一种用于靶向治疗的多肽和核酸偶联化合物的制作方法
【专利摘要】本发明公布了一种用于靶向治疗的多肽和核酸偶联化合物。在作为效应分子的核酸和作为靶分子的多肽[D?Lys6]GnRH上分别引入炔烃基团和叠氮基团，然后通过click点击化学反应，合成具有靶向作用的多肽和核酸偶联化合物，可应用于肿瘤的靶向治疗。
【专利说明】
一种用于靶向治疗的多肽和核酸偶联化合物
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种多肽和核酸的偶联化合物及其制备方 法，以及该化合物在疾病靶向治疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 1998年，Fire等发现了RNA干扰(RNA interference，RNAi)能特异性的降解目的基 因的mRNA(Fire A，Xu S，Montgomery MK，Kostas SA，Driver SE，Mello CC.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans .Nature · 1998; 391:806-11 ·)。介导该现象的是双链的siRNAJOOI年，Elbashir等 成功的用体外合成的双链s iRNA沉默了哺乳动物细胞内相关基因的表达，为s iRNA类基因治 疗型药物的发展奠定了基础（Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，Yalcin A，Weber K, Tuschl T.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature.2001 ;411:494-8.)。但是，由于siRNA相对分子量较大（14000Da 左右)且带有大量的负电荷，无法顺利穿越细胞膜到达细胞内，并容易从尿内排出，再外加 siRNA自身的不稳定性、易被降解、半衰期短、易引起免疫反应、难以从核内体中逃逸等因 素，这些都导致siRNA生物利用度降低，影响其临床应用。如何提高siRNA体内的生物利用 度，是siRNA能否广泛利用的关键。利用载体递送siRNA，是一种有效的方法。脂质体和聚合 物都可用于siRNA的载体，但都面临像毒性大、靶向性不强甚至脱靶以及微粒大小控制困难 等问题。而蛋白类载体可以很好地克服这些问题，其中最常见的有细胞穿透肽和单链抗体。 Andaloussi等设计了一种新型的多肽PepFect 6(PF6)(Andaloussi SE，Lehto T,Mager I， Rosenthal-Aizman K，Oprea，11，Simonson OE,et al.Design of a peptide-based vector,PepFect6,for efficient delivery of siRNA in cell culture and systemically in vivo.Nucleic Acids Res.2011;39:3972_87.)，PF6与HPRTl (hypoxanthine phosphoribosyltransferasel)siRNA通过非共价复合形成PF6/siRNA混合 物，该复合物在体外实验展现出很高的递送效率，并且在动物试验中，通过静脉注射PF6/ siRNA可以有效地沉默肝、肾和肺部的HPRTlmRNA水平。但因为该多肽和核酸形成的是混合 物，导致混合物的形成条件、保存以及标准化都带来非常大的困难。
[0003] 单链抗体（single chain of variable fragments,scFv)由于具备革巴向性好、分 子量小、穿透性强等特点而被用作siRNA载体。由于scFv与siRNA结合性较差，常需要一个多 肽充当连接器。其中富含碱性氨基酸具备与核酸结合功能的鱼精蛋白截短体(truncated protamine，tp)是最常见的连接器。具体方法就是将scFv与tp通过基因重组获得scFv-tp融 合蛋白。scFv-tp同时具有scFv的革El向性和tp的siRNA结合性，从而成为稳定的siRNA递送载 体。scFv-tp依托scFv的特异性，通过与细胞表面的特异性受体结合进而将siRNA递送至靶 细胞内，减少了siRNA的脱靶效应。早在2005年，Song等就用gpl60-scFv(F105)与tp的融合 蛋白F105-P作为载体将EGFP siRNA递送至小鼠体内被HIV感染的CD4T细胞中，有效地沉默 目的基因的表达，抑制了HIV病毒复制，并且在动物模型中，F105-P介导的多种原癌基因 siRNA的体内递送也收获巨大的成功（Song E，Zhu P，Lee SK，Chowdhury D，Kussman S, Dykxhoorn DM,et al.Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors.Nat Biotechnol.2005;23:709-17·)。这些结果强有 力的证明了 scFv-tp作为siRNA载体在体内递送的可靠性和高效特异性。之后，Yao等用类似 的方法用人类表皮生长因子2(human epidermal growth factor receptor 2，Her2)受体 的scFv^p融合蛋白将PLKl-siRNA成功递送至Her2+的乳腺癌细胞系中，并且在动物模型中 也能有效地抑制肿瘤的增殖和转移(Yao YD，Sun TM，Huang SY，Dou S，Lin L，Chen JN，et al. Targeted delivery of PLKl-siRNA by ScFv suppresses Her2+breast cancer growth and metastasis.Science translational medicine.2012;4:130ra48.) 〇在这些 应用中，都用到了基因技术，包括基因克隆、细菌表达、分离纯化等复杂步骤，过程复杂、技 术难度大，对人体和环境还可能带来一些安全问题。
[0004] 由上可见，多肽或者蛋白可以作为核酸的载体，用于把短的siRNA带入体内，发挥 其基因沉默作用，特异性的沉默靶基因的表达从而达到治疗的目的。为了更好地发挥多肽 的载体作用，还需要克服一系列的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种多肽和核酸偶联的化合物，其中多肽结构部分赋予其靶 向性，引导该化合物定向达到靶分子，核酸作为效应分子，可以沉默目的基因，抑制肿瘤的 生长，发挥肿瘤治疗作用。
[0006] 本发明的多肽和核酸偶联化合物包括共价连接的多肽和核酸两部分，其结构如下 式I所示"
[0007；
[0008] 式I中，nucleic acid代表核酸，是具有治疗效应的分子，如siRNA、反义核酸、 aptamer(核酸适配体)等；多肽部分是[D-Lys6]GnRH(见序列表中SEQ ID No:l)，具有革巴向 作用，通过D-Lys残基上的一个氨基与式I中所示羰基形成酰胺键。
[0009] GnRH(Gonadotropin_Releasing Hormone，促性腺激素释放激素）也称作LHRH (Luteinising-hormone releasing hormone，促黄体激素释放激素），是体内自然存在的一 种激素，最初是从哺乳类下丘脑分离出的一种十肽激素，其基本生理功能是调节垂体前叶 促性腺激素的分泌，在控制和调节哺乳动物生殖功能中发挥重要作用。GnRH发挥其生物学 功能必须要通过GnRHR(GnRH-Receptor，GnRH受体)来介导。GnRHR属于类视紫红质G蛋白偶 联受体家族(GPCR)中的一员，是具有7次跨膜结构的蛋白受体。近年的研究发现，卵巢、子宫 内膜、前列腺、等生殖系统肿瘤细胞表面均有GnRH结合位点，GnRH受体(GnRHR)表达量较高， 而高表达的GnRHR是为抗肿瘤治疗提供了潜在靶点。GnRH类似物已经被广泛用于生殖系统 疾病的治疗，其中以[D-Lys 6]GnRH为基本骨架的类似物最为常见。而siRNA作为一种广泛存 在的基因调控机制，理论上可以沉默任何高表达的基因。肿瘤通常都会找到一些肿瘤相关 基因的高表达，这些基因的表达对肿瘤的生长、转移起重要作用，如果敲除这些基因，能够 有效地抑制肿瘤的生长和转移。在本发明的一些具体实施例中，通过[D-Lys 6]GnRH作为靶 分子，把效应分子siRNA带到表达GnRH受体的肿瘤细胞，以siRNA特异性的模式沉默肿瘤相 关基因，达到靶向治疗肿瘤的目的。
[0010]本发明的多肽和核酸偶联化合物是通过如下方法制备的:在作为效应分子的核酸 和作为靶分子的多肽上分别引入炔烃基团和叠氮基团，然后通过click点击化学反应，形成 均一稳定的化合物。反应式如下所示：
[0011
[0012] 上述CI ick点击化学反应可以以二甲亚砜(DMSO)、叔丁醇（t-BuOH)和水作为溶剂， CuS〇4 · 5H2〇-TBTA配合物和抗坏血酸钠作为催化剂，室温下反应2~5小时。
[0013]为了方便GnRH的叠氮修饰，在GnRH的第六位通过多肽合成引入D-Lys，D-Lys的一 个氨基用于形成氨基酸残基之间的肽键，另个氨基用于引入叠氮基团。[D-Lys6]GnRH与叠 氮戊酸发生酰化反应，从而在多肽上引入叠氮基团，反应方程式如下：
[0014]
L〇〇15」对于效应分子，在其5'或：T端偶联上炔烃基团。例如对于一段siRNA双链，为了减 少引入的炔烃基团对siRNA干扰效率的影响，采用亚磷酰胺的固相合成法，通过siRNA与3-丁炔-1-醇反应，从而将丁炔基引入核酸正义链的5 '末端或3 '末端。
[0016]通过c lick反应，将上述经过修饰的多肽和核酸联合到一起，再通过产物的分离纯 化，最终获得目标产物。
[0017]本发明通过在效应分子核酸上引入炔烃基团，在[D-Lys6]GnRH多肽上引入叠氮基 团，通过click反应，得到一个稳定的化合物，该化合物保留了 [D-Lys6]GnRH的靶向性，和效 应分子核酸的基因沉默作用。作为特异性靶向药物，本发明的多肽和核酸偶联化合物可应 用于肿瘤的靶向治疗。
【附图说明】
[0018]图1为实施例1中不同浓度的[D-Lys6(FITC) ]GnRH和细胞上受体的结合曲线。
[0019]图2为实施例1中确定[D-Lys6(FITC) ]GnRH和细胞最佳结合浓度的验证曲线。
[0020] 图3显示了实施例1中[D-Lys6(FITC) ]GnRH与普通GnRH竞争抑制实验结果，横坐标 代表8个实验，从第1至第8个实验[D-Lys6(FITC) ]GnRH与GnRH浓度比依次为1:0，I: I，1:2，1 :4，1:8，1:16，1:32和0:0〇
[0021] 图4显示了实施例1中[D-Lys6(FITC) ]GnRH和GnRHR抗体封闭抑制试验结果。
[0022]图5为实施例2合成化合物的化学反应式。
[0023] 图6为实施例2合成的[D-Lys6]GnRH-siRNA用UPLC分离纯化的色谱峰。
[0024] 图7为实施例2合成的化合物[D-Lys6]GnRH-siRNA用UPLC-ESI-MS验证的质谱图。
[0025]图8显示了实施例3验证[D-Lys6]GnRH-siRNA具有生物学活性的实验结果，说明该 化合物可以敲除目的基因。
[0026]图9.显示了实施例3测试[D-Lys6]GnRH-siRNA对靶基因沉默作用的量效关系的结 果。
[0027]图10显示实施例3中化合物[D-Lys6]GnRH-siRNA对靶基因的沉默作用可以通过封 闭细胞表面的受体而阻止，说明其沉默效果是受体依赖性的特异性沉默。
【具体实施方式】
[0028]以下通过实施例对本发明做进一步说明，以便更好地理解本发明，但本发明并不 局限于此。
[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法;下述实施例中所 用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030] 实施例1叠氮标记的GnRH多肽具有靶向性和特异性
[0031] 选取GnRHR高表达的Hela细胞作为实验细胞，来验证Hela细胞对不同浓度梯度的
[D-Lys6]GnRH的结合情况。将Hela细胞接种于6孔板中，待细胞汇合度达到70%~80%时， 分别加入不同浓度的荧光标记的[D-Lys6(FITC) ]GnRH(购自北京中科亚光生物科技有限公 司），6h后，用胰酶将细胞消化下来，离心弃上清;再用PBS重悬，离心弃上清（重复三次），去 除未结合的[D-Lys 6(FITC)]GnRH，最后加入0.5mL PBS，重悬，上流式细胞仪(BD公司）检测， 流式结果使用Flowjo 7.6.1软件进行分析，结果见图1。从图1可见，[D-Lys6(FITC) ]GnRH和 细胞上受体的结合是剂量依赖性的，直到把细胞上所有的受体都结合。紧接着，我们进一步 验证了 [D-Lys6(FITC) ]GnRH饱和结合浓度，如图2所示，当浓度达到300yg/mL时，平均荧光 强度达到最大值，随着浓度增加，荧光强度不在相应增加，因此，我们判断300yg/mL为饱和 结合浓度。
[0032]验证完[D_Lys6]GnRH与Hela细胞结合的最佳浓度后，我们通过竞争性抑制实验进 一步验证了 [D-Lys6]GnRH与GnRHR的特异性。竞争抑制实验又分为正常GnRH竞争抑制跟 GnRHR抗体竞争抑制。在以正常的GnRH作为竞争剂的抑制试验中，先将Hela细胞接种于12孔 板中，在细胞汇合度达到70%~80%时，加入终浓度为300yg/mL的[D-Lys 6(FITC) ]GnRH，再 加入不同浓度比例的GnRH( [D-Lys6(FITC) ]GnRH与GnRH浓度比分别为1:0,1:1，1:2,1:4,1: 8，1:16，1:32以及0:0) Ah后，收集细胞，用I3BS洗三次，和上文一致，上流式细胞仪检测。结 果如图3所示，随着GnRH比例的逐渐增加，平均荧光强度不断降低，由此可以看出[D-Lys 6] GnRH与GnRH可以竞争性结合GnRHR，也即是说[D-Lys6]GnRH可以特异性结合GnRHR。
[0033] 在抗体抑制试验中，将细胞平均分成三组，分别为control组，anti-GnRHR( + )组和 ant i -GnRHR (-)组。在细胞汇合度达到70%~80%时，Contro 1组不做任何处理;ant i -GnRHR (_)组加入终浓度为 300yg/mL 的[D-Lys6(FITC)]GnRH;anti-GnRHR( + )组提前用 5%BSA 在 37 °C条件下封闭30分钟后用过量的GnRHR单克隆抗体再预处理2小时，再加入终浓度为300yg/ mL的[D-Lys6(FITC) ]GnRH Ah后，收集细胞，用PBS洗三次，上流式细胞仪检测，结果如图4所 示。从图4可以看出，[D-Lys6(FITC) ]GnRH多肽和受体的结合可以被抗体阻止。
[0034] 实施例2[D-Lys6]GnRH-siRNA的合成、分离、纯化和验证
[0035] 本实施例通过click反应合成[D-Lys6]GnRH-siRNA，然后通过UPLC对产物进行分 离纯化，并通过UPLC-MS对产物进行验证。
[0036] 实验材料及试剂：[D_Lys6(azidopentanonicacid) ]GnRH(由北京中科亚光生物科 技有限公司合成），正义链5 '端丁炔基修饰的PLKl siRNA(正义链：5 ' -CH三C-CH2-CH2 (mU) GAAGAAGA(mU) (mC)A(mC) (mC) (mC) (mU) (mC) (mC) (mU) (mU)A dTdT-3 '（序列中 "m" 代表2 ' 位 甲氧基修饰即2'-0Me，下同，参见SEQIDNo:2)，反义链：5'-UAAGGAGGGUGAUCUUCUUCA dTdT-3'（SEQIDNo :3)，购自广州锐博生物科技有限公司），二甲亚砜(DMS0)，CuS04·5H20， 叔丁醇（t _BuOH)，TBTA(tris(benzyltriazolylmethyl)amine)，UPLC，ESI_Orbitrap MS。
[0037] 色谱柱：Jupiter 300A 5u C18(150X4.6mm)
[0038] 合成步骤如下：吸取50yL，lOmmol/L的[D_Lys6(azidopentanonicacid) ]GnRH(溶 剂为DMSO/t-BuOH:3/1，体积比）加入至IOOyL 0·5mmol/L的SiRNA-CH2-CH2-C三CH水溶液中， 再分别加入4yL 0.1M的CuS〇4 · 5H2〇-TBTA配合物（体积比1/1)(配合物溶剂为出0/^30八-BuOH: 13.5/3.5/3，体积比）和4yL 0.8M的抗坏血酸钠水溶液，室温下搅拌三个小时。化学反 应方程式见图5。
[0039]反应结束后，使用3KD的超滤管(购自德国millipore)处理反应体系，收集截留物。 再使用UPLC进行分离纯化，分离条件如下:流动相A = O.02M TEAA(三乙胺醋酸盐，pH=7.4) 的H20/CH3CN(体积比95/5)溶液;流动相B = MeOH;洗脱梯度为100%A lmin，100/0~20/80 (八/13)3〇111；[11，100%13 6111；[11;流速：111117111；[11;进样量：1(^1^分离纯化的结果见色谱图6。纯化 完后冻干，加水溶解后再使用UPLC-ESI-MS验证纯化产物的分子量，结果见图7，正义链测量 值 8912.68(111/2,2 = 4,2227.17;标准值8911.57)，反义链测量值7322.82(111/2,2 = 4， 1829 · 45;标准值7322 · 50)，总链测量值 16234 · 49(m/z，z = 6，2704 · 75;标准值 16234 · 07)。 [0040] 实施例3CLICK反应后的[D-Lys6]GnRH-siRNA活性验证
[0041 ] 为了验证click反应后的产物[D-Lys6]GnRH-siRNA的生物学活性，我们通过将[D-Lys6]GnRH_siRNA转染Hela细胞后通过qPCR来检测plkl的表达水平来验证。Hela细胞在转 染前一天接种至24孔板中，每孔细胞数目为5 X 104,转染时要求细胞密度能达到30%~ 50%。转染时将细胞平均分为四组，分别为空白组(Blank)、阴性对照组(NC)、PLK1组(P+)和 click产物组(Click+)。空白组不经过任何处理，阴性对照组使用lipofectamine 2000(以 下简写为lip2000)转染稳定的无关序列的siRNA(正义链5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3' (SEQIDNo :4);反义链：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'（SEQIDNo :5))，P+组用 lip2000转染正常的PLKlsiRNA(正义链5 ' -(mU)GAAGAAGA(mU) (mC)A(mC) (mC) (mC) (mU) (mC) (mC)(mU)(mU)A dTdT-3'（SEQ ID No:2);反义链：5'-UAAGGAGGGUGAUCUUCUUCAdTdT-3'（SEQ ID如：3))，(：1丨^^+组使用1丨？2000转染(31丨^^产物[0-1^8 6]611冊-8丨1?嫩，各组8丨1?嫩的终浓 度为90nM。转染后4h换液，30h进行细胞总RNA提取，进而再用qPCR来分析各组的PLKlmRNA的 表达含量。
[0042] 如图8所示，P+组跟click+组相比于NC组PLKlmRNA水平显著性降低(p〈0.01)，且P+ 与click+组无显著性差异，实验结果表明，click产物[D-Lys6]GnRH-siRNA具有完整的 PLKl s iRNA生物学活性的基础。
[0043] GnRH-s iRNA 特异性验证
[0044] 本实验主要目的是验证click产物[D-Lys6]GnRH-siRNA是否保留了 GnRH作为载体 的特异性。
[0045] 同上，我们也是运用了qPCR的方法来验证click产物[D-Lys6]GnRH_siRNA是否可 以借助自身的[D_Lys6]GnRH的特异性而穿透细胞膜进入细胞内起到特异性的沉默作用。首 先，我们探索了 [D-Lys6]GnRH-siRNA的特异性沉默PLKl的量效关系，将Hela细胞接种于24 孔板，当细胞汇合度到达50%时，直接加入不同终浓度的[D-Lys6]GnRH-siRNA(终浓度分别 为3〇1^，6〇1^，90碰，12〇1^，15〇1^)，3011后，进行总1?祖提取以及9?0?分析，量效关系结果如 图9所示，当[D-Lys 6]GnRH-siRNA浓度达到90nM时，PLKl沉默效果最佳。
[0046]细胞平均分为四组，分别为1313111<:组，？11<:1组，(]1;[01^1'0组以及(]1;[01<:+3111:;[组。 Blank组不做任何处理;Plkl组将正常的PlklsiRNA在不加载体的情况下直接加入培养基中 (终浓度为90nM);Clickpro组是将click产物[D-Lys 6]GnRH-siRNA(终浓度为90nM)直接加 入培养基中；Click+anti组将细胞提前用5%BSA在37°C条件下封闭30分钟后，用过量的 GnRHR单克隆抗体再预处理2小时提，移除抗体，加入新鲜培养基，再加入[D-Lys6]GnRH-siRNA(终浓度为90碰）。2411后，提取总RNA，继而进行qPCR实验和分析。结果见图10,首先， Clickpro组相比于Plkl组，PLKlmRNA水平显著性降低，说明[D-Lys6]GnRH-siRNA可以不借 助载体亦能沉默目的基因的表达，其次，Clickpro组相比于Cl ick+anti组，PLKlmRNA水平也 显著性降低，也就是说[D-LyS6]GnRH-siRNA对靶基因的沉默作用可以通过封闭细胞表面的 受体而阻止，说明其沉默效果是受体依赖性的特异性沉默。
【主权项】
1. 一种多肽和核酸偶联化合物，包括共价连接的多肽和核酸两部分，其结构式I所示：式I中，nucleic acid代表核酸，多肽部分是[D-Lys6]GnRH，其D-Lys残基上的一个氨基 与式I中所示羰基形成酰胺键。2. 如权利要求1所述的多肽和核酸偶联化合物，其特征在于，所述核酸的连接位置在其 5'端或3'端。3. 如权利要求1所述的多肽和核酸偶联化合物，其特征在于，所述核酸是siRNA、反义核 酉爱或aptamer。4. 如权利要求3所述的多肽和核酸偶联化合物，其特征在于，所述核酸是PLK1 siRNA。5. 权利要求1所述多肽和核酸偶联化合物的制备方法，在核酸和多肽上分别引入炔烃 基团和叠氮基团，然后通过click点击化学反应形成所述化合物，反应式如下：6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述click点击化学反应以二甲亚砜、叔 丁醇和水作为溶剂，CuS〇4 · 5H2〇-TBTA配合物和抗坏血酸钠作为催化剂，室温下反应2~5小 时。7. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，首先合成[D-Lys6]GnRH多肽，然后将其与 叠氮戊酸发生酰化反应，从而在多肽上引入叠氮基团，反应式如下：8. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在核酸上引入炔烃基团的方式是采用亚 磷酰胺的固相合成法，通过siRNA与3-丁炔-1-醇反应，从而将丁炔基引入核酸正义链的5' 末端或3'末端。9. 权利要求1~4任一所述的多肽和核酸偶联化合物在制备特异性靶向药物中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述特异性靶向药物为肿瘤治疗药物。
【文档编号】C07K7/06GK105859834SQ201610224190
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】李军, 陈中华, 朱德生
【申请人】北京大学