一种大肠杆菌O157:H7蛋白Ivy多肽、抗Ivy多克隆抗体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种大肠杆菌O157：H7 Ivy抗原多肽、抗大肠杆菌O157：H7 Ivy的多克隆抗体及其应用。本发明所述一种大肠杆菌O157：H7 Ivy抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1 所示。以一种大肠杆菌O157：H7 Ivy抗原多肽为免疫原免疫BALB/c小鼠制备得到了抗大肠杆菌O157：H7 Ivy的多克隆抗体，鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别大肠杆菌O157：H7 Ivy蛋白，可用于ELISA、Western blot、免疫荧光等试验中大肠杆菌O157：H7 Ivy蛋白的检测，为该蛋白功能的基础研究提供有力工具，应用前景广阔。
【专利说明】
[0001] 一种大肠杆菌0157: H7蛋白I vy多肽、抗I vy多克隆抗体及其 应用
技术领域
[0002] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种Ivy抗原多肽，抗大肠杆菌0157:H7蛋白 Ivy的多克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0003] 溶菌酶普遍存在于动物中，是许多生物先天性免疫系统的重要组成成分，具有免 疫功能、消化功能、几丁质酶活性以及异肽酶活性。由于溶菌酶具有普遍的抑菌作用，细菌 在同溶菌酶长期相互作用的过程中，演化出通过修饰肽聚糖的方法来抵抗溶菌酶的作用。 近几年，研究发现细菌还通过产生溶菌酶抑制剂来抵抗溶菌酶活性。第一个细菌溶菌酶抑 制剂发现于大肠杆菌中，由于其可以特异性的抑制脊椎动物c型溶菌酶活性，因此被命名为 脊椎动物溶菌酶抑制剂（Inhibitor of vertebrate lysozyme, Ivy) Jvy可以使大肠杆菌 具有抵御溶菌酶活性的功能以保证其能够在人的唾液和鸡蛋清中生存。Ivy主要存在于细 胞周质，通过封闭溶菌酶活性位点起到抑制溶菌酶活性的作用，从而使细菌细胞壁上的肽 聚糖免受外源性溶菌酶的分解。Ivy除了保护细菌免受外源性溶菌酶侵害外，可能还具有控 制内源性细菌自溶酶（自溶酶是降解肽聚糖的关键酶，对于细胞生长和分裂至关重要)的作 用。Ivy在大肠杆菌逃避宿主溶菌酶方面的作用机理以及Ivy与大肠杆菌耐药性之间的关系 有待深入研究。因此，制备具有抑制Ivy活性的抗体意义非常重大，不仅可以为该蛋白的功 能研究奠定基础，同时为大肠杆菌耐药性研究提供实验数据支持。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能用于ELISA、western blot、免 疫荧光检测的抗大肠杆菌0157:H7 Ivy蛋白的多克隆抗体。
[0005] 本发明另一目的在于提供一种大肠杆菌0157:H7 Ivy抗原多肽。
[0006] 本发明的又一目的是提供上述抗大肠杆菌0157:H7 Ivy蛋白的多克隆抗体的应 用。
[0007] 本发明通过以下技术方案实现上述目的： 一种大肠杆菌0157:H7 Ivy抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。优选地，所述 的抗原多肽与匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联。
[0008] -种抗Ivy的多克隆抗体，是以前述Ivy抗原多肽为免疫原，免疫动物制备而成。
[0009] 上述抗Ivy的多克隆抗体的制备方法，步骤如下：Ivy抗原多肽与马来酰胺活化的 匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，期间 进行三次以上免疫，待ELISA检测血清抗体效价达1:100000后，采集小鼠血清，经过纯化、 ELISA和western blot鉴定后，得到抗Ivy的多克隆抗体。
[0010]进一步的，本发明还提供了所述的多克隆抗体在制备检测大肠杆菌0157 :H7 Ivy 蛋白感染的试剂中的应用，所述的多克隆抗体在制备抑制大肠杆菌0157: H7 Ivy蛋白增殖 的试剂中的应用，以及多克隆抗体在制备治疗大肠杆菌0157: H7 Ivy蛋白感染的试剂中的 应用。
[0011]化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很 弱的免疫反应，因而与载体蛋白交联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激 T辅助细胞，进而诱导B细胞反应。用于与多肽交联的载体蛋白有多种，其中最普遍使用的载 体是匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemacyanin，KLH)，牛血清白蛋白（bovine serumalbumin，BSA)，卵清蛋白（ovalbumin，OVA)和牛甲状腺球蛋白（bovine thyr 〇gl〇bulin，THYXKLH具有更高的抗原性，与本发明的Ivy抗原多肽交联后免疫原性最 强，因此本发明选用KLH作为偶联载体蛋白。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被 用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。
[0012] 大肠杆菌0157:H7 Ivy的多克隆抗体在ELISA、western-blot、免疫荧光等大肠杆 菌0157:H7 Ivy蛋白检测实验中的应用。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： (1) 本发明对大肠杆菌0157:H7 Ivy蛋白氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、 表面可及性等进行分析，确定合适的一段胞内区肽序列进行人工合成;将合成的多肽与马 来酰亚氨活化的载体KLH偶联，将此偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫BALB/c小鼠；经过多 次免疫的小鼠血清用ELISA法对抗体效价进行检测，效价达理想值后收集免疫小鼠血清， 并用Protein G蛋白纯化柱纯化抗体；对纯化后抗体进行ELISA、Western bot等鉴定。鉴 定结果表明该多克隆抗体可特异性识别大肠杆菌〇157:H7 Ivy蛋白； (2) 本发明将此纯化抗体用于进行大肠杆菌的ELISA、WeStern bot、免疫荧光染色等实 验证明其能识别天然的Ivy蛋白。此Ivy的多克隆抗体为进一步研究大肠杆菌0157:H7 Ivy 的功能奠定了基础。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于解释本发 明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术方案的前提下，对本发明所作的本 领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0015] 实施例1制备大肠杆菌0157:H7 Ivy抗原多肽 1.大肠杆菌〇157:H7 Ivy多肽的设计及合成:根据GenBank上的大肠杆菌0157:H7 Ivy序列（登录号:ΝΡ_285937·1)获得大肠杆菌0157:H7 Ivy蛋白序列，含有157个氨基酸。
[0016] 2.用DNAstar软件分析Ivy蛋白特性，分析结果见表1，该蛋白的分子量为16871道 尔顿，等电点为6.59,为酸性蛋白。
3 .用IEDB软件分析Ivy蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明大肠杆菌 0157:H7 Ivy蛋白146 aa -157 aa有12个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强。
[0018] 4. Ivy抗原多肽筛选:经过上述分析，最终筛选多肽序列为：SLENHPDGFNFK(146 aa-157 aa,SEQ ID Ν0:1)〇
[0019] 实施例2 Ivy抗原多肽制备及与载体蛋白偶联 I. I vy抗原多肽:SLENHPDGFNFK由上海吉尔生化公司合成。多肽C端为一个半胱氨酸， 便于与载体蛋白偶联。
[0020] 2.多肽与载体蛋白偶联 a. 用200yL超纯水稀释一管马来酰亚胺活化的mcKLH，稀释成10 mg/mL的溶液。
[0021] (注:上述溶液呈蓝白色半透明状，不得振荡或加热，否则会导致mcKLH沉淀。） b. 用相当于步骤a中溶液1.0~2.5倍体积的偶联缓冲液溶解含巯基的半抗原（即Ivy 抗原多肽）。例如:将2mg半抗原用200~500yL偶联缓冲液溶解，加入到mcKLH。如果多肽是易 溶的，可以以固体加入到mcKLH悬液中。（注:如果半抗原不易溶，可以加入DMSO增加溶解。 DMSO在偶联溶解液中浓度低于30%，否则载体蛋白易变性）。
[0022] c.立即混匀多肽、mcKLH溶液，然后在室温反应2 h。
[0023] 3.偶联产物纯化 通过凝胶层析脱盐柱来纯化偶联物。如果偶联物在一周以内注射，用PBS纯化。如果偶 联物冻存，用纯化缓冲盐纯化，如果在偶联时形成沉淀，离心，收集上清，保留沉淀。仅纯化 上清。将纯化的偶联物与沉淀结合。
[0024] a.溶解一瓶纯化缓冲盐，加入60mL脱气的超纯水，4°C保存。
[0025] b.拿去脱盐柱的顶和底的盖子，使存储液排出。一脱盐柱可纯化0.5mL样品。
[0026] c.用3~5倍柱体积（15~25 mL)的纯化缓冲液冲洗柱子。
[0027] d.将0.5mL的多肽载体混合物直接加入柱中心。加入0.5mL的纯化缓冲液，在分 离管中收集各峰。
[0028] e.在280 nm下测定吸光度以确定哪部分含有偶联物。在第一个吸收峰检测出的 将是半抗原偶联物。混合所有含偶联物的部分。
[0029] f.在含有偶联物的部分出现后，继续向柱内加入缓冲液，收集没有偶联的半抗 原。
[0030] g.将偶联物过滤除菌，无菌保存在-80°c。
[0031] 结果：考马斯亮兰法测得偶联后蛋白浓度和含量，每管250yg分装，-80°C保存。 [0032]实施例3抗Ivy多肽BALB/c小鼠多克隆抗体制备及纯化 1.动物免疫 偶联产物免疫4~5周龄雄性BALB/c小鼠。弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂购自Sigma公 司。
[0033] 免疫程序见表2,先用I3BS稀释IOOyg抗原，至0.3mL，用等体积佐剂混匀，旋涡振 荡100 min，检测乳化结果，取一滴抗原滴于水上，一分钟内不溶解扩散即可进行免疫。免疫 前尾静脉取血，4°C静置后取血清，-80°C保存，作阴性对照血清。 「00341 券9且汰任；1??岸 沉怀欢饥KLlSA恆测
(1)实验试剂 a.磷酸盐缓冲液(PBS)(10X浓缩）：氯化钠 (NaCl)50g，氯化钾(KCl) 1.25 g，磷酸二氢 钾(KH 2P〇4)1.25 g，磷酸氢二钠 (Na2HPO 4· 12H2〇)18.1 g，蒸馏水加至 1000 mL，用IM HCl 调pH至7.2。
[0035] b.封闭液：正常牛血清10mL，l XPBS(不含吐温)90mL。
[0036] c.洗涤缓冲液：吐温20(Tween20)0.2mL，l XPBS 1000 mL0
[0037] d.底物显色A液:醋酸钠(CH3C00Na)13.6 g，柠檬酸（C6H8O7 · Η2〇)1·6 g，双氧水 (H2O2 30%)0.3mL，蒸馏水加至500mL。
[0038] e.底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2 )0.2 g，柠檬酸(C6H8O7 · Η2〇)0·95 g，甘油(C3H8O3 )50mL，四甲基联苯胺(TMB)0.2 g，蒸馏水加至500mL。
[0039] f.终止液（2M H2SO4 ):取浓H2SO4 27.62mL，缓缓加入到473mL的蒸馏水中，混匀 即可。
[0040] 8.抗原包被液(0.謂碳酸盐缓冲液）:？!19.6，碳酸钠(似2〇) 3)1.598，碳酸氢钠 (NaHC03)2.93g，叠氮钠(NaN 3 )0.2g，蒸馏水加至 1000mL。
[0041] h.辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG(北京康为试剂生物科技有限公司）。
[0042] (2)实验步骤 a.抗原包被:纯多肽抗原终浓度一般为4yg/mL，用包被液稀释后取IOOyL加入聚苯乙 烯酶联检测板各孔中，4 °C过夜后，洗液洗涤3次。
[0043] b.封闭：每孔加 200yL或加满封闭液，4°C过夜或37°C两小时后，洗涤3次，拍干。
[0044] 置4°C冰箱保存备用。
[0045] c · ELISA 检测 ①加待测样品：小鼠尾静脉采血后分离血清，用PBS倍比稀释，50~100μL7孔加样到包 被好的酶标板中，同时，分别选取免疫前小鼠血清为阴性对照，37°C孵育60 min，洗涤3次， 拍干。
[0046]②加二抗:根据酶标二抗的效价选择稀释倍数，IOOyL/孔，37 °C孵育60 min，洗涤3 次，拍干。
[0047] ③显色：加入底物显色A、B液各50yL/孔，37°C显色15min。
[0048] ④终止:加入终止液IOOyL/孔。
[0049]⑤读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值(Ρ/Ν)大于2.5 为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。
[0050]小鼠血清收集： 采用眼眶放血法，非抗凝小鼠全血收集后在37°C孵育2h。
[0051 ] 2.抗体纯化 (1)饱和硫酸铵沉淀法 a.配制饱和硫酸铵溶液(SAS):将767g(NH4)2S〇4边搅拌边慢慢加到IL蒸馏水中。
[0052] 用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0。此即饱和度为100 %的硫酸铵溶液（4. ImoI/L，25 °0〇
[0053] b.沉淀 ① 样品(血清)20 000Xg离心30min，除去细胞碎片； ② 保留上清液并测量体积； ③ 边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1:1; ④ 将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4 °C )，使蛋白质充分沉淀。
[0054] c.透析 ① 蛋白质溶液10 〇〇〇 X g离心30min(4°c )。弃上清保留沉淀； ② 将沉淀溶于少量（10~20mL)roS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对I3BS-0.2g/L叠氮钠透析24~48小时(4°C)，每隔3~6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸 氨； ③ 透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
[0055] (2)蛋白G亲和纯化所需试剂和特殊设备：1.0 mol/L Tris(pH8.0);100mmol/L Tris(pH8.0);10mmol/L Tris(pH8.0);50mmol/L 甘氨酸(pH3.0);柱状色谱仪。
[0056] 操作步骤： a.加入1/10体积的I .Omol/L Tris(pH8.0)调含抗体样品（血清，组织培养上清液或腹 水)的pH值至8.0。
[0057] b.将抗体溶液通过蛋白A或蛋白G微球柱。这些柱中，每毫升的湿微球能结合大约 10~20mL抗体（1个蛋白A或蛋白G微球分子结合2分子抗体）。记录装柱微球的大约体积。因 为微球柱的体积决定使用清洗和洗脱缓冲液的量。
[0058] c.用 10倍柱体积的lOOmmol/L Tris(pH8.0)洗涤微球。
[0059] d.用10倍柱体积的10mmol/L Tris(pH8.0)洗涤微球。
[0060] e.用50mmo 1/L甘氨酸(pH3.0 )洗脱微球柱，每次加入约1 /2柱体积的缓冲液，分次 加入。用含1/10柱体积的I mol/L Tris(pH8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其 pH值恢复至中性。
[0061] f.将含抗体的收集管混合，用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色测总蛋白。
[0062] 结果:抗体纯化后经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定，紫外分光光度计测定抗体浓度为0.4 mg/mL。纯化后抗体保存于-20°C，0.01 M PBS缓冲液中，溶液中含有40%甘油和0.5%BSA。 [0063]实施例4:抗Ivy的多克隆抗体的鉴定 1.抗Ivy的多克隆抗体的ELISA鉴定 以合成的Ivy多肽为检测抗原，包被酶标板，以1:2000稀释的未免疫小鼠兔血清作为阴 性对照，将小鼠血清及纯化后的抗体倍比稀释，应用ELISA方法检测，以与阴性血清的比 值大于2.1判断为阳性，计算多抗效价。
[0064]结果，纯化的抗Ivy抗体的效价达到1:128000(表3)。
[0065] 表3抗Ivy抗体效价(k = 1000) 2.抗Ivy的多克隆抗体的Western Blot鉴定 分别收集大肠杆菌〇157:H7和Vero细胞，将其裂解后制成大肠杆菌0157:H7裂解蛋白和 Vero细胞裂解蛋白，用2 X SDS裂解缓冲液裂解后上样，进行10% SDS-PAGE电泳，参照《分子 克隆》中所述的免疫印迹方法，电转移条件为IOOV电泳lh，封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST， 一抗为本发明中的抗Vero的多克隆抗体(终浓度0. lyg/mL)，二抗为辣根过氧化物酶标记的 羊抗鼠 IgG抗体，通过ECL显色系统进行免疫印迹分析。
[0066] 结果:本发明中的抗Ivy的多克隆抗体可在大肠杆菌0157 :H7裂解液中检测到17KD 大小左右的蛋白条带，与大肠杆菌〇157:H7 Ivy蛋白分子量大小相符。
[0067] 3.抗Ivy的多克隆抗体的免疫荧光鉴定。
[0068] 大肠杆菌0157:H7感染Vero细胞48 h，4%多聚甲醛固定15min，滴加0.25% TritonXlOO，室温孵育10 min，使细胞膜具有渗透性，以便抗体进入。PBS洗涤三次，含1 % BSA的PBST室温封闭2 hlBS洗涤3次，然后用本发明中的抗Ivy的多克隆抗体(PBST 1:500 稀释）室温孵育1.5 hWBS洗涤3次，用FITC(绿色荧光)标记的羊抗鼠 IgGO3BST 1:1000 稀释)室温孵育I hlBS洗涤后DAPI染色(蓝色HOmin13PBS洗片后，荧光显微镜下观察。同 时用正常小鼠血清作阴性对照。
[0069]结果：经本发明中的抗Ivy的多克隆抗体染色的Vero细胞质中均观察到绿色荧 光，证明本发明中的抗Ivy抗体可识别天然的Ivy蛋白。
【主权项】
1. 一种大肠杆菌〇157:H7 Ivy抗原多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所 不。2. 根据权利要求1所述的大肠杆菌0157:H7 Ivy抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多 肽与匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联。3. -种抗大肠杆菌0157:H7 Ivy的多克隆抗体，其特征在于，是以权利要求1所述大肠 杆菌0157:H7 Ivy抗原多肽为免疫原，免疫动物制备而成。4. 权利要求3所述抗大肠杆菌0157:H7 Ivy的多克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤 如下:将权利要求1所述大肠杆菌〇157:H7 Ivy抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋 白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，期间进行三次以上免 疫，待ELISA检测血清抗体效价达1:100000后，采集小鼠血清，经过纯化、ELISA和western blot鉴定后，得到抗大肠杆菌0157:H7 Ivy的多克隆抗体。5. 权利要求3所述抗大肠杆菌0157:H7 Ivy的多克隆抗体在制备检测大肠杆菌0157:H7 Ivy蛋白感染的试剂中的应用。6. 权利要求3所述抗大肠杆菌0157:H7 Ivy的多克隆抗体在制备抑制大肠杆菌0157:H7 Ivy蛋白增殖的试剂中的应用。7. 权利要求3所述抗大肠杆菌0157:H7 Ivy的多克隆抗体在制备治疗大肠杆菌0157:H7 Ivy蛋白感染的试剂中的应用。
【文档编号】A61P31/04GK105859838SQ201610219949
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月7日
【发明人】潘艳, 李军, 杨威, 陈泽祥, 冯世文, 彭昊, 胡庭俊, 李剑静, 李常挺, 林敏玲, 许力干, 钟舒红, 胡帅, 谢宇舟, 马春霞, 谢永平
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所