一类螺甾类化合物及其应用
【专利摘要】本发明公开了一类螺甾类化合物及其应用。所述螺甾类化合物从开口箭根茎中提取分离得到，经过实验研究发现本发明获得的9种螺甾皂苷类化合物在防治癌症、抗炎方面具有很好的作用，对咽鳞癌、咽头癌、鼻咽鳞癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌等都具有一定的抑制作用。说明本发明螺甾类化合物具有高效、低毒的优点，有望开发为新的抗癌药物及保健食品。
【专利说明】
一类螺甾类化合物及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及螺留类化合物及其应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是人体器官组织的细胞在外来和内在有害因素的长期作用下所产生的一种 以细胞过度增殖为主要特点的新生物，在医学上可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。良性 肿瘤对人体健康影响较小，而恶性肿瘤(又称癌症)则严重威胁着人类的健康。根据世界卫 生组织和美国癌症协会的最新统计数据，癌症已成为人类死亡的首要病因，2008年全世界 约有1270万新诊断癌症病例和760万癌症死亡病例（约占所有死亡人数的13%)，且大约有 70%的癌症死亡病例发生在中低收入国家。预计到2030年，癌症年诊断和死亡病例将分别 尚达2140万和1320万。
[0003] 天然药物尤其是来源于植物的药物具有化学结构多样性和生物活性多样性，一直 是人类预防和治疗疾病的主要来源。临床上应用的许多药物都直接或间接来源于天然产 物，天然产物不仅可以作为药物半合成的前体物，而且可以作为药物化学合成的的模板，为 新药设计提供新思路。天然产物已成为发现新药物或先导化合物的主要源泉之一。
[0004] 开口箭（Tupistra Chinensis)为百合科（Liliaceae)铃兰族（Convallarieae)开 口箭属(Tupistra)植物。主要分布于我国中部和西南部，主产于湖北三峡库区及神龙架林 区。开口箭在土家族医药中享有极高声誉，为神农架四大名药之一药用部位为其根状茎。开 口箭味甘微苦，性寒，具有清热解毒、益气活血、散瘀止痛等多种功效，民间用于咽喉肿痛、 劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛、月经不调等症。使用方便，疗效显著，已有数百年的应用历 史。临床上，开口箭饮片治疗慢性咽炎效果良好。
[0005] 开口箭根茎的主要活性成分为留体皂苷类成分。现代药理实验研究表明开口箭具 有较强的抗肿瘤、抗炎、抑菌等活性。现有研究对开口箭化学成分研究仍不够彻底，因而开 口箭中留体类化学成分值得进一步研究和开发利用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一类螺留类化合物。
[0007] 本发明的另一目的在于提供螺留类化合物的应用。
[0008] 本发明所采取的技术方案是：
[0009] 螺留类化合物，其结构式分别为：
[0010] 化合物1:
[001^
[001 ? [001 d
[0017] 上述螺留类化合物在制备防治癌症药物中的应用。
[0018] 进一步的，上述癌症为咽鳞癌、咽头癌、鼻咽鳞癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺 癌。
[0019] 上述螺留类化合物在制备抗炎药物中的应用。
[0020] 本发明的有益效果是：
[0021] 本发明通过长期研究，从开口箭根茎中分离鉴定了一类新型螺留类化合物1~9。 通过研究发现该化合物1~9在防治癌症、抗炎方面具有很好的作用。该类化合物从植物中 提取获得，具有高效、低毒的优点，有望开发为新的抗癌药物及保健食品。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明化合物(50μΜ)对不同肿瘤细胞的抑制作用；
[0023]图2为本发明化合物（50μΜ)对Raw 264.7细胞释放炎症介质NO的抑制作用；ctl-: 空白对照;ct 1+:模型组;*p〈0.05。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0025] 实施例1螺留类化合物的提取及鉴定
[0026] -、螺甾类化合物的提取
[0027]取开口箭根茎17kg，用60%乙醇加热回流提取4次，每次4小时，合并提取液减压回 收溶剂，得总浸膏，将总浸膏用水混悬，用乙酸乙酯等体积萃取4次，除去脂溶性杂质，水层 经DlOl大孔树脂柱层析分离，分别以水、20%乙醇，60%乙醇，80%乙醇、95%乙醇进行洗 脱，得到5个馏分TA、TB、TC、TD、TE(J取馏分TC(60%乙醇洗脱部分）200g，采用硅胶柱色谱、 ODS中低压柱色谱、反相高效液相色谱等分离方法，分离得到本发明化合物1和2。采用同样 的分离手段从馏分TD(80%乙醇洗脱部分）中分离得到本发明化合物3-9。通过理化常数和 现代波谱学手段（HRESIMS，1D-匪R，2D-NMR)鉴定以上9个化合物的结构，化合物1为 8卩;11'〇8卜25(27)-611-10，3€[，50-奸;!_01，化合物2为8卩;!_1'08卜25(27)-611-10，3€[，40，50，60-pentol，化合物3为50-spirost-25(27)-en-30-0l-3-0-0-D-glucopyranosyl-( l-4)-0-D-&111。0卩7^1081(16，化合物4为50-8卩;!_1'08七-25(27)-611-10，30-(1;!_01-3-0-0-0-呂111。0卩7從110871-(144)-0-0-8111。0卩7『&11081(16，化合物5为（2510-50-8卩;!_1'08七&11-10，30-diol-3-0-0-D-glucopyranosyl_( l-6)-0-D-glucopyranoside，化合物6为（25Ι0-5β-sp iros tan-1β, 3β-?? 0 l-3-0-0-D-f rue tofuranosy 1-(2^6)-β-D-glucopyranos ide 物7 为 8卩;!_1'08卜25(27)-611-10，20，30，50-七6奸&01-5-0-0-0-8111。0卩7『&11081(16，化合物8为 spirost-25(27)-en-10，20，30，4P，50-pentol-2-0-0-D-xylopyranoside，化合物 9为 spirost-25(27)-en-10，20，30，4P，50-pentol-2-0-a-L-arabinopyranoside D 所获得的化 合物1~9的结构以表1所示的结构式为准。
[0028] 表1本发明9个螺甾类化合物的结构
[0032]二、螺留类化合物的鉴定 [0033]化合物1-9的结构鉴定过程如下：
[0034]化合物1的鉴定
[0035] spirost-25(27)-en-10，3a，50-triol(化合物 1):白色无定形粉末， [α]"'-19: φ 0.2Q，'MeOH)，在I R ( KBr )中显示出强的多羟基的吸收峰3 3 0 0 cm-1，对 Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对Ehrl ish(E试剂)不显色，提示该化合物为螺留类化合 物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 447.3112(calcd.for C27H43O5 447.3110)，提示其分子量为446，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C 27H42O5。
[0036] 在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号δ〇·87(3Η， 8，]^-18)、1.50(3!1，8，]^-19)及1.12(3!1，(1，1 = 7.0抱，]^-21);在低场区给出两个末端双键 上的质子信号 S4.83(lH，brs)和 4.80(lH，brs)。
[0037] 13C-NMRd 26MHz，pyridine-d5)给出27个碳信号，提示该化合物为螺留皂苷元。其 中δ 109.8为螺留皂苷C-22特征信号，δ 144.8和109.1为25和27位末端双键的特征信号，在糖 端基碳区未见糖端基碳信号，说明该化合物为留体皂苷元。比较该化合物与化合物（25R， S)-spirostan_10，3a，50-triol的碳谱数据，A、B、C、D、E环数据基本一致，仅F环数据有差 异，推测可能是该化合物的25位与27位碳形成末端双键的缘故。在HMBC谱中，两个末端双键 上的质子信号 S4.83(lH，brs)和 4.80(lH，brs)与 024(δ29.3)和(：-26(δ65.4)相关，也证明 25(27)位双键的存在。综合以上信息，化合物1鉴定为叩化 〇8卜25(27)-的-10，3€[，50-triol。通过HSQC、HMBC和1H- 1H⑶SY谱可对化合物1的核磁信号进行完全归属，化合物1的 1H-NMR和13C-NMR数据见表2，结构见表1。
[0038]化合物2的鉴定
[0039] spirost-25 (27 )_θη_1β，3α，4β，5β，60-pentol (化合物2):白色无定形粉末， [ajit -34,9 (c' 0.25, MeOH),红外谱图中显不强的多羟基吸收峰3398cm-S对Anisaldehyde (A试剂）反应显黄色，对EhrI ish(E试剂）不显色，提示该化合物为螺甾类化合物。HRESMS (positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 479.3018(calcd.for C27H43O7 479.3009)，提不 其分子量为478,结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C2 7H42〇7。
[0040]通过对化合物2的1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC和 1H-1H COSY和NOESY谱的分 析可以对其分子中的碳及氢信号进行全面归属。其1H-匪R谱给出三个特征的甲基信号δ 0.87(3H，s，Me-18)、1.86(3H，s，Me-19)和1.10(3!1，(1，了 = 7.0抱，]^-21);在低场区给出两个 末端双键上的质子信号δ4.81 (lH，s)和4.78(lH，s) ,3C-NMR(WeMHzdyridine-Cl5)显示出 27个碳信号，在糖端基碳信号区没有出现糖端基碳信号，说明化合物2是一个留体皂苷元。 其中δ1〇9.8为螺留皂苷C-22特征信号，δ144.8和109.1为25和27位末端双键的特征信号。 [0041 ] 在1H-1H COSY谱中，两个亚甲基质子δ2.23(Η-2α)和2.62(H-2f〇与连氧次甲基质子 δ4.19(Η-1)和4.85(H-3)相关，而连氧次甲基质子δ4.85(Η-3)与另一个连氧次甲基质子δ 4.34(Η-4)相关，连氧次甲基质子δ4.95(Η-6)与两个亚甲基质子δ1.55(Η-7α)和2.07(H-7f〇 相关。此外，在 1H-NMR谱低场区存在一个尖锐单峰质子信号δ6.00,由于该质子与C-4、C-5、 C-6和C-IO分别具有HMBC相关，可以将该质子归属为C-5上连接的羟基质子。通过以上分析， 可以确定该化合物含有5个羟基基团，分别连接在C-I、C-3、C-4、C-5和C-6位。
[0042] 化合物2的相对构型可以通过NOESY谱得以确定。在NOESY谱中，Η-4α与Η-7α和Η-9 α 相关，Η_2α与Η_9α相关，说明Α、Β环是顺式相连，因而C-4和C-5羟基为β构型。另外，Η_1α与Me-19和H-11相关，H-3fs与H-2fs相关，Η-6α与Η-7α相关，表明C-I和C-6羟基为β构型，C-3羟基为α 构型。综合以上信息，化合物2鉴定为spirost-25(27)-en-10，3a，40，50，60-pentol。化合物 2的 1H-NMR和13C-NMR数据见表2，化合物2的结构见表1。
[0043]化合物3的鉴定
[0044] 50-spirost-25(27) -θη_3β-。l-3-〇-0-D-glucopyranosy 1- (1 - 4) -β-D-glucopyranoside(化合物3):白色无定形粉末，[a]it-30.6 (r 0.15, McOH) JtAnisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对EhrlisME试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为螺 留阜苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 739.4254(calcd.for C39H63O13 739.4269)，提示其分子量为738，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为 C39H62〇13o
[0045] 在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号δ〇·82(3Η， 8，]^-18)、0.84(3!1，8，]^-19)和1.10(3!1，(1，1 = 6.9抱，]^-21);在低场区给出两个末端双键 上的质子信号M.83(1H，s)和4.79(lH，s);在糖端基信号区给出两个糖端基氢信号δ4.91 (1!1，(1，1 = 7.8抱)和5.23(1!1，(1，1 = 7.9抱），提示该化合物为双糖螺甾皂苷。
[0046] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出39个碳信号，其中δ1〇9·8为螺甾皂苷C-22特 征信号，δ144.8和109.1为25和27位末端双键的特征信号。该化合物的碳谱数据与文献报道 白勺 50_spirost_25(27)_en_30_ol_3_O_0_D_glucopyranosyl_(l - 2)_0_D_ galactopyranoside基本一致，仅糖链部分数据存在差异。在糖端基碳区给出两个糖端基碳 信号δ1〇3.2和105.3，结合酸水解结果，确定为两分子葡萄糖。通过与化合物3对照，它们糖 区碳谱数据基本一致，故可推测该化合物糖链连接为-GIc 4-GIc,其二维图谱也证明了上述 推测。结合HSQC、HMBC和1H-1H COSY谱可对化合物3的核磁信号进行完全归属。综合以上信 息，化合物 3 鉴定为 50-spirost-25(27)-en-30-〇l-3-〇-0-D-glucopyranosyl-( l-4)-0-D-glucopyranoside。化合物3的1H-NMR和13C-NMR数据见表3,化合物3的结构见表1。
[0047]化合物4的鉴定
[0048] 50-spirost-25(27)-en-10，30-diol-3-〇-0-D-glucopyranosyl_( l-4)-0-D- glucopyranoside(化合物4):白色无定形粉末，[ot]?-52,9 (c 0,25, MeOH}，对Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对EhrlisME试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为螺 留阜苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 755 · 4807(calcd · for C39H63Ow 755.4218)，提示其分子量为754，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为 C39H62〇14o
[0049] 1H-匪R谱中，高场区出现三个特征的甲基信号，其中两个为单峰，分别位于δ〇 . 84 (3!1，8，]^-18)和1.26(3!1，8，]^-19)，另一个为双峰，位于31.10(3!1，(1，了 = 7.0抱，]^-21)。较 低场区显示两个末端双键上的质子信号S4.82(lH，s)和4.79(lH，s)。在糖端基信号区给出 两个糖端基质子信号阽.21 (1H，d，J = 7.9Hz)和4.97 (1H，d，J = 7.8Hz)，提示化合物4为双糖 螺甾皂苷。
[0050] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)中共有39个碳信号。其中δ109·8为螺留类皂苷骨架 上22位碳的特征信号，δ144.8和109.1为一对末端双键的特征信号，δ1〇5.3与101.3为糖端 基碳信号。将该化合物苷元部分碳信号与已知化合物isorhodeasapogenin比较，发现除了 F 环及3位碳信号有较大差别外，其余碳信号基本一致，因此可以推测该化合物苷元为25(27) 位双键结构的isorhodeasapogenin。此外化合物4的3位碳信号较isorhodeasapogenin向低 场发生了较大位移，因此可以推断该化合物的3位羟基成苷。通过与已知化合物 isorhodeasapogenin3_O_0_D_glucopy;ranosyl_( 1-4)_0_D_glucopy;ranoside 对 Rf、，它"(门 糖区碳谱数据基本一致，故推测化合物4的糖链连接顺序为3-0-i3-D-GlC-(l44)-i3-D-Gl C。 在HMBC谱中糖端基质子δ5.21与内侧糖的04(δ81.5)相关，内侦_端基质子δ4.97与苷元C-3(δ75 · 2)相关，进一步确定该化合物的糖链与化合物18〇1"11〇(16383?〇8611；[113-0-0-0-区111(3<^5^3110871-(144)-0-0-8111(3(^5^31108丨(16完全相同。综上所述，化合物4鉴定为50-spirost_25(27)_en_10，30_diol_3_O_0_D_glucopyranosyl_(l-4)_0_D_ glucopyranoside。化合物4的1H-NMR和13C-NMR数据见表3,化合物4的结构见表1
[0051] 化合物5的鉴定
[0052] (25R)-50-spirostan-10，30-diol-3-〇-0-D_glucopyranosy 1_( 1-6 )-0_D-glucopyranoside(化合物5):白色无定形粉末，[a]f-27.〇 (c 'CU2, MeQH),对Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对EhrlisME试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为螺 留阜苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 757 · 4403(calcd · for C39H65Ow 757.4374)，提示其分子量为756，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为 C39H64〇14〇
[0053] 在IR(KBr)中，3411cm-1为多羟基的吸收峰，在lOOO-SOOcm-1之间，919cm-带）小 于899〇1^((：带），说明化合物25位为R构型 [97]。
[0054]在1H-匪R谱中，高场区给出甾体皂苷元上四个特征的甲基信号，其中两个为单峰， 分别位于 60.81(3!1，8，]^-18)和1.24(3!1，8，]^-19)，另外两个为双峰，位于50.68(3!1，(1，了 = 5.6Hz，Me-27)和1.14(3H，d，J = 6.9Hz，Me-21)。在糖端基信号区给出两个糖端基质子信号δ 5.02(1!1，(1，1 = 7.7抱）和4.93(1!1，(1，1 = 7.8抱），提示化合物5为双糖螺甾皂苷。由糖端基氢 信号的J值可知两个葡萄糖均为β构型。
[0055] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)中共有39个碳信号。其中δ1〇9·6为螺留类皂苷骨架 上22位碳的特征信号，δ1〇5.3与102.4为两个糖端基碳信号。该化合物的碳谱数据与已知化 合物isorhodeasapogenin 3_O_0_D_glucopy;ranosyl_( 1-4)_0_D_glucopy;ranoside十分 相似，仅糖区的碳信号有所差别，因此可以推测二者拥有相同的苷元及糖组成，只是糖的连 接方式不相同。分析化合物5葡萄糖的碳谱数据，发现一个葡萄糖的6位碳(δ70.7)向低场位 移了7.7ppm，因此推测两个葡萄糖连接方式为-Gl C-(6-l)-Glc。在HMBC谱中糖端基质子δ 5.〇2与内侧糖的〇607〇.7)相关，内侧糖端基质子54.93与苷元(：-3076.〇)相关，进一步证 明了两个葡萄糖链接位点的正确性。综合以上信息，化合物5鉴定为(25R)-50-spirostan-l β，30-diol-3-〇-0-D-glucopyranosyl_( 1-6)-0-〇-区111(3〇卩5^已11〇81(16〇化合物5的1!1-匪1? 和 13C-NMR数据见表4，化合物5的结构见表1。
[0056] 化合物6的鉴定
[0057] (25R)-50-spirostan-lP, 3P-diol-3-〇-0-D-fructofuranosyl-(2^6)-0-D-glucopyranoside(化合物6):化合物6为白色无定形粉末，[0^-66,8 (r 0.50, Me()H)，对 Ani saldehyde( A试剂)反应显黄色，对Ehr Iish (E试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖和D-果 糖，提示该化合物为螺留皂苷类化合物。HRESMS (posi ti ve)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 757 · 4401 (calcd · for C39H65Om 757 · 4374)，提示其分子量为756，结合1H-NMR和 13C-匪R (DEPT)可确定其分子式为C39H64〇i4。
[0058] 在IR(KBr)中，3391cm-1为多羟基的吸收峰，在lOOO-SOOcm-1之间，918cm-带）小 于899〇1^((：带），说明化合物25位为R构型。
[0059]在1H-匪R谱中，高场区给出甾体皂苷元上四个特征的甲基信号，其中两个为单峰， 分别位于 30.81(3!1，8，]^-18)和1.23(3!1，8，]^-19)，另外两个为双峰，位于30.69(3!1，(1，了 = 5.6抱^-27)和1.14(3!1，(1，1 = 7.0抱^-21)。在糖端基信号区只给出一个糖端基质子信 号 S4.89(lH，d，J = 7.8Hz)。
[0060] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)中共有39个碳信号。其中δ109.6为螺甾类皂苷骨架 上22位碳的特征信号。在糖端基信号区给出两个糖端基碳信号δ1〇6.2和102.1，提示化合物 6为双糖螺留皂苷。结合DEPT谱可知106.2处为季碳，提示该化合物含有一分子酮糖，与酸水 解检出D-果糖(六碳酮糖)一致。化合物6的苷元部分及葡萄糖部分的碳信号与化合物5基本 一致，提示化合物6也是isorhodeasapogenin的3位成苷的螺留阜苷。在HMBC谱中，葡萄糖6 位质子信号34.85(1!1，(1，1 = 9.1抱）和4.55(1!1，111)与果糖2位碳信号01〇6.2)相关，葡萄糖1 位质子信号δ4.89 (IH，d，J = 7.8Hz)与苷元3位碳信号（δ75.6)相关，结合文献，确定该化合 物的糖链链接为3-〇-61〇-(64 2)1^1。综合以上信息，化合物6鉴定为（251〇-50-spirostan-?β，30_diol_3_O_0_D_fructofuranosyl_(2-6)_0_D_glucopyranoside。化合 物6的 1H-NMR和13C-NMR数据见表4，化合物6的结构见表1。
[0061] 化合物7的鉴定
[0062] spirost_25( 27)_θη_1β，2β，3β，50-七61:瓜〇1-5-〇-0-〇-8111(3〇卩5^&11〇81(16(化合物 7):化合物7为白色无定形粉末，[exp-44.9 (r 0.50, MeOH)，红外谱图中显示强的多羟基吸 收峰34240^1，对Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对Ehr lish(E试剂)不显色，酸水解检出 D-葡萄糖，提示该化合物为螺留皂苷类化合物。HRESMS(Positive)给出准分子离子峰[M+ H]+m/z 625.3630(calcd.for C33H53Oii 625.3588)，提示其分子量为624,结合1H-NMR和 13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C33H52O1U
[0063] 在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号δ〇·83(3Η， 8，]^-18)、1.62(3!1，8，]^-19)和1.08(3!1，(1，1 = 7.0抱，]^-21);在低场区给出两个末端双键 上的质子信号M.83(1H，s)和4.79(lH，s);在糖端基信号区给出一个糖端基氢信号δ5.29 (lH，d，J = 7.7Hz)，结合糖端基氢信号的J值与酸水解分析结果，提示该化合物为含有一个 β-D-葡萄糖单糖螺留皂苷。
[0064] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出33个碳信号，其中δ1〇9·8为螺甾皂苷C-22特 征信号，δ 144.8和109.1为25和27位末端双键的特征信号，δ97.7为糖端基碳信号。经与文献 对照[1Q2]，该化合物与spirost-SS^Tpen-lPJPJPJP-tetraoim-D-galactopyranoside 苷元部分的碳谱数据基本一致 ，仅糖区信号不同 ，提示化合物 7 的苷元 为8口;[1'081：-25(27)-611-10，20，30，50-七61^301。在服13(]谱中，葡萄糖端基质子信号 35.29 (1!1，(1，1 = 7.7他）与苷元(：-5(683.4)相关，从而确定葡萄糖连接在化合物7的(：-5位。通过 1H-Nmi^ 13C-Nmr(DEPT)Ahsqc^hmbcJh-1H⑶SY和NOESY谱并结合文献可以对该化合物的碳 及氢信号进行全面归属。综合以上信息，化合物7鉴定为spirost-25 (27 )-θη-1β，2β，3β，5β-tetraol_5-〇-0-D-glucopyranoside。化合物 7 的1Η-ΝΜ 和 13C-NMR 数据见表 5，化合物 7 的结构 见表1。
[0065]化合物8的鉴定
[0066] sp iro st_25 (27)-en-?β，2β，3β，4β，50-pentol-2-〇-0-D_xy lopyranos ide(化合物 8):白色无定形粉末，[α]?:-43.3 ?'0.25, MeOH),红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3364cm 一1，对Ani saldehyde( A试剂)反应显黄色，对Ehr Iish (E试剂)不显色，酸水解检出D-木糖，提 示该化合物为螺甾皂苷类化合物。!11^303(?〇81^代）给出准分子离子峰[1+!1] +111八 611 · 3437(calcd · for C32H51O11 611 · 3431)，提示其分子量为610，结合1H-NMR和 13C-NMR (DEPT)可确定其分子式为C32H5qO11。
[0067] 在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号δ〇·84(3Η， 8，]^-18)、1.59(3!1，8，]^-19)和1.09(3!1，(1，1 = 7.0抱，]^-21);在低场区给出两个末端双键 上的质子信号M.82(1H，s)和4.79(lH，s);在糖端基信号区给出一个糖端基氢信号δ5.15 (lH，d，J = 7.5Hz)，结合糖端基氢信号的J值与酸水解分析结果，提示该化合物为含有一个 β-D-木糖的单糖螺留皂苷。
[0068] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出32个碳信号，其中δ1〇9·8为螺甾皂苷C-22特 征信号，δ144.7和109.1为25和27位末端双键的特征信号，δ1〇3.5为糖端基碳信号。另将该 化合物苷元部分碳谱数据与已知化合物△ 25(27)_pentrogenin比较，发现除了2位碳信号向 低场位移6.6ppm外，其余信号基本一致，因此推测该化合物为△ 25(27)-pentrogenin的2位苷 化后形成的留体皂苷。在HMBC谱中，木糖端基质子信号δ5.15(IH，d，J = 7.5Hz)与苷元C-2(δ 74.4)相关，从而确定木糖连接在化合物T38的C-2位。通过1H-匪R、13C-匪R(DEPT)、HSQC、 HMBC和1H-1H COSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属。综合以上信息，化合物8 鉴定为spiro s t_25 (27 )_θη_1β，2β，3β，4β，50-pentol-2-〇-0-D_xy Iopyranoside。化合物8 的1H-NMR和13C-NMR数据见表6，化合物8的结构见表1。
[0069]化合物9的鉴定
[0070] spirost-25(27)_θη_1β，2β，3β，4β，50-pentol-2-〇-a-L_arabinopyranoside(化 合物9):白色无定形粉末，[?jiN49.2 (c 0.25, MC0H)，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰 3422cm-S对Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对Ehrl ish(E试剂)不显色，酸水解检出L-阿 拉伯糖，提示该化合物为螺留皂苷类化合物。HRESMS(p0sitive)给出准分子离子峰[M+H] + m/z 611.3412(calcd.for C32H51O11 611.3431)，提示其分子量为610,结合1H-NMR和 13C-NMR (DEPT)可确定其分子式为C32H5qO11。
[0071] 在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号δ〇·83(3Η， 8，]^-18)、1.58(3!1，8，]^-19)和1.09(3!1，(1，1 = 7.0抱，]^-21);在低场区给出两个末端双键 上的质子信号M.81(1H，s)和4.78(lH，s);在糖端基信号区给出一个糖端基氢信号δ5.13 (lH，d，J = 7.OHz)，结合糖端基氢信号的J值与酸水解分析结果，提示该化合物为含有一个 α-L-阿拉伯糖的单糖螺甾皂苷。
[0072] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出32个碳信号，其中δ1〇9·8为螺甾皂苷C-22特 征信号，δ144.7和109.1为25和27位末端双键的特征信号，δ1〇3.4为糖端基碳信号。另将该 化合物的碳谱数据与化合物8比较，二者苷元部分数据基本一致，仅糖区信号有差异，推测 该化合物同样也为A 25(27)-pentr〇genin的2位苷化后形成的留体皂苷，只是2位连接的是阿 拉伯糖而不是木糖。在HMBC谱中，阿拉伯糖端基质子信号35.13(1!1，(1，1 = 7.0抱）与苷元(：-2 (δ74.0)相关，从而确定阿拉伯糖连接在化合物9的C-2位。通过1H-匪R、 13C-匪R(DEPT)、 HSQC、HMBC和1H-1H COSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属。综合以上信息，化 合物 9 鉴定为 spirost-25 (27 )_θη_1β，2β，3β，4β，50-pentol-2-〇-a-L_arabinopyranoside 〇 化合物9的1H-NMR和13C-NMR数据见表6，化合物9的结构见表1。
[0073] 表2本发明化合物1和化合物2的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d 5)
[0075] 表3本发明化合物3和化合物4的iH-NMR和i3C-NMR谱数据(pyridine-d 5)
[0077] 表4本发明化合物5和化合物6的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d 5)
L〇〇84」买施例2抑瘤试验：
[0085] 本发明化合物对人体7个瘤株的体外抑瘤活性实验，这7个瘤株包括FaDu(人咽鳞 癌细胞）、Detroit 562(人咽头癌胸水转移细胞），CNE-1 (高分化人鼻咽鳞癌细胞），CNE-2 (低分化人鼻咽鳞癌细胞），HepG2(人肝癌细胞），K562(人慢性骨髓性白血病细胞），SPC-A-I (人肺腺癌细胞)七种人体肿瘤细胞的细胞毒活性以及对正常细胞L-929(小鼠成纤维细胞） 的毒性。抗癌药(^8-(1；[(311101'0(1丨3111；[116。131：；[1111111(11)(顺钼)作为阳性对照 。
[0086] 抑制肿瘤细胞增殖(MTIti)
[0087] 将肿瘤细胞接种于96孔板中，培养24h后加入待测试样品，再培养48h后用MTT法测 定样品对肿瘤细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率按下述公式计算，并用CalcuSyn软件计 算被测试样品的半数抑制浓度(IC 50)。
[0088] 细胞增殖抑制率=(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值）+ (阴性对照组 OD值平均值-空白对照组OD值平均值）X 100%
[0089] 实验结果见表7和图1。
[0090]表7:本发明化合物对不同肿瘤细胞的抑制作用
[0092]从表7和图1的实验数据可知，化合物1~9对不同的肿瘤细胞均具有较好的抑制作 用，尤其是化合物1、3~6对不同的肿瘤细胞表现出很好的抑制作用(见表7)，而其余化合物 在浓度为50μΜ时对不同的肿瘤细胞也有不同程度的抑制作用(见图1)。
[0093]实施例3抗炎试验：
[0094]本发明化合物对体外抗炎活性实验，采用LPS(脂多糖)诱导的Raw 264.7(小鼠巨 噬细胞)细胞，建立体外炎症模型。采用MTT和Griess实验，考察本发明化合物对经脂多糖诱 导后的Raw 264.7细胞释放炎症介质NO的影响。抗炎药Indomethacin(吲噪美辛）作为阳性 对照。
[0095] 1)MTT 实验
[0096] Raw 264.7细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入待测供试品，再培养24h后用 MTT法测定样品对肿瘤细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率按下述公式计算，并用Ca I cu Sy η 软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)。
[0097] 细胞增殖抑制率=(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值）+ (阴性对照组 OD值平均值-空白对照组OD值平均值）X 100%
[0098] 2)Griess 实验
[0099] Raw 264.7细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入待测供试品，再培养24h后， 吸取各孔培养液50yL，加入50yL Griess A试剂和50yL Griess B试剂混匀，用酶标仪于 546nm处测定OD值，按如下公式计算对NO产生的抑制率，并用CalcuSyn软件计算被测试样品 的半数抑制浓度(IC 50)。
[0100] NO抑制率=(模型对照组OD值平均值-样品组OD值平均值）+ (模型对照组OD值平 均值-阴性对照组OD值平均值）X 100%
[0101] 实验结果见表8和图2。
[0102]表8:本发明化合物对Raw 264.7细胞释放炎症介质NO的抑制作用
[0104] 从表8和图2的实验数据可知，本发明化合物1~9具有较好体外抗炎活性，尤其是 化合物2~8表现出更佳的抗炎活性（见表8)，化合物1和9在浓度为50μΜ时对LPS诱导的 Raw264.7细胞释放炎症介质NO也有不同程度的抑制作用(见图2)。
[0105] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.螺留类化合物，其结构式分别为：2. 权利要求1所述螺留类化合物在制备防治癌症药物中的应用。3. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述癌症为咽鳞癌、咽头癌、鼻咽鳞癌、肝 癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌。4. 权利要求1所述螺留类化合物在制备抗炎药物中的应用。
【文档编号】A61P29/00GK105859825SQ201610301627
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】何祥久, 向丽敏, 王宜海, 易晓敏
【申请人】广东药学院