用于使生物质水解的酶组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于使生物质水解的酶组合物，其包括至少一种纤维素酶、至少一种半纤维素酶和/或至少一种果胶酶。在又一方面，本发明涉及实施该酶组合物用于使生物质水解的方法，以及该酶组合物用于使生物质水解的用途。
【专利说明】
用于使生物质水解的酶组合物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于使生物质水解的酶组合物，其包括至少一种纤维素酶、至少 一种半纤维素酶和至少一种果胶酶。在又一方面，本发明涉及实施该酶组合物用于使生物 质水解的方法，以及该酶组合物用于使生物质水解的用途。
【背景技术】
[0002] 源自例如甜菜、玉米、稻草和其他含糖或含多糖及含果胶的材料的来源的生物质 对于精制糖例如单糖或二糖是有价值的来源。
[0003] 在本领域中，已经采用了各种方法从所述生物质分离或提取这些化合物。通常，这 些方法允许从生物质材料例如甜菜中简单分离或提取单糖和二糖，然而，大部分含糖化合 物例如纤维素、半纤维素、木质素和/或果胶常常被丢弃。
[0004] 在良好确立的方法中，通过在连续对流方法中用热水对碎甜菜进行提取，从例如 甜菜移除单糖和二糖。通常，这些方法需要添加另外的试剂例如含量为大约1~3kg CaO/ 100kg甜菜的CaO。该方法的产物是被称为原汁的糖溶液和所谓的甜菜柏，后者在浆柏干燥 器中干燥。原汁经过多级净化和过滤以去除杂质和非糖物质，以产生浓汁(65-70 %的干物 质含量），或者在结晶后，产生经精炼的精制糖。在该方法期间升高的温度和pH条件导致由 于酸性和有色化合物的形成，溶液中包含的关键量的单糖被破坏。而且，由于氮化合物、特 别是关于酰胺的分解，氨被释放到大气中。此外，所谓的甜菜柏仍然不仅包含甜菜的大部分 蛋白质，还包含大部分的多糖例如纤维素、半纤维素和果胶。根据German Zuckerverband， 在2011/2012年，德国总计制造了4.266.670吨的糖（以1如丨鉍1^1?5^6^"给出），对应于 1 ? 907 ? 302吨的Schnitzel ( "残余物"）（以 "t Trockenschnitzelwert" 表不）。结果，每吨糖 产生 了大约〇 ? 45吨的残余物作为废料(http: //www. zuckerverbaende ? de/zuckermarkt/ zahlen-und-fakten/zuckermarkt-deutschland/ruebenanbau-zuckererzeugung.html)〇
[0005] 为了克服这些缺点，已经试验了生物质降解的其他可能性，例如使用水解酶。已存 在有源自天然真菌来源的可用于水解生物质的商业化酶组合物，例如包含果胶酶、半纤维 素酶和纤维素酶作为副活性的产品" Pectmex? "，和主要包含纤维素酶和半纤维素酶的 产品" Celluclast? "（二者均来自Novozymes?)。这类商业化产品的使用在US4，886，672 和EP 2 256 208 A1中述及。
[0006] 但是截至目前，这些产品很少在大规模生产工艺中采用，因为生物质的降解速率 仍然相对较低。因此，生物质基本水解所需的工艺时间仍然相当高，因此这些商业可得产品 用于工业目的应用受到限制。
[0007] 因此，需要有能够使含糖和/或含多糖的生物质在合理时间内完全降解和/或水解 的新型高性能酶组合物。此外，在技术现状中需要有这样的高性能酶组合物，其能够以符合 成本效益的方式进行大量制备。此外，需要有这样的高性能酶组合物，其能够应用于工业级 水解工艺。
[0008] 因此，本发明的目的在于提供一种用于使生物质水解的方法，其不显示技术现状 中已知方法的任何缺点。
【发明内容】
[0009] 目前，本发明的发明人惊讶地发现，与技术现状中已知的酶组合物相关联的问题 能够通过包括至少一种纤维素酶、至少一种半纤维素酶和至少一种果胶酶的酶组合物解 决，其中上述至少一种半纤维素酶包括阿拉伯聚糖降解活性至少为l〇U/mg蛋白质的阿拉伯 聚糖内切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)。
[0010] 在本发明中使用的术语"纤维素酶"、"半纤维素酶"和"果胶酶"是指分别参与将聚 合纤维素、半纤维素和/或果胶水解切割成单糖的任何酶。如本文所用的术语"纤维素酶"、 "半纤维素酶"和"果胶酶"是指天然存在的酶和非天然存在的酶、或者包括数种由生物体例 如丝状真菌产生的酶的混合物。"纤维素酶"、"半纤维素酶"和"果胶酶"优选源自真菌例如 亚门真菌门和卵菌门的成员，包括但不限于以下属：曲霉属（Aspergillus)、枝顶孢属 (Acremonium)、短梗霉属（Aureobasidium)、白僵菌属（Beauveria)、头抱霉属 (〇6口11&1〇8。01'；[11111)、拟錯菌属（061'1。01'；[(^818)、毛壳菌属（01&61：0111；[11111)、金抱子菌属 (Chrysosporium)、麦角菌属（Claviceps)、旋抱腔菌属（Cochiobolus)、隐球菌属 (Cryptococcus)、黑蛋巢菌（Cyathus)、内座壳属（Endothia)、Endothiamucor、镜刀霉属 (Fusarium)、Gilocladium、腐质霉属（Humicola)、稻痕病菌（Magnaporthe)、毁丝霉属 (Myceliophthora)、漆斑菌属（Myrothecium)、毛霉属（Mucor)、脉抱菌属（Neurospora)、 Phanerochaete、柄抱壳菌属（Podospora)、拟青霉属（Paecilomyces)、梨抱属 (Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂裙菌属（Schizophylum)、壳 多孢属（Stagonospora)、蓝状菌属（Talaromyces)、木霉属（Trichoderma)、嗜热真菌属 (Thermomyces)、热子囊菌属（Thermoascus)、梭孢壳属（Thielavia)、弯颈霉属 (Tolypocladium)、毛癣菌属(Trichophyton)和栓菌属（Trametes)。在一个优选的实施方式 中，丝状真菌是木霉菌物种。
[0011] 在根据本发明的酶组合物的优选实施方式中，上述至少一种纤维素酶、半纤维素 酶和/或果胶酶来自真菌来源。在根据本发明的酶组合物的特别优选的实施方式中，该真菌 来源是里氏木霉(Trichoderma reesei)。
[0012] 术语"酶的混合物"优选是指由一种或多种微生物来源分泌的酶的混合物。在一些 实施方式中，可以通过一种或多种天然存在的丝状真菌菌株或经过改造的丝状真菌菌株来 制备用于这些酶混合物中的酶。优选的菌株如上所列。可通过改变最终混合物中酶的相对 量而实现最终混合物中酶组分的期望比例，例如，通过补充提纯的或部分提纯的酶。
[0013] 如在本发明中所用的术语"纤维素酶"是指能够使纤维素聚合物水解成较短的低 聚物和/或葡萄糖的任何酶或者酶混合物。
[0014] 根据本发明的酶组合物中的至少一种纤维素酶优选选自纤维二糖水解酶（EC 3.2.1. -)、内切-1，4-0_葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、0_葡糖苷酶(EC 3.2.1.4)、纤维二糖水解 酶（EC 3.2.1.21)、糖苷水解酶61(61161和〇8103)、￡1?3118111、5￥〇11611111、1〇〇8111111和(：1?蛋 白（EC 3.1.1.-;CE15)。
[0015] 在优选的酶组合物中，术语"纤维素酶"包括至少一种选自纤维二糖水解酶(EC 3.2.1. -)和内切-l，4-0-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)的酶。
[0016] 如在本发明中使用的术语"半纤维素酶"是指任何能够使半纤维素降解或支持其 降解的酶或者酶组合物。
[0017] 术语"阿拉伯聚糖-内切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶"是指阿拉伯聚糖-内切-l，5_a-L_阿拉伯糖苷酶EC 3.2.1.99。在本发明中，阿拉伯聚糖-内切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶EC 3.2.1.99具有至少10U/mg蛋白质、优选至少15U/mg蛋白质、进一步优选至少20U/mg蛋白质、 特别优选至少40U/mg蛋白质以及最优选至少50U/mg蛋白质的阿拉伯聚糖降解活性。进一步 优选的是，阿拉伯聚糖降解活性选自如下的范围：l〇-l〇〇U/mg蛋白质，优选10-65U/mg蛋白 质，进一步优选20-65U/mg蛋白质以及20-50U/mg蛋白质。
[0018] 在本发明的酶组合物中使用的阿拉伯聚糖-内切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶可以通 过细菌来源或真菌来源进行表达。阿拉伯聚糖-内切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶优选源自真 菌，例如土曲霉(Aspergillus terreus)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、米曲霉 (Aspergillus oryzae)、7K[^jl^LlSi(Fomes fomentarius)、产黄青霉（Penicillium chrysogenum)、棘抱曲霉（Aspergillus aculeatus)、Cylindro carponcongoense、红球丛 赤壳菌（Nectria haematococca)、嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophile)、球毛壳菌 (Chaetomium globulosum)、变色检菌（Trametes versicolor)或者构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。阿拉伯聚糖-内切-l，5_a-L-阿拉伯糖苷酶可以通过在内源生物中表达而制备， 或者可以通过在异源生物中表达而制备。优选地，主要酶和辅助酶(accessory enzyme)通 过在里氏木霉中表达而制备。
[0019] 在除了阿拉伯聚糖-内切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶之外根据本发明的酶组合物还 包含一种或多种另外的半纤维素酶的情况下，该一种或多种半纤维素酶优选选自葡聚糖 酶(EC 3.2.1.-)、内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、0_木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、乙酰木聚糖酯 酶（EC 3.1.1.72)、乙酰半乳聚糖酯酶（3.1.1.6)、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73)、葡糖醛酸酯酶(EC 3.1.1. _)、a-L_阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、a-阿拉伯 吡喃糖苷酶(3.2.1._)、a-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、0_半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、a-葡 糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)、0_甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、0_甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、甘 露聚糖1，4-甘露二糖苷酶(EC 3.2.1.100)、阿拉伯半乳聚糖内切-0-1，4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、内切-0-1，3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、半乳聚糖内切-0-1，3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.181)、葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖内切-1，4-0-木聚糖酶化〇3.2.1.136)、(^-岩藻 糖苷酶（EC 3.2.1.51)、松柏苷葡糖苷酶（EC 3.2.1.126)、木葡聚糖水解酶（EC 3.2.1.150，151，155)、木聚糖<1-1，2-葡糖苷酸酶（8111(3证〇11〇81(^86)(￡0 3.2.1.131)、内切 木糖半乳糖醛酸聚糖水解酶(EC 3.2.1，-;GH28)、a-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡聚糖1，4-a-葡 糖苷酶（EC 3.2.1.3)、半乳聚糖1，3-半乳糖苷酶（61143)、-1，4，-内切半乳聚糖酶（￡〇 3.5.1.89 ;GH53)、a-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)、0_鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.43)、木质素过氧 化物酶江(：1.11.1.14)、1111过氧化物酶(￡(：1.11.1.13)、芳基醇氧化酶江(：1.1.3.7)、乙二 醛氧化酶(EC 1.1.3.)、碳水化合物氧化酶(EC 1.1.3.4,9，10)、以及纤维二糖脱氢酶(EC 1.1.99.18)〇
[0020] 在优选的酶组合物中，术语"半纤维素酶"包括至少一种选自木聚糖酶、木糖苷酶、 酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、过氧化物酶和氧化酶的半纤维素酶。特别优选的是， 根据本发明的酶组合物包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或半乳糖聚酶的至少一种。
[0021] 如在本发明中所用的术语"果胶酶"是指任何能够降解果胶或支持其降解的酶或 酶混合物。
[0022] 根据本发明的酶组合物中的至少一种果胶酶优选选自聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.15,67,82;61128)、果胶/果胶酸酯裂解酶(￡〇4.2.2.2,6,9，10)、果胶甲酯酶(￡〇 3.1.1.11)、果胶乙酰酯酶(EC 3.1.1.-)、鼠李糖半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1. -; GH28)、鼠李糖 半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶（EC 3. 1 . 1 .86)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖内切裂解酶（EC 4.2.2.23)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶(EC 4.2.2.-，）、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖半乳糖 酸酸水解酶（rhamnogalacturonan galacturonohydrolase) (EC 3 ? 2 ? 1 ? _)、木糖半乳糖酸 酸聚糖水解酶（E C 3.2 . 1.-)、果胶甲酯酶（E C 3 . 1. 1 . 11)、0 -阿拉伯呋喃糖苷酶（E C 3 ? 2 ? 1 ? 55)、0-1，4-半乳聚糖酶(EC 3 ? 2 ? 1 ? 89)、0-1，3-半乳聚糖酶(EC 3 ? 2 ? 1 ? 90)、0_半乳 糖苷酶(EC 3.2.1.23)、a-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、阿魏酸乙酰酯酶(EC 3.1.1.-)、a-岩 藻糖苷酶(￡〇3.2.1.51)、0-岩藻糖苷酶(￡〇3.2.1.38)、0-洋芹糖苷酶(￡〇3.2.1.-)、€1-鼠 李糖苷酶（EC 3.2. 1.40)、0_鼠李糖苷酶（EC 3.2. 1.43)、a-阿拉伯吡喃糖苷酶（EC 3.2.1. - )、0_葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)、a-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)、0_木糖苷酶(EC 3.2.1.37)和〇-木糖苷酶(￡〇3.2.1.-)〇
[0023] 在优选的酶组合物中，术语"果胶酶"包括选自果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶裂 解酶、甘露糖苷酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶的至少一种果胶酶。
[0024] 在本发明进一步优选的实施方式中，阿拉伯聚糖内切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99) 的阿拉伯聚糖降解活性为至少一种纤维素酶的纤维素降解活性的至少8倍，优选 为至少一种纤维素酶的纤维素降解活性的至少18倍，最优选至少36倍。在进一步优选的实 施方式中，阿拉伯聚糖内切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性 为至少一种纤维素酶的纤维素降解活性的8-100倍，优选10-70倍。
[0025] 在本发明进一步优选的实施方式中，阿拉伯聚糖内切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99) 的阿拉伯聚糖降解活性为至少一种果胶酶的果胶降解活性的至少10倍，优选为 至少一种果胶酶的果胶降解活性的至少25倍，还优选至少50倍，最优选至少100倍。在进一 步优选的实施方式中，阿拉伯聚糖内切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚 糖降解活性为至少一种果胶酶的果胶降解活性的10-250倍，优选12-100倍，进一步优选15-70倍。
[0026] 在本发明进一步优选的实施方式中，当组合物中存在另一种半纤维素酶时，阿拉 伯聚糖内切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性为至少一种半 纤维素酶的半纤维素降解活性的至少0.25倍，优选为至少一种半纤维素酶的半纤维素降解 活性的至少0.5倍，最优选与之差不多。在进一步优选的实施方式中，阿拉伯聚糖内切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性为至少一种半纤维素酶的半纤维 素降解活性的〇. 25-5倍，优选0.5-2倍。
[0027] 根据本发明的酶组合物优选缺乏任何转化酶(E. C. 3.2.1.26)的酶。这在生物质水 解过程中酶组合物的使用是旨在生产用于食品应用的砂糖的情况下是特别优选的。
[0028] 根据基于国际生物化学与分子生物学联合会的酶的命名和分类（http:// www. chem. qmul ? ac ? uk/iubmb/enzyme/)或者基于碳水化合物活性酶数据库（http : // www. cazy. org/)的命名法对本发明中提及的酶进行分类。
[0029] 本发明中使用的术语酶的"活性"是指在酶充当蛋白质催化剂将特定的聚合或人 造底物转化成特定的低聚或单体产物的合适条件下酶的催化活性。在上下文中，术语"合适 条件"对本领域技术人员来说是熟知的且可适用的。
[0030] 在进一步的方面，本发明涉及如上文定义的酶组合物用于使生物质水解的用途。
[0031] 本发明中使用的术语"生物质"是指本领域技术人员已知适用于本发明方法的任 何类型的生物质。特别优选的是植物来源的生物质。在进一步优选的实施方式中，生物质的 初始干物质含量选自5_50wt%、优选10_45wt%、更优选15_42wt%、最优选20_40wt%。术语 "干物质是指在使用红外平衡法（IR-balance)将水和其他挥发性化合物从新鲜组 织中移除之后测定的质量与生物质的比例。由此特别优选的是选择其中其干物质包含至少 25wt%、更优选至少40wt%、特别优选至少60wt%、进一步优选至少80wt%的糖例如单糖、 二糖以及寡糖和/或多糖的生物质。而且，合适的生物质的任意混合物包涵在术语"生物质" 中。
[0032] 特别优选的生物质是"甜菜生物质"或"甘蔗生物质"。术语"甜菜生物质"是指甜菜 (Beta Vulgaris)的完整且未经加工的根组织，包括其外皮和内部果肉。甜菜的干组织包含 80wt %的可溶性蔗糖，而甜菜果肉包含大约7wt %的果胶、7wt %的纤维素、7wt %的半纤维 素、17wt%的阿拉伯糖、20wt%的葡萄糖和3.5wt%的果糖以及10wt%的蛋白质，所有这些 均相对于生物质的干物质(d.m.)而言。术语"甜菜生物质"还包括甜菜柏(甜菜片）。
[0033]术语"甘鹿生物质"是指甘鹿（Saccharum sp.)的完整且未经处理的莖，包括外皮 和内部果肉。甘蔗的干组织包含80wt%的可溶性蔗糖，而干的甘蔗渣由大约70wt%的聚合 糖组成，包括45wt%的纤维素、23wt%的木质素和25wt%的主要为木聚糖形式的半纤维素， 所有这些均相对于生物质的干物质(d.m.)而言。术语"甘蔗生物质"还包括甘蔗压饼(甘蔗 渣) 。
[0034] 适用于本发明方法的其它生物质包括来自林业和农业、食品加工和造纸业以及公 共废料的废产品。具体而言，如在本发明中所用的术语"生物质"包括谷物秸杆和斯佩尔特 小麦(spelt)(如小麦、黑麦、大麦、燕麦）、玉米猜杆和纺锭(spindles)、廐肥、草本材料和草 例如Sericea lespedeza、柳枝稷（Panicum virgatum)、象草（芒草(Miscanthus);中国芦 _)和苏丹草(Sorghum sudananse，Sorghum drummondi)、树皮、木片和木肩、水果果肉、龙 舌兰残余物、咖啡粉和来自榨油厂的废料例如来自工厂的菜籽压饼和污水，来自造纸厂的 造纸原液(stock)和废水、废纸、蔬菜和水果的残渣。
[0035] 在本发明方法的一个优选实施方式中，生物质选自含有纤维素、半纤维素和/或木 质素的生物质。
[0036] 在本发明方法的一个特别优选的实施方式中，生物质选自甜菜、甘蔗、稻草、玉米、 木材、油籽及它们的混合物。
[0037] 在进一步的方面，本发明涉及用于使生物质水解的方法，其包括以下步骤：
[0038] a)使生物质与如上定义的酶组合物接触；
[0039] b)对至少一部分生物质进行过滤并将渗透物分离。
[0040] 根据本发明，"接触"可以通过本领域技术人员已知适用于本发明方法的任何方法 实施。在优选的实施方式中，生物质与酶组合物的"接触"通过向生物质加入酶组合物而实 施。优选地，在接触后将生物质与酶组合物混合。
[0041] 在生物质与酶组合物接触期间，温度优选在25-80°C之间选择，更优选在45-75°C 之间选择，特别优选在48-70°C之间选择。
[0042] 在特别优选的实施方式中，用于使生物质水解的方法进行1分钟至100小时、更优 选10分钟至80小时、特别优选30分钟至40小时、甚至更优选1小时至30小时、还特别优选2小 时至20小时、最优选3至12小时。
[0043]在另一优选的实施方式中，用于使生物质水解的方法的步骤(a)进行1-80小时、优 选2-40小时、更优选3-20小时，其中温度在45-75 °C之间或者48-70 °C之间选择。
[0044]从而，在进行本发明方法的步骤a)时能够选择不同的温度进行特定的时间段。在 用于使生物质水解的方法的另一优选实施方式中，方法的步骤a)优选在35-45°C、优选40°C 的温度下进行1-5小时、优选2-3小时的第一时间段；随后在45-55°C、优选50°C的温度下进 行1-5小时、优选2-3小时的第二时间段;然后在55-65°C、优选60°C的温度下进行1-4小时、 优选1.5-2小时的第三时间段。本发明的酶组合物的特别优势在于，如前概述，在方法温度 随时间逐渐升高之后，可以实现效率的进一步提高和生物质水解。酶组合物优选以生物质 初始干物质的〇. 〇25-8wt %的量，更优选以生物质干物质的0.05-4wt %、特别优选以生物质 干物质的〇. 〇8_2wt %、最优选以生物质干物质的0.1-0.2wt %加入生物质中。
[0045]在进一步优选的实施方式中，生物质的初始干物质含量选择为5_50wt%、优选10-45wt%、更优选15-42wt%、最优选20-40wt%。术语"干物质(d.m.)"是指在使用红外平衡法 将水和其他挥发性化合物从新鲜组织中移除之后测定的质量与生物质的比例。
[0046] 在进一步优选的实施方式中，将生物质同时与本发明酶组合物的所有酶混合物和 阿拉伯聚糖内切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)接触，然而，也可以使生物质逐步 地与本发明酶组合物的不同酶混合物和阿拉伯聚糖内切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶（EC 3.2.1.99)接触。
[0047] 在进一步优选的实施方式中，用于使生物质水解的方法进行至直到生物质中残留 的干燥不溶性固体的含量低于30wt%、优选低于10wt%、甚至更优选低于2.5wt%。在进一 步优选的实施方式中，用于使生物质水解的方法的步骤(a)进行至直到生物质中残留的干 燥不溶性固体的含量为〇? 5-30wt%、优选l-10wt%、最优选1 ? 5-5wt%。
[0048] 术语"干燥不溶性固体"是指相对于包括液体部分和固体部分二者的总样品的质 量，用红外平衡法将水和其他挥发性化合物从固体部分中除去之后确定的不溶性固体的质 量。可以通过例如离心将样品的固体部分与液体部分分离。
[0049 ] 生物质的pH优选选择为3-9、优选为4-6、甚至更优选为4.5-5.5。
[0050]在用于生物质水解的方法的优选实施方式中，过滤为超滤或微滤。在特别优选的 实施方式中，通过使用超滤膜进行超滤，超滤膜进一步优选为陶瓷膜、不锈钢膜、合成膜(优 选包括聚砜)或者硅膜或含硅膜，或者它们的任意组合。在进一步特别优选的实施方式中， 膜的截留分子量（cut-off)选自0.5kDa_100kDa、更优选lkDa_50kDa、甚至更优选2kDa-25kDa。在进一步特别优选的实施方式中，通过使用微滤膜进行微滤，微滤膜进一步优选为 陶瓷膜、不锈钢膜、合成膜(优选包括聚砜)或者硅膜或含硅膜，或者它们的任意组合。
【具体实施方式】
[0051]本发明特别优选的实施方式
[0052]以下实施方式仅被理解为特别优选的实施方式，而不在任何方面限制本发明的范 围。
[0053] A)酶组合物，其包括至少一种选自纤维二糖水解酶(EC 3.2.1. _)、内切-1，4-0_葡 聚糖酶(EC 3.2.1.4)、0_葡糖苷酶(EC 3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.21)、糖苷水 解酶61(GH61 和CBM33)、Expansin、Swollenin、Loosinin和CIP蛋白（EC 3.1 ? 1 .-;CE15)的纤 维素酶，至少一种选自木聚糖酶、木糖苷酶、酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、过氧化 物酶和氧化酶的半纤维素酶，以及至少一种选自果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、 甘露糖苷酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶的果胶酶，其中至少一种半纤维素酶包括阿拉伯聚糖降 解活性为至少l〇U/mg蛋白质的阿拉伯聚糖内切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)。
[0054] 在这样特别优选的实施方式中，进一步优选的是，阿拉伯聚糖内切-l，5-a_L-阿拉 伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性为所述至少一种纤维素酶的纤维素降解活 性的至少8倍，优选8-100倍;和/或为所述至少一种果胶酶的蛋白质降解活性的至少10倍、 优选10-250倍;和/或为所述至少一种半纤维素酶的半纤维素降解活性的至少0.25倍，优选 0.25-5 倍。
[0055] B)酶组合物，其包括至少一种选自纤维二糖水解酶(EC 3.2.1. _)、内切-1，4-0_葡 聚糖酶(EC 3.2.1.4)的纤维素酶，至少一种选自聚木糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和半乳聚糖 酶的半纤维素酶，以及至少一种选自聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶 的果胶酶，其中至少一种半纤维素酶包括阿拉伯聚糖降解活性为至少l〇U/mg蛋白质的阿拉 伯聚糖内切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)。
[0056] 在这样特别优选的实施方式中，进一步优选的是，阿拉伯聚糖内切-l，5-a_L-阿拉 伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性为所述至少一种纤维素酶的纤维素降解活 性的至少8倍，优选8-100倍;和/或为所述至少一种果胶酶的蛋白质降解活性的至少10倍、 优选10-250倍;和/或为所述至少一种半纤维素酶的半纤维素降解活性的至少0.25倍，优选 0.25-5 倍。
[0057] C)用于使生物质水解的方法，其包括以下步骤：
[0058] a)使生物质与如上在实施方式A或B中定义的酶组合物接触；
[0059] b)使至少一部分生物质进行过滤并将渗透物分离，
[0060] 其中方法的步骤a)在35-45°C、优选40°C的温度下进行1-5小时、优选2-3小时的第 一时间段;随后在45-55°C、优选50°C的温度下进行1-5小时、优选2-3小时的第二时间段;随 后在55-65°C、优选60°C的温度下进行1-4小时、优选1.5-2小时的第三时间段。
[0061] 并且/或者其中生物质选自甜菜、甘蔗、稻草、玉米、木材、油籽和它们的组合物，
[0062] 并且/或者其中生物质的干物质含量选自5_50wt%、优选10_45wt%、更优选15-42wt%，最优选20_40wt%。
[0063] 越
[0064] 在本发明的实施例中使用以下方法。
[0065] 酶试验
[0066]阿拉伯糖酶-试验
[0067] 用红色脱支阿拉伯聚糖（Red Debranched Arabinan)作为底物（S-RDAR*， Megazyme International，爱尔兰)来确定阿拉伯糖酶的活性。反应混合物(200此)包含100 yL的酶溶液和在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)中的20mg/mL红色脱支阿拉伯聚糖（终浓度），其 在50°C下培养0、5、10、15、20、25和30分钟。在向反应混合物加入95%￡切11并进一步孵育10 分钟之后，在A520处测定释放的红色染料的量。一单位(U)的红色脱支阿拉伯聚糖水解活性 被定义为在上述条件(pH 5、50°C和20mg/mL的底物浓度)下每分钟释放1AU(吸收单位)红色 染料的酶当量。
[0068]蛋白质-试验
[0069] 根据Bradford法(Bradford M.M. (1976) .Anal .Biochem.72,248-254)确定蛋白质 的浓度。
[0070] 酶组合物
[0071 ]以下酶被用于制备酶组合物：
[0072] 阿拉伯糖酶（E - E A R A B，Megazymes* I n c .，爱尔兰）、纤维素酶（ Cdluclast?，Novozymes?，丹麦）、葡糖苷酶（N〇v〇l88?，Novozymes?，丹麦）和 果胶酶（？6。1：；[11611]11：抑§?-1/馨4〇￥0271116 8，丹麦）。如果需要，用5〇11114111；[0011超滤装置 (1 OkDa截留分子量；Millipote? ? Maidstone，UK)以45ml的乙酸钠缓冲液（50mM，pH 5)对酶 进行脱盐和浓缩。
[0073] 参照酶组合物
[0074]使用以下的酶：43 ? 4wt % 的 Celluclast?、6 ? 3wt % 的Novo 188? 和50 ? 3wt % 的 Pectinex UltraSP-L1、?)。这些产品在50mM的NaAc缓冲液(pH 5)中进行混合。
[0075]根据本发明的酶组合物(EC)
[0076]使用以下的酶：43 ? 4wt % 的 Celluclast?、6 ? 3wt % 的Novo 188? 和50 ? 3wt % 的 Pectinex UltraSP-L?与5wt %的阿拉伯聚糖内切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(E-EARAB， Megazymes_inc.，爱尔兰）。这些产品在50mM的NaAc缓冲液(pH 5)中进行混合。
[0077] 实施例和附图
[0078]现在通过以下实施例和附图对本发明进行描述。所有实施例和附图仅是出于说明 性的目的，不应理解为对本发明的限制。
[0079]图1显示在50°C下与参照酶组合物相比，本发明的酶组合物(EC)在第一个5小时内 改善的甜菜根液化。
[0080] 图2显示在50°C下与参照酶组合物相比，本发明的酶组合物(EC)在第一个5小时内 甜菜根释放阿拉伯糖的改善。
[0081] 图3显示随着向参照酶组合物中加入阿拉伯聚糖内切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶，在 50°C下24小时后甜菜根液化的改善。
[0082]图4显示随着向参照酶组合物中加入阿拉伯聚糖内切-l，5_a-L-阿拉伯糖苷酶，在 50°C下24小时后甜菜根释放阿拉伯糖的改善。
[0083]实施例1在50°C下完整甜菜的酶促液化
[0084]完整甜菜材料由采自德国Sulzemoos的新鲜甜菜根制备。冲洗甜菜根以除去残留 的土并用Waring捣碎机切成大约10mmX 10mm的片。甜菜材料具有23%的平均d.m.含量。 [0085] 反应混合物（20mL)包含0.1 %E/S的本发明酶组合物(EC)或者参照酶组合物以及 50mM乙酸钠缓冲液(pH5)中d.m.含量为15%的甜菜。将反应混合物在50°C下孵育30分钟至5 小时。在液化和水解之后，将反应混合物在3200g下离心30分钟并将上清液分离和称重。将 lml上清液在95°C下热失活 10分钟，用配有.Aminex?_HPX 87(BioRad Labs，Hercules，USA) 离子交换柱（洗脱剂；100 %水，T: 85 °C，流速：0.6ml/min，RI检测）的HPLC( Agilen戊，： Germany)分析释放的糖的量。
[0086]根据下式测定液化：
[0088] 结果示于图1和图2。
[0089] 实施例2:在不同的阿拉伯聚糖内切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶活性下完整甜菜的酶 促液化
[0090] 反应混合物（20mL)包含0.05 % E/S的参照酶混合物和不同量的阿拉伯聚糖内切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶。通过加入50mM的乙酸钠缓冲液(pH 5)将d.m.含量设定为15 %。反 应混合物在50 °C下孵育24小时。在液化和水解之后，将反应混合物在3200g下离心30分钟， 将上清液分离并称重。将lml上清液在95°C下热失活10分钟，并用配有Aminex>HPX 87 (BioRad Labs，Hercules，USA)离子交换柱(洗脱剂；100%水，T:85°C，流速:0? 6ml/min，RI 检测）的HPLC( Agilent?，Germany)分析释放的糖的量。
[0091] 枏据下式测定液化：
[0093] 结果示于图3和图4中。
【主权项】
1. 一种酶组合物，其包括至少一种纤维素酶、至少一种半纤维素酶和至少一种果胶酶， 其中所述至少一种半纤维素酶包括阿拉伯聚糖降解活性为至少?ου/mg蛋白质的阿拉伯聚 糖内切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)。2. 根据权利要求1所述的酶组合物，其中所述至少一种纤维素酶包括至少一种选自纤 维二糖水解酶和内切-1，4-β-葡聚糖酶的酶。3. 根据前述权利要求中任一项所述的酶组合物，其中所述至少一种果胶酶包含至少一 种选自果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、甘露糖苷酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶的酶。4. 根据前述权利要求中任一项所述的酶组合物，其中所述酶组合物还包括至少一种选 自木聚糖酶、木糖苷酶、酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、过氧化物酶和氧化酶的半纤 维素酶。5. 根据前述权利要求中任一项所述的酶组合物，其中所述阿拉伯聚糖内切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性为所述至少一种纤维素酶的纤维素降 解活性的至少8倍。6. 根据前述权利要求中任一项所述的酶组合物，其中所述阿拉伯聚糖内切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性为所述至少一种果胶酶的果胶降解活 性的至少10倍。7. 根据权利要求4-6中任一项所述的酶组合物，其中所述阿拉伯聚糖内切-l，5-a_L-阿 拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性为所述至少一种木聚糖酶、木糖苷酶、酯 酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、过氧化物酶和/或氧化酶的半纤维素降解活性的至少 0.25 倍。8. 根据前述权利要求中任一项所述的酶组合物，其中所述半纤维素酶、纤维素酶和/或 果胶酶通过在里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达而制备。9. 根据前述权利要求中任一项所述的酶组合物用于使生物质水解的用途。10. 根据权利要求9所述的用途，其中所述生物质选自甜菜、甘蔗、稻草、玉米、木材、油 籽和它们的组合物。11. 一种用于使生物质水解的方法，其包括以下步骤： a) 使所述生物质与权利要求1-8中任一项所限定的酶组合物接触； b) 对所述生物质的至少一部分进行过滤，并将渗透物分离。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述过滤是超滤或者微滤。
【文档编号】C12P19/14GK105849259SQ201480070584
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年12月15日
【发明人】C·赖辛格, L·勒希尔, M·克劳斯, C·加莫夫
【申请人】科莱恩国际有限公司