Ace抑制十肽的赖氨酸甲基化衍生物及其制备方法

文档序号:10503778
Ace抑制十肽的赖氨酸甲基化衍生物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种ACE抑制十肽的赖氨酸甲基化衍生物及其制备方法。本发明ACE抑制十肽的赖氨酸甲基化衍生物:其命名为YQK(Me)FPQYLQY,其氨基酸序列为Tyr?Gln?Lys(Me)?Phe?Pro?Gln?Tyr?Leu?Gln?Tyr。本发明制备方法如下:称取1g王树脂放入反应器中,加入二氯甲烷溶胀,加入序列中第一个氨基酸:1mmol当量的L型酪氨酸;添加试剂鼓泡反应后洗净,然后依次Gln、Lys(Me)、Phe、Pro、Gln、Tyr、Leu、Gln、L?Tyr,反应结束后得到粗肽产物。本发明在保持ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的降血压活性的同时,提高了其热稳定性、酸碱稳定性和消化稳定性,以便于该ACE抑制十肽在工业化的生产及流通环节中能够保持其活性。
【专利说明】
ACE抑制十肽的赖氨酸甲基化衍生物及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物技术领域,具体的说是涉及利用甲基化技术对提取自酪蛋白的 ACE抑制十肽YQKFPQYLQY进行修饰,从而提高该多肽的稳定性。
【背景技术】
[0002] 随着现代社会发展的不断进步,生活节奏的不断加快,生活方式也随之发生了很 大变化,高脂高糖高盐食物的摄入越来越多,运动量却逐渐减少,这种不良的生活方式导致 高血压患病率逐年增加,且呈现一定的年轻化趋势。
[0003] 高血压有原发性高血压和继发性高血压两种类型。原发性高血压患者占总高血压 患者的95%以上,由原发性高血压所引起的脑卒中、冠心病等,在总患病率和总死亡率中所 占的比例日益增高。高血压发病期间,人们往往会服用一些辅助性降压药,目前,常用的降 压药主要有受体阻滞剂、利尿降压药、钙通道阻滞剂(CCB)、血管紧张素转换酶抑制剂 (ACEI)和血管紧张素 Π 受体拮抗剂(ARB)等。这些降压药物在一定程度上确实起到了降压 的作用,但同时也会给服药者带来很大的毒副作用。例如利尿降压药可能会造成患者血糖、 血胆固醇、血尿酸和甘油三酯升高及血清钾降低等危害。β-受体阻滞剂会引起眩晕、疲惫、 嗜睡、胃肠紊乱(恶心、腹泻)等,还可以引起严重的心动过缓、诱发急性心力衰竭或支气管 哮喘、四肢冷厥及雷诺现象等。
[0004] 人们发现通过水解某些食品蛋白质可以得到具有降压效果的多肽,这种来源于天 然食品的ACE(angiotensin converting enzyme)抑制肽具有更高的安全性,而且对正常血 压无降压作用,因此成为了目前预防和治疗高血压最具开发价值的产品之一。
[0005] 在食源性生物活性肽中,又以乳源生物活性肽作用显著。它是指与乳中某些蛋白 质肽链的某些片段相同或相似,在乳中固有的或在乳蛋白降解过程中产生的具有生物活性 的肽类。随着不同功能的乳源性活性肽的发现,对乳蛋白质的研究已成为生理学界和营养 学界的研究热点。
[0006] 酪蛋白(casein)是乳中含量最丰富的蛋白质,在其大分子中含有多种具有生物活 性的小分子片段,在不同蛋白酶的作用下,可释放出具有不同功能的分子片段,ACE抑制十 肽就是其中的一种。近年来国内外研究结果表明,当乳中酪蛋白在生物体内或食品加工过 程中用酶消化时,可以产生大量ACE抑制十肽,这些ACE抑制十肽具有无副作用、安全性高和 易吸收等优点。
[0007] 本课题组前期通过对酪蛋白进行胃蛋白酶及胰蛋白酶水解,从水解产物中分离纯 化得到具有ACE抑制活性的片段,并对其进行测序,得到的ACE抑制十肽序列为YQKFPQYLQY。 (具体过程参看专利CN 103275176 A)
[0008] N-甲基-α-氨基酸是很多具有生物活性生物天然产物的重要组成部分。对α-氨基 酸的N-甲基化修饰会影响多肽与受体的相互作用,和没经过甲基化修饰的前体相比生物活 性可能会发生改变。同时,包含N-甲基氨基酸的多肽类似物具有更高的抗蛋白酶降解能力。 因此,N-甲基氨基酸常作为氨基酸和多肽衍生物构象研究的工具。

【发明内容】

[0009] 本发明的目的是保持ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的降血压活性的同时,提高其热稳 定性、酸碱稳定性和消化稳定性,以便于该ACE抑制十肽在工业化的生产及流通环节中能够 保持其活性。本发明将ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的第三个氨基酸赖氨酸进行甲基化修饰后, 衍生物能够满足上述要求,因而该甲基化衍生物适合于加工为保健食品或药品。
[0010] 为实现本发明的目的所采用的技术方案如下:
[0011] -种ACE抑制十肽的赖氨酸甲基化衍生物的制备方法,按照下述步骤进行:
[0012] 1)称取Ig王树脂放入反应器中,加入二氯甲烷溶胀半小时,然后抽掉二氯甲烷,加 入序列中第一个氨基酸:Immol当量的L型酪氨酸,Immol的N,N-二异丙基碳二亚胺;Immol的 4_二甲氨基R比啶,6-10ml的富马酸二甲脂溶液,用氮气鼓泡反应3h;然后加入1mlR比啶,Iml 乙酸酐,反应半小时,抽掉反应液,用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗净;
[0013] 2)加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基,洗净,并用茚三酮检测;
[0014] 3)向反应器中加入序列中第二个氨基酸谷氨酰胺(Gln)3mm〇l,3mm〇l 1-羟基苯并 三氮唑及N,N-二异丙基碳二亚胺,氮气鼓泡反应一小时,抽掉液体,用二甲基甲酰胺洗净, 并用茚三酮检测;
[0015] 4)依步骤2、3的方式依次加入序列中第三个氨基酸Ly s (Me )、第四个氨基酸Phe、第 五个氨基酸Pro、第六个氨基酸Gln、第七个氨基酸Tyr、第八个氨基酸Leu、第九个氨基酸 Gln、第十个氨基酸L-Tyr,直至最后第十个氨基酸L-Tyr反应结束,其中第三个氨基酸为经 过甲基化的赖氨酸;
[0016] 5)加6-10ml的95%三氟乙酸切割液,震荡反应2h,将氨基酸的侧链保护基团裂解 下来,得到粗肽产物;
[0017] 6)分析提纯和质谱检测:用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪检测该序列分 子量的正确性,用高效液相色谱将粗肽提纯至90%纯以上;
[0018] 7)收集步骤6)纯化好的目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩冻干,冻干成白色粉 末得到ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化衍生物。
[0019]所述ACE抑制十肽的赖氨酸甲基化衍生物:其命名为YQK (Me )FPQYLQY,其氨基酸序 列为 Tyr-Gln-Lys (Me)-Phe-Pro-Gln-Tyr-Leu-Gln-Tyr 〇
[0020] 相对于现有技术,本发明具有如下有益效果:
[0021] 1.本发明是在前期研究所获得的酪蛋白源ACE抑制十肽a2f(98-107):YQKFPQYLQY 的基础上,对序列上的赖氨酸进行甲基化修饰得到的新的ACE抑制十肽YQK (Me) FPQYLQY。经 体外实验和体内实验证实,该多肽具有抑制血管紧张素转换酶的活力和降血压功能。
[0022] 2.在ACE抑制十肽的甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY的制备上,不采用水解蛋 白一一纯化多肽一一基团修饰这一传统技术路线,而是采用固相合成技术进行化学合成, 其中赖氨酸先甲基化修饰,而后再连接到多肽序列上。
[0023] 3.本发明的活性多肽YQK(Me)FPQYLQY的热稳定性、酸碱稳定性和消化稳定性较原 序列均有所提尚。稳定性的提尚,使得修饰后的ACE抑制十妝在生广加工、臧、运输和销售 的过程中性质更加稳定,因而更适合开发为保健食品或药物。同时,修饰后的ACE抑制十肽 酸碱稳定性和消化稳定性更好,使其在消化道内更不易被人体消化酶所降解,从而能够稳 定发挥降血压的作用。
[0024] 4.本发明的ACE抑制十肽的甲基化修饰衍生物YQK (Me) FPQYLQY制备方法简单,易 于提纯,纯度尚。
【附图说明】
[0025] 图1所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的ACE抑制率;
[0026] 图2所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY 的ACE抑制率;
[0027]图3所示为灌胃ACE抑制十肽YQKFPQYLQY对SHR大鼠血压的影响;
[0028] 图4所示为灌胃ACE抑制十肽YQKFPQYLQY对Wistar大鼠血压的影响;
[0029]图5所示为灌胃ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me) FPQYLQY对SHR大鼠血压的影响;
[0030] 图6所示为灌胃ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me) FPQYLQY对Wistar大鼠血压的影响;
[0031] 图7所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的热稳定性结果;
[0032] 图8所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY 的热稳定性结果;
[0033]图9所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的酸碱稳定性结果;
[0034] 图10所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY 的酸碱稳定性结果;
[0035]图11所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY模拟胃液消化稳定性结果;
[0036]图12所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY模拟肠液消化稳定性结果;
[0037] 图13所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY 的模拟胃液消化稳定性结果;
[0038] 图14所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY 的模拟肠液消化稳定性结果。
【具体实施方式】
[0039]以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0040] 实施例1 :ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化衍生物YQK(Me)FPQYLQY的制备 [0041] 1.称取Ig wang树脂放入反应器中,加入DCM(二氯甲烷)溶胀半小时,然后抽掉 DCM,加入序列中第一个氨基酸:Immol当量的L型酪氨酸,Immol的DIC(N,N-二异丙基碳二亚 胺);Immol的4-二甲氨基吡啶,适量6-10ml的富马酸二甲脂溶液,用氮气鼓泡反应3h;然后 加入1ml吡啶,Iml乙酸酐,反应半小时,抽掉反应液,用DMF(二甲基甲酰胺)、DCM洗净;
[0042] 2.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基,洗净,茚三酮检测;
[0043] 3.向反应器中加入序列中第二个氨基酸:3111111〇1谷氨酰胺(6111),3 111111〇11-羟基苯 并三氮唑及DIC,氮气鼓泡反应一小时,抽掉液体,用DMF洗净,茚三酮检测;
[0044] 4.依步骤2、3的方式依次加入序列中第三个氨基酸Lys (Me )、第四个氨基酸Phe、第 五个氨基酸Pro、第六个氨基酸Gln、第七个氨基酸Tyr、第八个氨基酸Leu、第九个氨基酸 Gln、第十个氨基酸L-Tyr,直至最后第十个氨基酸L-Tyr(L型酪氨酸)反应结束,其中,第三 个氨基酸为经过甲基化的赖氨酸(Lys);
[0045]具体步骤为:a.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基,洗净,茚三酮检测;向 反应器中加入序列中第三个氨基酸:3mmol Lys(Me),3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC,氮气 鼓泡反应一小时,抽掉液体,用DMF洗净,茚三酮检测;
[0046] b.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基,洗净,茚三酮检测;向反应器中加入 序列中第四个氨基酸:3mmol Phe,3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC,氮气鼓泡反应一小时, 抽掉液体,用DMF洗净,茚三酮检测;
[0047] c.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基,洗净,茚三酮检测;向反应器中加入 序列中第五个氨基酸:3mmol Pro,3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC,氮气鼓泡反应一小时, 抽掉液体,用DMF洗净,茚三酮检测;
[0048] d.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基,洗净,茚三酮检测;向反应器中加入 序列中第六个氨基酸:3mmol Gln,3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC,氮气鼓泡反应一小时, 抽掉液体,用DMF洗净,茚三酮检测;
[0049] e.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基,洗净,茚三酮检测;向反应器中加入 序列中第七个氨基酸:3mmol Tyr,3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC,氮气鼓泡反应一小时, 抽掉液体,用DMF洗净,茚三酮检测;
[0050] f..加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基,洗净,茚三酮检测;向反应器中加 入序列中第八个氨基酸:3mmol Leu,3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC,氮气鼓泡反应一小 时,抽掉液体,用DMF洗净,茚三酮检测;
[0051] g.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基,洗净,茚三酮检测;向反应器中加入 序列中第九个氨基酸:3mmol Gln,3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC,氮气鼓泡反应一小时, 抽掉液体,用DMF洗净,茚三酮检测;
[0052] h.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基,洗净,茚三酮检测;向反应器中加入 序列中第十个氨基酸:3mmol L-Tyr,3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC,氮气鼓泡反应一小 时,抽掉液体,用DMF洗净,茚三酮检测;
[0053] 5.加一定量6-10ml的质量百分比95 %三氟乙酸切割液,震荡反应2h,将氨基酸的 侧链保护基团裂解下来,得到粗肽产物;
[0054] 6.分析提纯和质谱检测:用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪检测该序列分 子量的正确性,用高效液相色谱将粗肽提纯至90%纯以上;
[0055] 7.收集纯化好的目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩冻干,冻干成白色粉末得到 ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化衍生物。
[0056] 实验例1
[0057]紫外分光光度法测定ACE抑制十肽体外活性的具体步骤如下:
[0058] 取5mmol/L HHL溶液200yL与IOOyL ACE抑制十肽混合,置于37°C水浴中,预热 5min,加入0. lU/mL ACE溶液20yL,于37°C恒温水浴中反应30min;然后,向反应体系中加入 lmol/L HCl溶液250yL以终止反应。再加入1.7mL,经15s振荡混匀后离心(4000r/min, 15min,4°C),吸取1.0 mL乙酸乙酯层,在120°C的烘箱中经30min蒸干,再将它重新溶于3mL的 去离子水中,在波长228nm处测定吸光度。
[0059] 由公式XC£:抑制率(%) = ?χ_100%计算ACE抑制十肽的抑制率,其中A代表反应 B - C 中ACE抑制剂与ACE同时存在下的吸光度;B代表反应中不加抑制剂时的吸光度,即对照;C代 表ACE和HHL空白反应的吸光度,即空白。
[0060] 采用上述的紫外分光光度法测定ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化修饰 衍生物YQK(Me)FPQYLQY的体外活性,其结果如图1,2所示
[0061 ]由图 1所拟合的一元二次方程y = -0 · 0004χ2+0 · 0392X-0 · 0047(R2 = 0 · 9687),经过 计算可得出ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的IC5q值为15.25yg/mL。
[0062] 由图2所拟合的一元二次回归方程为y = -0.0004x2+0.0418x-0.0895(R2 = 0.9850 ),经过计算可得出ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化衍生物的IC5q值为16.81 yg/mL〇
[0063] 实验例2:
[0064] 用合成的ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY 分别灌胃原发性高血压大鼠(SHR)检测其对SHR大鼠血压的影响。选用12周龄的雄性SHR大 鼠32只,体重为(260 ± 15) g,自由采食饮水,保持环境温度(23 ± I) °C,相对湿度60 % ± 5 %, 预饲养一周。将大鼠随机分为4组,每组8只,分别为空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量 组,分别灌胃生理盐水(10mL/Kg mb)、低、中、高剂量的合成产物(相对应的灌胃剂量为1、3、 9mg/Kg mb),另取Wistar大鼠10只,随机分为2组,每组5只,分别作为空白组和正常对照组, 灌胃生理盐水和高剂量的合成产物。采用BP-2006A型只能无创血压计(北京软隆科技有限 责任公司),测定大鼠的尾动脉收缩压(SBP)。测定前,将大鼠固定于鼠网保温套中于39°C恒 温预热,使大鼠的尾动脉扩张,血流畅通。测定灌胃后I-Sh的尾动脉血压,连续测定3次,取 平均值。其对血压的影响如图3-图6所示。
[0065]由图3、图5可以看出,ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化衍生物对原发性 高血压大鼠(SHR)均具有很好的降血压作用,与空白组相比具有显著性差异(P〈0.05),由图 4、图6可知,ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化衍生物对正常大鼠(Wistar大鼠)血 压无影响(P>〇. 05)。
[0066]因此,无论体外还是体内实验,ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化衍生物 YQK (Me) FPQYLQY均有较好的降血压作用,经过甲基化修饰后的肽片段的体外ACE抑制活性 略有下降,但其体内降压效果持平。
[0067] 实验例3
[0068]精确称取一定量样品配置成相同浓度,分别在4、20、37、60、80°(:条件下保温 60min,然后分别测定ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨基酸甲基化修饰衍生物YQK (Me) FPQYLQY的ACE抑制率,其结果如图7、8所示。YQKFPQYLQY及其氨基酸甲基化衍生物具有较好 的耐热稳定性,由图7、8可以看出甲基化衍生物的ACE抑制率波动幅度比原序列更小,经甲 基化修饰后温度稳定性有所提尚。
[0069]精确称取一定量样品用pH值分别为1、3、5、7、9、11的磷酸缓冲溶液配制成相同浓 度,在4 °C条件下分别放置Oh、Ih、2h、3h,然后分别测定ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸 甲基化修饰衍生物的ACE抑制率,其结果如图9、10所示。ACE抑制率均呈现下降趋势,强酸强 碱条件下的样品的抑制率下降较为明显;酪蛋白源ACE抑制十肽YQKFPQYLQY在偏中性的条 件下活性稳定性最强,强酸强碱条件下的活性损失较为明显,尤其是PHl条件下处理处理3h 后与Oh相比ACE抑制活性下降最为明显且具有显著性差异。经赖氨酸甲基化修饰后,衍生物 的酸碱稳定性均有所提高,赖氨酸甲基化衍生物在碱性条件下ACE抑制活性比原序列 YQKFPQYLQY 更稳定。
[0070]根据中国药典第五部的要求,配制人工胃肠液。取人工胃液和人工肠液溶解ACE抑 制十肽成一定浓度。经过人工胃液处理的样品于37°C条件下放置0h、lh和2h,人工肠液处理 的样品于37°C条件下放置Oh和4h,然后10000r/min,4°C条件下离心20min,取上清液,测定 上清液的ACE抑制活性,其结果如图11-12所示。ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化 修饰衍生物经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后抑制率略有下降,其结果如图13-14所示,但活性 差异不显著(P>〇. 05 ),说明ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化修饰衍生物具有良 好的耐胃蛋白酶及胰蛋白酶消化稳定性。
[0071]由实验例1和实验例2可知原ACE抑制十肽YQKFPQYLQY经赖氨酸甲基化修饰之后体 内外的抑制活性均略有下降,但体内的降压效果与原序列相比是持平的;结合实验例3可知 ACE抑制十肽YQKFPQYLQY经赖氨酸甲基化修饰后稳定性均有所提高,尤其是酸碱稳定性提 高较为明显。
【主权项】
1. 一种ACE抑制十肽的赖氨酸甲基化衍生物的制备方法,其特征是,按照下述步骤进 行: 1) 称取lg王树脂放入反应器中,加入二氯甲烷溶胀半小时,然后抽掉二氯甲烷,加入序 列中第一个氨基酸:lmmol当量的L型酪氨酸,lmmol的N,N-二异丙基碳二亚胺;lmmol的4-二 甲氨基吡啶,6-10ml的富马酸二甲脂溶液,用氮气鼓泡反应3h;然后加入lml吡啶,lml乙酸 酐,反应半小时,抽掉反应液,用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗净; 2) 加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基,洗净,并用茚三酮检测; 3) 向反应器中加入序列中第二个氨基酸谷氨酰胺(Gln)3mmol,3mmol 1-羟基苯并三氮 唑及N,N-二异丙基碳二亚胺,氮气鼓泡反应一小时,抽掉液体,用二甲基甲酰胺洗净,并用 茚三酮检测; 4) 依步骤2、3的方式依次加入序列中第三个氨基酸Lys(Me)、第四个氨基酸Phe、第五个 氨基酸Pro、第六个氨基酸Gin、第七个氨基酸Tyr、第八个氨基酸Leu、第九个氨基酸Gin、第 十个氨基酸L-Tyr,直至最后第十个氨基酸L-Tyr反应结束,其中第三个氨基酸为经过甲基 化的赖氨酸; 5) 加6-10ml的95 %三氟乙酸切割液,震荡反应2h,将氨基酸的侧链保护基团裂解下来, 得到粗肽产物; 6) 分析提纯和质谱检测:用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪检测该序列分子量 的正确性,用高效液相色谱将粗肽提纯至90%纯以上; 7) 收集步骤6)纯化好的目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩冻干,冻干成白色粉末得 到ACE抑制肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化衍生物。2. -种如权利要求1方法得到的ACE抑制十肽的赖氨酸甲基化衍生物:其特征是,其命 名为 丫0〖(]\16)卩?(>)¥1^¥,其氨基酸序列为171-6111-1^8(]\16)-?116-?1'〇-6111-171-1^11-6111-丁5^ 〇
【文档编号】C07K1/20GK105859836SQ201610239278
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】薛璐, 胡志和, 王会, 王晓丹
【申请人】天津商业大学
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