一种香港牡蛎抗菌肽sa-lectin及其重组表达方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种香港牡蛎抗菌肽sa?lectin及其重组表达方法和应用。本发明抗菌肽sa?lectin的基因编码序列如SEQ ID NO:1所示，编码了156个氨基酸，如SEQ ID NO:2所示，其N端的16个氨基酸为信号肽序列。本发明通过构建其去除信号肽序列的原核表达载体，表达纯化了sa?lectin重组蛋白，该蛋白可以抑制多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长，还可以结合唾液酸，在贝类的免疫防御中发挥了重要作用。
【专利说明】
一种香港牡蛾抗菌肽sa-1ect i η及其重组表达方法和应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及贝类药物技术领域，具体涉及一种香港牡.抗菌肽sa-lectin及其重组表达方法和应用。
技术背景
[0002]贝类养殖在我国沿海经济社会发展中占据举足轻重的地位，是世界上最重要经济类群之一，具有巨大的发展潜力。香港牡^(Crassostrea hongkongensis)，属于软体动物门，双壳纲，珍珠贝目，牡蛎科动物，是我国华南沿海地区最重要的贝类经济动物。然而，良种匮乏导致牡蛎免疫能力低下，疾病爆发，甚至出现大规模死亡，是制约贝类产业发展的主要瓶颈。
[0003]因此，如何提高贝类的抗菌能力是解决目前问题的有效手段。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于解决目前贝类免疫能力不足等的现有问题，从香港牡蛎的cDNA中鉴定了一种唾液酸结合凝集素salectin基因，通过克隆获得了改基因的全长0RF。进而通过构建其原核表达载体，获得其可溶性的重组蛋白。抗菌分析显示该重组蛋白具有有效的抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的生长的能力，并且还具有结合唾液酸的能力。所以，此专利可以不但可以有效的提高贝类的抗病能力，而且还可以为开发新型抗菌肽提供了材料。
[0005]一种香港牡■抗菌肽sa-lectin，其基因编码序列如SEQ ID NO:1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0006]本发明所述香港牡.抗菌肽sa-lectin的重组表达方法包括如下步骤:
(1)RNA的提取；
(2)cDNA文库的构建；
(3)原核表达载体的构建:设计一对涵盖sa-lectin基因编码序列的引物，引物两端分另Ij加入BamH-1和Xho-1位点和保护碱基;使用这对引物进行PCR扩增，扩增产物和pMAL?载体分别使用BamH-1和Xho-1进行双酶切，并回收纯化酶切产物；连接酶切后的PCR片段和pMAL?载体;转化、挑取阳性克隆、测序验证载体正确无误；
(4)重组蛋白的原核表达和纯化。
[0007]本发明所述的香港牡■抗菌肽sa-lectin在提高贝类免疫能力中的应用。
[0008]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
本发明使用原核表达方法制备salectin基因去除信号肽序列的重组蛋白，经试验证实，该蛋白可以抑制多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长，并且可以结合唾液酸。
【附图说明】
[0009]图1是表达和纯化的salectin重组蛋白，其中，M:蛋白Marker;Lanel:重组表达蛋白MBP_salectin;Lane2:纯化后的MBP;箭头指示重组表达的目的蛋白MBP-salectin; 图2是salectin的抑菌谱;通过检测细菌在600 nm的吸光值分析salectin的抑菌能力:革兰氏阴性菌(A) V.alginolyticus (B)E.coli和革兰氏阳性菌(C)S.aureus和(D)B.thuringiensis;图2表明重组蛋白salectin能有效的抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长；
图3是非变性PAGE电泳显示selectin同唾液酸的结合能力；其中，Lane 1: MBP；Lane2: MBP + 含有唾液酸的蛋白 fetuin ; Lane 3/6: f etuin ； Lane 4:重组蛋白MBP-salectin；Lane 5:重组蛋白MBP-salectin + fetuin;箭头指代的是MBP二聚体；图3表明select in可以结合唾液酸。
【具体实施方式】
[0010]为进一步说明本发明的技术手段、新颖性和目的效果，结合实际阐述实施例，但以下实施例为示例性的，仅用于解释此发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0011]实施例1
1.RNA提取
总RNA的提取使用Trizol (Invitorgen)提取，具体步骤如下:(I)取50mg组织于液氮预冷的研钵中，将组织磨成粉末之后，转移到装有Iml Trizol的离心管中，吹打、混匀；(2)加入200 yL氯仿，剧烈震荡40s，室温放置5min;(3)4°C，12，000Xg离心10 min，吸取上清转移至新管；(4)加入0.5ml的异丙醇，混勾，_80°C沉淀过夜；(5)4°C , 12,000 X g离心10 min,弃上清；(6)75%乙醇wish两次沉淀；(7)弃上清，加入100 yL DEPC水溶解RNA。
[0012]2.cDNA文库构建
全长cDNA文库构建使用SMART cDNA library construct1n Kit(Clontech)，具体步骤如下:(I)使用MMLV合成cDNA第一条链；(2)使用LD PCR扩增cDNA; (3)蛋白酶K消化并纯化cDNA产物；(4)Sfil消化，使用Chroma Spin400进行产物大小分离；(5)连接cDNA至λTripEx2载体，经λ噬菌体包装后，转化至宿主细胞中；(6)检测cDNA文库滴度。
[0013]3.原核表达载体构建
(I )设计一对涵盖s a I e c t i η O R F的引物(正向引物序列为GACTGGATCCTATGGATATGTCTATCACAGGTC，反向弓I 物序列为GACTCTCGAGTTAaataattctaattaaggtaccg)，引物的两端分别加入BamH-Ι和Xho-Ι位点和保护碱基；(2)使用这对引物进行PCR扩增；(3)PCR产物和pMAL?载体分别使用BamH-1和Xho-1进行双酶切，并回收纯化酶切产物；(4)连接酶切后的PCR片段和pMAL?载体；(5)转化，挑取阳性克隆，测序验证载体正确无误，进行后续试验。
[0014]4.重组蛋白的原核表达和纯化
(I)把构建好的LRR原核表达载体转化至BL21(DE3);(2)挑选单克隆并培养至0D=0.6，加入IPTG至终浓度为0.1 mM, 22°C，180rmp的条件下诱导表达；(3)4h后收集菌液，4°C，12，OOOXg离心10 min; (4)加入Lysozyme至终浓度2 mg/ml，然后超声破碎；(5)使用AmyloseRes in纯化重组蛋白，在12% SDS-PAGE胶分析纯化产物。
[0015]5.抑菌谱分析
(I)所有的待测菌在LB培养基中生长至对数期，然后稀释至14 CFU/mL;(2)取50 yL稀释后的待测菌加入50此重组蛋白，蛋白浓度为60 ng/yL；(3)37 °C孵育3 h; (4)加入900 μL LB培养基，继续培养；(5)分别在培养2h至6h检测细胞在600 nm的吸光值，绘出其生长曲线。
[0016] 6.唾液酸结合分析
(I)在50 mM pH 8.0 Tris-HCl缓冲液中，分别加入20 ng重组蛋白MBP-salectin和过量100倍的fetuin; (2)室温结合3 h;(3)2%非变性PAGE gel结合考马斯亮蓝染色分析结合产物。
【主权项】
1.一种香港牡■抗菌肽sa-lectin，其基因编码序列如SEQID NO:1所示。2.权利要求1所述的香港牡■抗菌肽sa-lectin，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。3.包括权利要求1所述的香港牡■抗菌肽sa-lectin的原核表达载体。4.权利要求1所述香港牡.抗菌肽sa-lectin的重组表达方法，其特征在于包括如下步骤: (1)RNA的提取； (2)cDNA文库的构建； (3)原核表达载体的构建:设计一对涵盖sa-lectin基因编码序列的引物，引物两端分另Ij加入BamH-1和Xho-1位点和保护碱基;使用这对引物进行PCR扩增，扩增产物和pMAL?载体分别使用BamH-1和Xho-1进行双酶切，并回收纯化酶切产物；连接酶切后的PCR片段和pMAL?载体;转化、挑取阳性克隆、测序验证载体正确无误； (4)重组蛋白的原核表达和纯化。5.权利要求1所述的香港牡■抗菌肽sa-lectin在提高贝类免疫能力中的应用。
【文档编号】A61K38/17GK105859862SQ201610335666
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】冼昶华, 陈金辉
【申请人】清远职业技术学院