苹果蛋白质提取方法及相关的蛋白质提取液的制作方法
【专利摘要】本发明公开了苹果蛋白质提取方法及相关的蛋白质提取液。本发明公开的蛋白质提取方法，包括：破碎植物组织和/或器官，加入蛋白质提取液在0?6℃下反应3?7分钟，除去杂质，得到蛋白质；蛋白质提取液，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：三羟甲基氨基甲烷100mM、乙二胺四乙酸50mM、氯化钾50mM、四硼酸钠25mM、二硫苏糖醇1mM、苯甲基磺酰氟2mM、聚乙二醇辛基苯基醚1％(体积百分浓度)、β?巯基乙醇5％(体积百分浓度)和25mg/mL蔗糖，pH值为7.5?8.0。本发明的蛋白质提取方法，可以有效去除多酚和色素等杂质，将得到的蛋白质利用iTRAQ技术进行定量分析时得到的蛋白质数量可达2000余个。
【专利说明】
苹果蛋白质提取方法及相关的蛋白质提取液
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域中苹果蛋白质提取方法及相关的蛋白质提取液。
【背景技术】
[0002]当前，随着分子生物学技术的不断更新和完善，分子生物学手段也为苹果遗传研究提供便利条件;早在1989年，欧洲苹果基因组计划开始启动，并以苹果遗传学研究作为其长期工作重点；近年来，具备高通量、高灵敏性等优点的蛋白质组学研究，已成为生命科学研究的前沿和热门领域。
[0003]目前，随着果树基因组研究工作的不断深入和完善，蛋白质组学分析技术已经应用于苹果、梨、葡萄、桃、香蕉等果树品种研究上。2010年公布了苹果栽培品种“金冠”的全基因组草图，其测序结果所产生的海量数据，为应用蛋白质组学相关技术，开展以苹果属植物为材料的相关研究提供了理论依据和参考。随着蛋白质组学的迅速发展，同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitat1n，iTRAQ)技术与串联质谱及多维液相色谱联用技术已成为蛋白定性和定量研究的主要工具之一，iTRAQ技术自2004年开发以来，以其独特的优势在蛋白质组学定量研究中得到了广泛的应用。蛋白质的提取是iTRAQ标记定量分析研究的关键和基础;与其他模式植物相比，苹果叶片组织中含有大量的酚、单宁等次生代谢物质，使其蛋白质的提取更为复杂。目前急需一种可将提取的蛋白质用于iTRAQ分析的蛋白质提取方法。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是如何提取可利用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对植物蛋白质组进行定量和/或定性分析的蛋白质。
[0005]为解决上述技术问题，本发明首先提供了植物组织和/或器官蛋白质提取方法。
[0006]本发明所提供的植物组织和/或器官蛋白质提取方法，包括:
[0007]I)破碎植物组织和/或器官，得到植物粉末；
[0008]2)向所述植物粉末中加入蛋白质提取液在低温环境下反应3-7分钟，得到含有蛋白质的提取液，将该提取液称为提取液I，除去所述提取液I的杂质，得到蛋白质;所述低温环境为0-6 °C ;
[0009]所述蛋白质提取液由溶剂和溶质组成;所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为:三羟甲基氨基甲烷lOOmM、乙二胺四乙酸50mM、氯化钾50mM、四硼酸钠25mM、二硫苏糖醇ImM、苯甲基磺酰氟2mM、聚乙二醇辛基苯基醚(Tri ton X-100) I % (体积百分浓度)、β_巯基乙醇5 % (体积百分浓度)和250mg/mL蔗糖，所述蛋白质提取液的pH值为8.0。
[0010]上述方法中，所述在低温环境下反应3-7分钟可为在所述低温环境下反应5分钟。[00?1 ]上述方法中，所述植物粉末与所述蛋白质提取液的比例可为(l_3)g: 5mL(如2.2g:5mL) ο
[0012]上述方法中，所述除去所述提取液I的杂质可包括:向所述提取液I中加入Tris-饱和酚(pH7.5-8.0)反应3-7分钟，得到含有蛋白质的提取液，将该提取液命名为提取液2;除去所述提取液2的杂质，得到蛋白质。
[0013]上述方法中，所述TriS-饱和?KpH7.5-8.0)可为Amersco的Amersco-0945_400ML(pH 6.6/7.9)o
[0014]上述方法中，所述反应3-7分钟可为反应5分钟。
[0015]上述方法中，所述除去所述提取液2的杂质可包括:将所述提取液2进行离心，使蛋白质进入酚相中，收集酚相，向所述酚相中加入10mM甲醇醋酸铵溶液(TC以下环境中反应8小时以上，得到含有蛋白质的沉淀，将该沉淀称为沉淀I，除去所述沉淀I的杂质，得到蛋白质；
[0016]所述10mM甲醇醋酸铵溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为甲醇，所述溶质及其浓度为醋酸钱lOOmM。
[0017]上述方法中，所述离心可在0_6°C (如4°C)下进行。所述离心的离心力可为15000 Xg。所述离心可进行20-40分钟(如30分钟)。
[0018]上述方法中，所述O0C以下环境具体可为-200C的环境。所述反应8小时以上具体可为反应10小时。
[0019]上述方法中，所述除去所述沉淀I的杂质可包括:用DTT-丙酮溶液洗涤所述沉淀，得到蛋白质;所述DTT-丙酮溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为丙酮，所述溶质及其浓度为20mM DTT0
[0020]上述方法中，所述I)可包括:向所述植物组织和/或器官中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，得到混合物，将该混合物命名为混合物I，所述混合物I中所述植物组织和/或器官的质量比为10:1;破碎所述混合物I中的植物组织和/或器官，得到所述植物粉末。
[0021 ] 上述方法中，所述破碎所述混合物I中的植物组织和/或器官可包括:将所述混合物I置于液氮环境中破碎所述混合物I中的植物组织和/或器官，得到所述植物粉末。
[0022]上述方法中，所述植物组织和/或器官可为所述植物的叶片。
[0023]为解决上述技术问题，本发明还提供了所述蛋白质提取液的下述任一应用:
[0024]X1、在提取植物蛋白质中的应用；
[0025]X2、在制备提取植物蛋白质产品中的应用；
[0026]X3、在对植物蛋白质组进行定量和/或定性中的应用；
[0027]X4、在制备对植物蛋白质组进行定量和/或定性产品中的应用；
[0028]X5、在利用同位素标记相对和绝对定量技术对植物蛋白质组进行定量和/或定性中的应用；
[0029]X6、在制备利用同位素标记相对和绝对定量技术对植物蛋白质组进行定量和/或定性产品中的应用。
[0030]上述应用中，所述产品可为试剂或试剂盒。
[0031]为解决上述技术问题，本发明还提供了所述方法的下述任一应用:
[0032]Y1、在对植物蛋白质组进行定量和/或定性中的应用；
[0033]Y2、在利用同位素标记相对和绝对定量技术对植物蛋白质组进行定量和/或定性中的应用。
[0034]本发明中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为苹果。[0035 ]为解决上述技术问题，本发明还提供了所述蛋白质提取液。
[0036]实验证明，本发明的植物组织和/或器官蛋白质提取方法，可以有效去除多酚和色素等杂质，得到的蛋白质干粉为纯白色;可用于同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对植物蛋白质组进行定量和/或定性分析。将本发明的植物组织和/或器官蛋白质提取方法得到的蛋白质利用iTRAQ技术进行定量分析时得到的蛋白质数量可达2000余个，而现有技术中的方法得到的蛋白质数量不足1000个。
【附图说明】
[0037]图1为提取的得到的蛋白质粉。其中，A为现有技术中方法获得的苹果叶片蛋白质干粉，B为本发明方法获得的苹果蛋白质干粉。
[0038]图2为苹果叶片蛋白质纯度检测结果。
[0039]图3为利用本发明方法与现有技术中蛋白质提取方法得到的蛋白质的双向凝胶电泳结果。其中，A为苹果蛋白质I双向凝胶电泳结果，B为本发明方法获得的苹果叶片蛋白质双向凝胶电泳结果，C为苹果蛋白质2双向凝胶电泳结果，D为苹果蛋白质3双向凝胶电泳结果O
【具体实施方式】
[0040]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0041 ]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0042]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043]下述实施例中的蛋白质提取液由溶剂和溶质组成;溶剂为水，溶质及其浓度分别为:三羟甲基氨基甲烷100mM、乙二胺四乙酸50mM、氯化钾50mM、四硼酸钠25mM、二硫苏糖醇ImM、苯甲基磺酰氟2mM、聚乙二醇辛基苯基醚(Tr i ton X_100) I % (体积百分浓度)、β_巯基乙醇5% (体积百分浓度)和250mg/mL蔗糖，所述蛋白质提取液的pH值为8.0。
[0044]下述实施例中的10mM甲醇醋酸铵溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为甲醇，溶质及其浓度为醋酸钱lOOmM。
[0045 ]下述实施例中的DTT-丙酮溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为丙酮，溶质及其浓度为20mM DTT0
[0046]下述实施例中的Tris-饱和酸为Amersco公司产品，货号Amersco-0945_400ML(pH6.6/7.9)o
[0047]实施例1、苹果蛋白质的提取及鉴定
[0048]1、苹果蛋白质的提取
[0049]按照如下方法提取苹果蛋白质:
[0050]I)采摘20-25d叶龄的(“华红”)苹果叶片，无菌水清洗后快速风干；向2克苹果叶片中加入0.2克聚乙烯聚吡咯烷酮，得到混合物，将该混合物命名为混合物I ；将混合物I用液氮在研钵中迅速研磨，得到植物粉末；
[0051]2)向步骤I)得到的植物粉末中加入5ml蛋白质提取液在4°C下涡旋振荡5分钟，得到含有蛋白质的提取液，将该提取液称为提取液I;向提取液I中加入是提取液I等体积的Tris-饱和酚涡旋摇荡5分钟，得到含有蛋白质的提取液，将该提取液命名为提取液2;将提取液2在40C15000 X g下离心30分钟，使蛋白质进入酚相中，收集酚相，向酚相中加入是酚相5倍体积的10mM甲醇醋酸铵溶液，-20°C条件下沉淀10小时以上，得到含有蛋白质的沉淀；用DTT-丙酮溶液洗涤沉淀三次，室温风干，得到苹果叶片蛋白质干粉，-80°C条件下保存备用。
[0052]上述提取苹果蛋白质的方法可以有效去除多酚和色素等杂质，得到的苹果叶片蛋白质干粉为乳白色(图1中B)。
[0053]苹果叶片蛋白质干粉的纯度检测结果如图2，其中泳道I，2和3均为为苹果叶片蛋白质干粉的电泳检测结果;M为标准分子量Marker。
[0054]苹果叶片蛋白质干粉样品经双向电泳分析，得到蛋白点2000余个(图3中B)。
[0055]2、苹果蛋白质的定量
[0056]步骤I得到的苹果叶片蛋白质干粉的定向过程为:苹果叶片蛋白质干粉样品—超声(5s/次XlO次)— 16000g离心40分钟—取上清—蛋白质定量—取lOOyg—FASP酶解(Trypsin，20小时)—酶解肽段—iTRAQ标记。具体如下:
[0057]向苹果叶片蛋白质干粉中加入800μ1SDT裂解液(SDT裂解液为向0.1M Tris HCl(pH 7.6)中加入SDS与DTT得到的SDS的质量百分比浓度为4%、DTT的浓度为0.1M的溶液)裂解，并加入少量石英砂和一颗陶瓷珠，用MP*FastPrep-24 5G快速样品均质器混匀组织，沸水浴15min。超声破碎(80w，超声1 s，间歇15 s，共1次)，再次沸水浴15min，高速离心30min，弃沉淀，将得到的上清液命名为上清液I。
[0058]FASP 酶解:
[0059]向含有10yg蛋白质的上清液I中加入200yL UA缓冲液(8M Urea，150mM TrisHCl，ρΗ8.0)混匀，转入1k Da超滤离心管，离心14000g 15min，弃滤液。加入200yL UA缓冲液离心14000g 15min，弃滤液。加入10yL IAA溶液(IAA溶液为向UA缓冲液中加入IAA得到的IAA浓度为50mM的液体)，600rpm振荡 lmin，避光室温30min，离心 14000g 1minc^pAlOOyL UA缓冲液，离心 14000g 1min，重复2次。加入 8μ1 Trypsin buffer (4yg Trypsin)(Sequencing Grade Modified Trypsin，Promega，Cat#V5111)，600rpm振荡lmin，37°C20ho换新收集管，离心14000g lOmin，收集滤液。0D280肽段定量(Wisniewski，J.R.，et al.,Universal sample preparat1n method for proteome analysis.Nat Methods,2009.6(5):p.359-62；Zhuang,Y.,et al.,Comparative analysis of amino acid usage andprotein length distribut1n between alternatively and non-alternativeIyspliced genes across six eukaryotic genomes.Mol B1l Evol,2003.20(12):p.1978-85.) o
[0060]iTRAQ 标记:
[0061 ] iTRAQ标记利用iTRAQ Reagent_8plex Multiplex Kit按制造商提供的流程进行，具体描述如下(详细信息如原理、所需其它试剂、实验准备等信息可在AB SCIEX的网站查询:
[0062]I)使用前取出iTRAQ标记试剂并稳定至室温(约30min)。每管试剂(channel)加入4UiL ACN，震荡使充分溶解后离心，备用。
[0063]2)将溶解好的试剂分别加入10yg样品中(即按照1:1:1:1:1:1的比例进行混合)，标记如下:
[0064]3)室温静置Ihr。
[0065]4)加入8yL轻胺，室温静置15min，终止反应。
[ΟΟ??] 5)合并6个channel的样品，震荡使充分混合。
[0067]6)除去样品中的盐等杂质，冻于-80C。未经色谱分级检测前，共检测到2000余个蛋白质。
[0068]对比例1、利用现有蛋白质提取方法提取苹果蛋白质
[0069]1、利用文献(张彩霞，陈莹，李壮，张利义，康国栋，丛佩华.苹果叶片总蛋白提取及其双向电泳分析.果树学报，2012,29(3):488-492.)中的方法提取苹果叶片蛋白质，具体方法如下:
[0070]称取-80°C冰箱中保存的苹果(‘华脆’X‘金冠’杂交群体株系)叶片1.0g，于液氮中研磨，并加入石英砂以助研至粉末状。将研磨好的粉末样品转入1mL的离心管中，悬浮于4mL|^(Tris-buffered,pH=8.0，SigmaWPdml^^HlKhomogenizat1n buffer，HB)勾楽缓冲液[20mM Tris-HCl(pH 7.5); 250mM蔗糖；1mM EGTA； ImM(PMSF) ； ImM DTT；l%Triton X-100;10%PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)]中，4°C涡旋振荡3011^11。4°(:、15 000 Xg，离心15min。收集上层酚相，加入3倍体积0.1M甲醇醋酸铵溶液，-20 °C，沉淀2h以上。4 °C、15 000 X g，离心1min，沉淀物经冷丙酮(含20mM DTT)漂洗三次，室温风干，得到蛋白质，将该蛋白质命名为苹果蛋白质I，-80°C条件下保存备用。苹果蛋白质I干粉为黄绿色(图1中A)。
[0071]利用双向电泳的方法共检测苹果蛋白质I，共检测到720个蛋白点(图3中A)。
[0072]2、利用文献(张彩霞，田义，张利义，肖龙，丛佩华.苹果属植物树皮组织总蛋白提取及分离方法的建立，植物学报，2015，50(6): 739-745)中的方法提取苹果树皮组织蛋白质，具体方法如下:
[0073]将在液氮中研磨好的苹果(“华月”)树皮组织粉末样品转入50mL的离心管中，先悬浮于1mL的匀浆缓冲液[50m mo I.[1Tris-HCl (pH 7.5); 30% (质量百分比浓度)蔗糖；100m mol.!/1EDTA; 2疏基乙醇Im mol.L^1(PMSF) ；50m mol.L—1 硼砂；Immol.L-1DTT；l%Triton X_100;5%PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)]中，4°C涡旋振荡10分钟；之后悬浮于1mL?KTris_buffered，pH=8.0，Sigma)中，4°C祸旋振荡20分钟;4°C，15 000 Xg，离心 15分钟；收集上层酚相，加入3倍体积0.1mol.L—1甲醇醋酸铵溶液，-20°C，沉淀4小时。4°C，15 000Xg，离心10分钟，沉淀物经冷丙酮(含20mmol.!/1DTT)漂洗三次，室温风干，将得到的蛋白质命名为苹果蛋白质2，-80°C条件下保存备用。
[0074]利用双向电泳的方法检测苹果蛋白质2，共检测到993个蛋白点(图3中C)。
[0075]3、利用文献(张彩霞，田义，张利义，肖龙，康国栋，丛佩华.苹果枝条表皮应答轮纹病菌侵染的蛋白质组学分析.植物病理学报，2015，45(3): 280-287.)中的方法提取苹果枝条表皮蛋白质，具体方法如下:
[0076]迅速称取-80°C冰箱中保存的苹果(“嘎啦”X “华富”)Fi代杂种实生苗株系)树皮组织5.0g，于液氮中研磨，并加入石英砂以助研至精细粉末状。
[0077]将研磨好的粉末样品转入50mL的离心管中，悬浮于10!111^酸(1'1^8-131^€6作(1，卩!18.0，Sigma)和1mL的提取液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，300mM蔗糖，1mM EGTA,ImM PMSF，ImM DTT；l%Triton X-100，10%PVPP)中，4°C下涡旋振荡ISminJcC，5 000g，离心 15min。收集上层酚相，加入5倍体积0.1M甲醇醋酸铵溶液，-200C，沉淀2h以上。4°C，15 OOOg，离心1min，沉淀物经冷丙酮(含20mM DTT)漂洗3次，室温风干，得到蛋白质，将该蛋白质命名为苹果蛋白质3，-80°C条件下保存备用。
[0078]利用双向电泳的方法共检测苹果蛋白质3，共检测到978个蛋白点(图3中D)。
【主权项】
1.植物组织和/或器官蛋白质提取方法，包括: 1)破碎植物组织和/或器官，得到植物粉末； 2)向所述植物粉末中加入蛋白质提取液在低温环境下反应3-7分钟，得到含有蛋白质的提取液，将该提取液称为提取液I，除去所述提取液I的杂质，得到蛋白质;所述低温环境为 0-6。。； 所述蛋白质提取液由溶剂和溶质组成;所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为:三羟甲基氨基甲烷lOOmM、乙二胺四乙酸50mM、氯化钾50mM、四硼酸钠25mM、二硫苏糖醇ImM、苯甲基磺酰氟2mM、聚乙二醇辛基苯基醚I % (体积百分浓度)、β_巯基乙醇5 % (体积百分浓度)和25mg/mL蔗糖，所述蛋白质提取液的pH值为7.5-8.0。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述除去所述提取液I的杂质包括:向所述提取液I中加入Tris-饱和酚反应3-7分钟，得到含有蛋白质的提取液，将该提取液命名为提取液2;除去所述提取液2的杂质，得到蛋白质;所述Tris-饱和酚的pH为7.5-8.0。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述除去所述提取液2的杂质包括:将所述提取液2进行离心，使蛋白质进入酚相中，收集酚相，向所述酚相中加入10mM甲醇醋酸铵溶液(TC以下环境中反应8小时以上，得到含有蛋白质的沉淀，将该沉淀称为沉淀I，除去所述沉淀I的杂质，得到蛋白质； 所述10mM甲醇醋酸铵溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为甲醇，所述溶质及其浓度为醋酸铵lOOmM。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述除去所述沉淀I的杂质包括:用DTT-丙酮溶液洗涤所述沉淀，得到蛋白质；所述DTT-丙酮溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为丙酮，所述溶质及其浓度为20mM DTT。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述I)包括:向所述植物组织和/或器官中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，得到混合物，将该混合物命名为混合物I，所述混合物I中所述植物组织和/或器官的质量比为10:1;破碎所述混合物I中的植物组织和/或器官，得到所述植物粉末。6.权利要求1中所述的蛋白质提取液的下述任一应用: X1、在提取植物蛋白质中的应用； X2、在制备提取植物蛋白质产品中的应用； X3、在对植物蛋白质组进行定量和/或定性中的应用； X4、在制备对植物蛋白质组进行定量和/或定性产品中的应用； X5、在利用同位素标记相对和绝对定量技术对植物蛋白质组进行定量和/或定性中的应用； X6、在制备利用同位素标记相对和绝对定量技术对植物蛋白质组进行定量和/或定性产品中的应用。7.权利要求1-5中任一所述的方法的下述任一应用: Y1、在对植物蛋白质组进行定量和/或定性中的应用； Y2、在利用同位素标记相对和绝对定量技术对植物蛋白质组进行定量和/或定性中的应用。8.根据权利要求1-5中任一所述的方法或权利要求6或7所述的应用，其特征在于:所述植物为双子叶植物或单子叶植物。9.根据权利要求8所述的方法或应用，其特征在于:所述植物为苹果。10.权利要求1中所述的蛋白质提取液。
【文档编号】C07K1/14GK105859831SQ201610239670
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月18日
【发明人】张彩霞, 田义, 张利义, 丛佩华
【申请人】中国农业科学院果树研究所