成途径的酶的活性的方法。另外，已 经不断进行对除了参与赖氨酸的生物合成途径的基因外的基因的研究W提高赖氨酸的生 产能力。
[0005] 本发明的发明人试图制备并探索谷氨酸棒状菌（Corynebacterium glutamicum) 的野生型DNA文库W筛选与赖氨酸的生产能力相关的性状。因此，通过增强的NCgl0862基因 表达，确认赖氨酸得到有效生产，从而完成本发明。直到现在，尚未报告属于棒杆菌属的微 生物通过对其额外导入棒杆菌属衍生的NCgl0862基因而能够生成心赖氨酸的研究。
[0006] 发明详述
[0007] 技术问题
[000引本发明提供了属于棒杆菌属的微生物，其中编码SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的多 核巧酸的表达是增强的。
[0009]本发明提供了通过使用微生物生产心赖氨酸的方法。
[0010]技术方案
[0011] 本发明的一个方面提供了属于棒杆菌属的微生物，其中编码SEQ ID NO: 1的氨基 酸序列的多核巧酸的表达是增强的。
[0012] 所述多核巧酸可W编码与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有约70%或更高、约75% 或更高、约80%或更高、约85%或更高、约90%或更高、约92%或更高、约95%或更高、约 97%或更高、约98%或更高、或约99%或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用 的，术语"同源性"指两种多核巧酸或两种多肤模块之间的百分比同一性。可W通过使用本 领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可W通过BLAST算 法测定此类序列同源性，如文献[参考Karl in和Altschul ,Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90， 5873(在1993中发表）]中或者由化arson的FASTA算法[参考Methods Enzymol. ,183,63(在 1990中发表）]披露的。基于化AST算法，还开发出称作化ASTN或BLASTX的程序[参考 www.ncbi.nlm.nih.gov]。
[0013] 可W如下增强多核巧酸的表达，即通过取代或突变对表达调节序列的修饰、对多 核巧酸序列引入的突变、起始密码子的变化、通过经由染色体插入或载体导入的多核巧酸 拷贝数的增加、或其组合。
[0014] 可W修饰多核巧酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核巧 酸的表达，并且例如可W包括启动子、终止子、增强子、沉默子、和化ine-化Igarno序列。多 核巧酸可W具有起始密码子的变化。可W用ATG替代由TTG或GTG组成的起始密码子，从而可 W提高相应基因的酶促活性。可W将多核巧酸渗入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。 在本文，特定的位点可W包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可W将多核巧酸渗入表 达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
[0015] 例如，多核巧酸可W包含SEQ ID N0:2的核巧酸序列。
[0016] 如本文中使用的，术语"可操作连接"指调节序列和多核巧酸序列之间的功能性连 接，由此调节序列控制多核巧酸序列的转录和/或翻译。调节序列可W是能提高多核巧酸的 表达水平的强启动子。调节序列可W是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可W是源 自其它微生物的启动子。例如，启动子可W是trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、 Iac启动子、trp启动子、araBAD启动子或C j7启动子。可W修饰调节序列，使得例如参与赖氨 酸的生物合成途径的主要基因的启动子序列在属于棒杆菌属的微生物中展现出更为增强 的启动子活性。例如，调节序列可W是IysCPl启动子。如本文中使用的，术语"IysCPl启动 子"指通过提高编码天冬氨酸激酶基因的基因表达水平，酶促活性经改善而大于野生型的 酶促活性的约5倍的强启动子，其中通过取代各自编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醒脱氨 酶的基因的启动子位点处的序列提高表达水平(韩国专利No. 10-0930203)。
[0017] 如本文中使用的，术语"载体"指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合 适的宿主细胞中表达祀基因的多核巧酸构建体。或者，载体又可W指多核巧酸构建体，其含 有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可W改变宿主细胞的基因组 中的内源基因的调节序列，或者可W将可W表达的祀基因插入宿主的基因组的特定位点 中。在运点上，本发明中使用的载体可W进一步包含选择标志物W确定载体对宿主细胞的 导入或者载体对宿主细胞的染色体的插入。选择标志物可W包含赋予可选择表型，诸如药 物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂 处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可W存活或者显示不同表型性状，可W选择 经转化的细胞。
[0018] 例如，本发明中使用的载体可W是能在大肠杆菌和棒状型（Coryne-type)细菌中 W两个方向自身复制的载体祀CCG122(韩国专利No. 10-0057684)，或用于转化宿主细胞W 容许将编码祀蛋白的基因插入宿主细胞的染色体中的载体pDZ，其中载体pDZ在谷氨酸棒杆 菌中不能复制（韩国专利No. 10-0924065)。另外，本文中使用的载体可W是例如源自载体 pDZ并且可用于将基因插入谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株的染色体上的转座子位点中的载 体pDZTn(韩国专利No. 10-1126041)，但是载体不限于此。
[0019] 如本文中使用的，术语"转化"指将多核巧酸导入宿主细胞中，从而多核巧酸可W 作为基因组外元件或者W插入宿主细胞的基因组中能复制。转化本发明中使用的载体的方 法可W包括将核酸导入细胞的方法。另外，如相关技术中公开的，可W根据宿主细胞实施电 脉冲方法。
[0020] 例如，属于棒杆菌属的微生物可W是谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌 (Corynebacterium efficiens)、白喉棒杆菌（Corynebacterium diphtheriae)、或产氨棒 杆菌（Corynebacterium ammoniagenes)。
[0021] 属于棒杆菌属的微生物可W具有心赖氨酸生产能力。微生物可W通过将上文描述 的多核巧酸导入属于棒杆菌属并且具有k赖氨酸生产能力的微生物中而具有改善的心赖 氨酸生产能力。
[0022] 如本文中使用的，术语"具有心赖氨酸生产能力"指当在培养基中培养微生物时具 有在其中生成并分泌k赖氨酸的能力。与野生型或亲本菌株相比，微生物可W能够W更大 的量在培养基中生成并积累心赖氨酸。
[0023] 属于棒杆菌属并且具有心赖氨酸生产能力的微生物可W具有与NADPH生成相关的 基因和/或与k赖氨酸生物合成或分泌相关的基因的增强或降低的表达，或者可W使基因 被外来基因取代。与NADPH生成相关的基因可W包括例如编码葡萄糖脱氨酶的基因、编码葡 糖酸激酶的基因、编码甘油醒-3-憐酸脱氨酶的基因、编码葡萄糖-6-憐酸脱氨酶的基因、或 编码6-憐酸葡糖酸脱氨酶的基因。与心赖氨酸生物合成相关的基因可W包括例如编码天冬 氨酸氨基转移酶的基因、编码天冬氨酸激酶的基因、编码天冬氨酸半醒脱氨酶的基因、编码 二氨化晚二簇酸合酶(dehy化odipicolinate synthase)的基因、编码二氨化晚二簇酸还原 酶（dehydrodipiCOIinate reductase)的基因、编码间-二氨基庚二酸脱氨酶（meso-diaminopimelate dehy化Ogenase)的基因、或编码二氨基庚二酸脱簇酶的基因。与k赖氨 酸分泌相关的基因可W包括lysE，其是赖氨酸输出载体基因。属于棒杆菌属并且具有心赖 氨酸生产能力的微生物也可W通过使用木糖作为碳源而获得此类k赖氨酸生产能力。
[0024] 在一个实施方案中，属于棒杆菌属的微生物可W是谷氨酸棒杆菌KCCM11016P 化 FCC10881K 韩国专利No. 10-0159812)。
[0025] 在另一个实施方案中，可W对属于棒杆菌属的微生物导入编码天冬氨酸氨基转移 酶的多核巧酸、编码天冬氨酸激酶的多核巧酸、编码天冬氨酸半醒脱氨酶的多核巧酸、编码 二氨化晚二簇酸合酶的多核巧酸、编码二氨化晚二簇酸还原酶的多核巧酸、和编码二氨基 庚二酸脱簇酶的多核巧酸。例如，属于棒杆菌属的微生物可W是谷氨酸棒杆菌KCCM10770P (韩国专利No. 10-0924065)。
[0026] 在另一个实施方案中，属于棒杆菌属的微生物可W是谷氨酸棒杆菌KCCMl 1347P 化FCC10750)。
[0027] 在另一个实施方案中，属于棒杆菌属的微生物可W通过导入编码丙酬酸簇化酶 (pyc)的多核巧酸的突变体、编码高丝氨酸脱氨酶化om)的多核巧酸的突变体、和编码天冬 氨酸激酶（IysC)的多核巧酸的突变体而获得赖氨酸生产能力（Binder et al ,Genome Biology，2012，13: R40)。微生物可W是例如谷氨酸棒杆菌CJ3P。
[0028] 本发明的另一个方面提供了生产k赖氨酸的方法，该方法包括培养微生物;并且 从培养物中获得心赖氨酸。
[00巧]微生物与上文的描述相同。
[0030] 可W在本领域中已知的培养条件下在合适的培养基中进行微生物的培养。可W根 据要选择的微生物容易地调节此类培养方法。培养方法可W包括选自下组的一个或多个： 分批培养、连续培养和补料-分批培养。
[0031] 培养中使用的培养基可W满足特定微生物的要求。培养基可W选自下组:碳源、氮 源、微量元素、及其组合。
[0032] 碳源可W选自下组:碳水化合物、脂质、脂肪酸、醇、有机酸及其组合。碳水化合物 可W是葡萄糖、薦糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素或其组合。脂质可W是大豆油、向日 葵油、藍麻油、挪子油或其组合。脂肪酸可W是栋桐酸、硬脂酸、亚油酸或其组合。醇可W是 甘油或乙醇。有机酸可W是乙酸。
[0033] 氮源可W包括有机氮源、无机氮源、或其组合。有机氮源可W选自下组:腺、酵母提 取物、肉膏、麦芽抽提物、玉米浸溃液korn Ste邱liquid,C化）、大豆粉(soybean meal)及 其组合。无机氮源可W选自下组:尿素、硫酸锭、氯化锭、憐酸锭、碳酸锭、硝酸锭及其组合。
[0034] 培养基可W包含选自下组的一种:憐、金属盐、氨基酸、维生素、前体及其组合。憐 源可W包括憐酸二氨钟、憐酸氨二钟(dipotassium phosphate)、其相应的含钢盐。金属盐 可W是硫酸儀和硫酸亚铁（iron suKate)。
[0035] 可W将培养基或其个别组分W分批模式、连续模式、或补料-分批模式添加到培养 基。
[0036] 在培养方法中，可W调节培养物的pH。可W通过对培养物添加氨氧化锭、氨氧化 钟、氨水(ammonia)、憐酸或硫酸实施P的周节。此外，培养方法可W包括防止气泡产生。可W 通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。消泡剂可W包括脂肪酸聚乙二醇醋（fatty acid polyglycol ester)。此外，培养方法可W包括将气体注射入培养物中。气体可W包括能够 维持培养物的需氧条件的任何气体。气体可W是氧气或含氧气体。含氧气体可W包括空气。 在培养中，培养物的溫度可W是20至45°C，例如22至42°C或25至40°C。可W继续培养，直到 k赖氨酸的生产达到期望的水平。
[0037] 例如，可W如下从培养物回收生成的レ赖氨酸，即用硫酸或氨氯酸处理培养物， 接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。
[0038] 本发明的有利效果
[0039] 可W通过使用根据本发明的一个方面的微生物提高k赖氨酸的生产能力。
[0040] 可W通过使用根据本发明的另一个方面的生产レ赖氨酸的方法提高心赖氨酸的 生产能力。 实施例
[0041] 在下文中，本申请会参考实施例更为详细地描述。然而，运些实施例仅仅用于例示 目的，并且本申请的范围并不意图受限于运些实施例。
[00创实施例1:制备野生型谷氨酸棒杆菌基因组DNA文库
[0043] 制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株的基因组DNA，然后用限制酶Sau3AI处理，从而 获得6至Skb的部分片段。连接片段与穿梭载体祀CCG122W转化大肠杆菌和棒杆菌，该穿梭 载体包含用于限制酶BamHI的末端。然后，用所得的载体转化大肠杆菌DH5a，并且在含有卡 那霉素（25mg/L)的LB固体培养基上涂布。通过PCR(使用SEQ ID NO: 3和4的引物)选择用插 入有片段的载体转化的菌落，并且进行混合培养，并且通过一般已知的质粒提取方法自其 获得质粒。
[0044] 沈Q ID N0:3:TCAGGGTGTAGCGGTTCGGTTTAT。
[0045] 沈Q ID N0:4:CCGCGCGTAATACGACTCACTATA。
[OOW 实施例2:导入文库和选择具有改善的赖氨酸生产能力的菌株
[0047]使用电脉冲方法用实施例1中制备的重组载体转化谷氨酸棒杆菌KCCMl 1016P菌株 (其生成赖氨酸），然后在下文描述的复合培养基板上涂布。
[004引 <复合培养基板〉
[00例 20g葡萄糖、50g(NH4)2S04、10g腺、5g酵母提取物、1.5g尿素、5排出P04、10g拉册04、 0.5g MgS04 ? 7出0、IOOiig生物素、1，OOOiig硫胺素（thiamine)肥1、2，OOOiig泛酸巧、2，OOOiig 烟酷胺、20g琼脂和25mg卡那霉素(基于IL蒸馈水）。
[0050]将约2，000个菌落接种入含有200UL下文描述的复合液体培养基的96深孔板（由 Bioneer Company制造）的每孔中，然后通过W20化pm和30°C摇动培养24小时。根据赖氨酸 氧化酶法，将50ul每种培养物添加至96孔板，其上分布含有赖氨酸氧化酶的反应混合物(含 有200ul憐酸钟(pH 7.5)、0.04ul赖氨酸氧化酶(0.1个单位All)、0.04ul过氧化物酶(1个单 位All)和0.4mg ABTS)。在反应30分钟后，测量0D4Q5nm的吸光度，并且比较颜色形成的程度。 在它们之中，选择7类实验组，各组具有高于对照组化CCM11016P/PECCG122)的吸光度。 [0化 1] <复合液体培养基〉
[0化2] 20g葡萄糖、IOg腺、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g K此P〇4、8g K2HP〇4、0.5g MgS〇4 ? 7出OaOOiig生物素、1，000蛇硫胺素肥1、2,000蛇泛酸巧和2,000蛇烟酷胺(基于比蒸馈水）。 [0053]将个体菌株接种入含有25ml下文描述的种子培养基的250mlS角振荡烧瓶 (corner-baffled flask)中，然后通过W200rpm和30 °C摇动培养20小时。然后，将Iml种子 培养物接种入含有24ml下文描述的生产培养基的250mlS角振荡烧瓶中，然后通过W 2(K)rpm和37 °C摇动培养96小时。在完成培养后，通过HPLC分析k赖氨酸浓度，并且表1中显 示了分析结果。
[0化4] <种子培养基(pH 7.0)〉
[0055] 20g葡萄糖、10g(NH4)2S〇4、10g腺、5g酵母提取物、1.5g尿素、4排出P〇4、8g K2HPO4、 0.5g MgS〇4 ? 7此OaOOiig生物素、l，000yg硫胺素肥l、2,000iig泛酸巧和2,000yg烟酷胺（基 于IL蒸馈水）。
[0化6] <生产培养基(pH 7.0)〉
[0057] 100g葡萄糖、40g(NH4)2S04、2.5g大豆蛋白、5g玉米浸溃固体、3g尿素、lgK此P04、 0.5g MgS〇4 ? 7此0、IOOiig生物素、1，OOOiig硫胺素 HCl、2,OOOiig泛酸巧、3,OOOiig烟酷胺、和 30g CaC〇3(基于IL蒸馈水）。
[0化引[表1] fnoAol LUUU.」 巧」义口'J把口术？人山]半一;v六女吐/I?口 LL业勺、> 百入!口'J不乂券、巧义工/ 日巴yj 口'JALLiVi丄丄U丄ur/ M2和KCCMl 1016P/L52，然后自其提取质粒，接着使用SEQ ID NO: 3和4的引物进行测序分析。 源自KCCMl 1016P/M2的质粒命名为祀C-Ll，并且源自KCCMl 1016P/L52的质粒命名为祀C-L2。 pEC-Ll质粒包含NCgl0857基因的可读框(ORF)起始密码子上游的约200个碱基对(bp)至 NCgl0862基因的ORF终止密码子下游的约200bp。祀C-L2质粒包含NCgl0861基因的ORF终止 密码子下游的约25化P至NCgl0865基因的ORF起始密码子上游的约3(K)bp。因而，确认了两类 质粒都共同包含NCgl0862基因。
[00创实施例3:制备载体^替换NCgl0862基因的启动子
[0063] 基于实施例2中获得的结果，为了确认NCgl0862基因的过表达是否实际上诱导赖 氨酸生产能力的改善，制备配置为替换染色体上的NCgl0862基因的启动子的载体。对于启 动子的替换，使用野生型启动子(IysCP)和经修饰的启动子IysCPl作为IysC基因的启动子。
[0064] 如下提供了详细描述。
[00化]基于国立卫生研究所化tional Institutes of HealtMNIH GenBank,US)的 GenBank,设计引物对（SEQ ID N0:5和6或沈Q ID No:7和8)，其配置为分别扩增NCgl0862基 因 （SEQ ID N0:2)的ORF起始密码子的上游和下游。另外，设计引物对(SEQ ID N0:9和10的 引物似从IysC基因上游的序列扩增启动子位点。下文显示了引物的SEQ ID No.和序列。有 下划线的序列标示由限制酶识别的位点。
[0066] 沈Q ID NO:5是GTGAATTCCGCCCGTATGGTGATT；
[0067] 沈Q ID NO:6:TAGGATCCAGAAGGCGCTGGCTT
[006引 SEQ ID NO:7:AGGGATCCTAACATATGGAAGCCGAAGCACCT
[0069] 沈Q ID NO:8:AGGTCGACTCATTCGTTCATAATT
[0070] 沈Q ID NO:9:TAGGATCCTAGGGAGCCATCTTTTGGGG
[0071] 沈Q ID NO:10:TAACATATGTGTGCACCTTTCGATCTACGo
[0072] 通过使用谷氨酸棒杆菌KCCMl 1016P菌株的基因组DNA作为模板和SEQ ID NO:5和6 及沈Q ID N0:7和8，W及SEQ ID N0:9和10的引物对进行PCR，从而获得各自具有NCgl0862 基因的ORF起始密码子的左和右侧翼序列的30化P DNA片段和IysC片段的野生型启动子的 片段。用于PCR扩增的条件包括于94 °C变性5分钟，于94 °C变性30秒，于56 °C退火30秒，和于 72 °C聚合30秒的30个循环，然后于72 °C聚合7分钟。分别用EcoRI和BamHI，和BamHI和Sal I处 理具有NCgl0862基因的ORF起始密码子的左或右侧翼序列的通过PCR扩增的每种300bp产 物，然后连接到通过用限制酶Sail和EcoRI处理用于对属于棒杆菌属的微生物的染色体插 入的载体pDZ获得的DNA片段，从而获得载体。
[0073] 为了扩增IysCP启动子或IysCPl启动子，通过使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株 或1(〇1111016口-173〔口1菌株(韩国专利齡.10-0930203)的基因组0魁作为模板和沈9 10^: 9和10的引物对实施PCR，从而获得IysCP启动子和IysCPl启动子的SOObp片段。用Ba恤I和 NdeI处理IysC野生型启动子和IysCPl启动子的DNA片段。然后，连接上文获得的载体与通过 用BamH巧日NdeI处理获得的DNA片段，从而制备重组质粒pDZ-lysCP_N0862和pDZ-lysCPl_ N0862〇
[0074] 实施例4:分析具有替换的NCgl0862衍生赖氨酸生产菌株的启动子的菌株的赖氨 酸生产能力
[00"75]根据电脉冲方法（Van der Rest et al. ,Appl Microbiol Biotechnol 52: 541-545，1999)，将实施例3中制备的重组质粒9〇2-173〔?_娜862和9〇2-173〔？1_娜862转化入谷 氨酸棒杆菌1(01111016?中。根据一般已知的染色体同源重组，通过?0?(56〇10^):5和8的 引物)选择IysC启动子插入NCgl0862基因的启动子位点中的菌株。选择的重组菌株命名为 谷氨酸棒杆菌KCCM11016P: :lysCP_N0862和KCCM11016P: :lysCPl_N0862。
[0076] 为了鉴定此类制备的赖氨酸生产菌株KCCM11016P: :lysCP_N0862和KCCM11016P:: lysCPl_N0862的赖氨酸生产能力，W与实施例2中相同的方式对菌株进行种子培养和生产 培养，然后，如下文显示(参见表2)分析每种培养物的赖氨酸浓度。
[0077] [表 2]
[007引
[0080] 如表2中显示的，确认了与亲本菌株KCCM11016P相比，用IysC野生型启动子替换启 动子的KCCM11016P::lysCP_N0862菌株的赖氨酸生产能力平均增加 1%，并且与亲本菌株相 比，用IysCPl启动子替换启动子的KCCM11016P: :lysCPl_N0862菌株的赖氨酸生产能力平均 增加 4%。此后，1(〇1111016?::173〔？1_舰862菌株命名为〔401-2269，并且在2013年6月12日 W登录号KCCM11430P保藏于韩国微生物培养物保藏中屯、化orean Culture Center of Microorganisms，KCCM)。
[0081 ] 实施例5:制备用于对NCgl0862基因的额外染色体插入的载体
[0082]为了容许将期望的基因插入转座子基因的位置中，使用自pDZ载体设计的pDZTN载 体作为基础载体，从而设计并制备配置为另外将实施例2的NCgl0862基因插入染色体中的 载体。
[008；3] 基于报告的序列，合成引物(SEQ ID N0:7和12似扩增NCgl0862基因的位点。通过 使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体作为模板进行PCR，从而扩增NCgl0862基因的约 370bp ORF位点。
[0084]另外，合成引物（SEQ ID NO: 10和11) W扩增IysC基因的启动子的位点。通过使用 谷氨酸棒杆菌KCCM11016P-lysCPl导入菌株的染色体作为模板实施PCR，从而扩增约300bp 启动子位点。在本文，用于PCR扩增的条件包括于94°C变性5分钟，于94°C变性30秒，于56°C 退火30秒，和于72°C聚合30秒的30个循环，然后于72°C聚合7分钟。
[0085] 沈Q ID N0:11:TAACTAGTTAGGGAGCCATCTTTTGGGG
[0086] 用限制酶Spe巧日NdeI处理通过PCR扩增的基因片段，从而获得其DNA片段。连接DNA 片段与具有限制酶SpeI末端的用于染色体插入的载体pDZTN。然后，用所得的载体转化大肠 杆菌0册〇，并且在含有25111旨/1卡那霉素的1^8固体培养基上涂布。通过?0?(569 10腸：12和 13的引物)选择用包含其中插入的期望基因的载体转化的菌落，并且通过进行一般已知的 质粒提取方法获得质粒，然后命名为PDZTN-N0862。
[0087] 沈Q ID N0:12:TAACTAGTATGCTCGGTCCGGGCA
[0088] 沈Q ID N0:13:GCAGGCGGTGAGCTTGTCAC。
[00例实施例6:分析包含染色体上额外插入的NCgl0862的菌株的赖氨酸生产能力
[0090] 基于染色体同源重组，使用实施例5中制备的载体PDZTN-N0862转化k赖氨酸生产 菌株谷氨酸棒杆菌KCCMl 1016P。此后，通过PCR(使用SEQ ID NO: 12和13的引物）自其选择性 筛选菌落，并且所得的菌株命名为KCCM11016P::N0862-化。W与实施例2中相同的方式各自 培养KCCM11016P: :N0862-化和对照组，然后如下文所示（参见表3)分析培养物中的心赖氨 酸的浓度。
[0091] [表 3]
[00921
[0093] 因此，确认与亲本菌株KCCM11016P相比，KCCM11016P: :N0862-Tn(其是具有染色体 上额外插入的NCgl0862基因的菌株)的赖氨酸生产能力增加 8 %。
[0094] 实施例7:使用包含染色体上额外插入的NCgl0862的KCCM10770P衍生微生物生产 k赖氨酸
[00M]使用实施例5中制备的载体PDZTN-N0862来转化谷氨酸棒杆菌KCCM10770P，其是赖 氨酸生产菌株，其中对其染色体额外添加7类参与k赖氨酸生物合成途径的基因。此后，通 过PCR选择在染色体上额外插入NCgl0862基因的菌株，并且所得的菌株命名为谷氨酸棒杆 菌KCCM10770P: :N0862-化。W与实施例2中相同的方式培养菌株，然后如下文所示(参见表 4)分析培养物中的心赖氨酸的浓度。
[0096][表 4]
[0097]
[i
[0099]因此，确认与亲本菌株相比，赖氨酸生产能力增加5%。
[0…0] 实施例8:使用包含染色体上额外插入的NCgl0862的CJ3P衍生微生物生产心赖氨 壁
[0101] 为了鉴定属于谷氨酸棒杆菌的其它菌株中的效果，使用实施例5中制备的载体 PDZTN-N0862转化谷氨酸棒杆菌CJ3P，其是具有与心赖氨酸生产能力的改善有关的3类基因 突变的赖氨酸生产菌株。此后，通过PCR选择染色体上额外插入NCgl0862基因的菌株，并且 所得的菌株命名为CJ3P::N0862-化。W与实施例2中相同的方式培养菌株，然后如下文所示 (参见表5)分析培养物中的心赖氨酸的浓度。
[0102] [表 5]
[01031
[UIU4」 凶斗、四17FT 口 Lb ,术乂受文工J日巳/J丄目/JM丄乙0
[0…引 实施例9:使用包含染色体上额外插入的NCgl0862的KCCM11347P衍生微生物生产 k赖氨酸
[0106] 为了鉴定属于谷氨酸棒杆菌的其它菌株中的效果，W与实施例5中相同的方式将 载体PDZTN-N0862导入レ赖氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM1U47P(韩国专利No.l994-0001307)，并且所得的菌株命名为KCCMl 1347P: : N0862-化。W与实施例2中相同的方式培养 菌株，然后如下文所示(参见表6)分析培养物中的心赖氨酸的浓度。
[0107] [表 6]
[010 引
[0109」因此，确认与亲本菌株相比，赖氨酸生产能力增加6%。
[0110]保臧机构名称:韩国微生物抬养物保臧中屯、（国际）
[0111] 保藏号:KCCMl 1347P
[0112] 保藏日期:19911210
[0113] 与保藏的微生物或其它生物材料相关的说明
[0114] (PCT 第 13 条之二）
[0115]
[0116] 表 PCT/R0/134( 1998年7 月，2004年 I 月重印）
[0117] 保藏机构名称:韩国微生物培养物保藏中屯、（国际）
[0118] 保藏号:KCCM11430P
[0119] 保藏日期:20130612
[0120] 与保藏的微生物或其它生物材料相关的说明
[0121] (PCT 第 13 条之二） rni99i
[0123]表 PCT/R0/134( 1998年7 月，2004年 I 月重印）
【主权项】
1. 一种生成L-赖氨酸的属于棒杆菌属（Corynebacterium)的微生物，其具有编码SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。2. 权利要求1的微生物，其中所述改善的表达通过基因拷贝数的增加、表达调节序列的 操纵、或其组合诱导。3. 权利要求1的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)〇4. 一种生产L-赖氨酸的方法，所述方法包括： 培养权利要求1的微生物;并 从所述培养物中回收L-赖氨酸。
【文档编号】C12P13/08GK105849249SQ201480059300
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年9月25日
【发明人】朴相喜, 文准玉, 裵贤原, 李光镐
【申请人】Cj第制糖株式会社, Cj第一制糖株式会社