一种人源抗菌肽ll-37突变体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种人源抗菌肽LL?37突变体及其应用，通过对抗菌肽LL?37分子结构进行优化设计，将抗菌肽LL?37中的1号位亮氨酸、3号位甘氨酸、16号位谷氨酸、26号位天冬氨酸、34号位精氨酸、35号位苏氨酸分别替换成：甘氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸，实验结果证明突变体具有优良的抗菌活性和稳定性；本发明主要用于（a）抑制细菌、病毒的生长繁殖及肿瘤细胞的增殖；或（b）杀灭细菌、病毒。
【专利说明】
一种人源抗菌肽LL-37突变体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种人源抗菌肽LL-37突变体及其应用。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽是生物体天然免疫的重要组成成分，自发现以来，由于其分子量低、抗菌谱 广，抗菌机制独特而显示了其在医学和农业上潜在的研究价值和应用价值，其研究及应用 已成为抗菌生物技术药物领域的研究热点。
[0003] 目前用于开发抗菌肽生物制剂主要是含有生物活性核心区域的内源性抗菌肽，此 类多肽用于药品和食品领域，主要存在以下问题:①要解决药效动力学、毒理学、以及潜在 的免疫毒性问题;②抗菌肽分子小，容易被蛋白酶降解，其稳定性有待提高;③小分子物质 的分离、纯化困难;④抗菌肽的天然资源有限，依靠化学合成抗菌肽成本较高，而通过基因 工程在微生物体内直接表达基因，要解决提高抗菌肽生产效率、降低成本等问题;⑤与传统 的抗生素相比，抗菌肽的抗菌活性还不够理想，需要对抗菌肽做改良设计以提高其抗菌活 性。
[0004] 抗菌肽LL-37是来源于人的一种α-螺旋型阳离子抗菌肽，它具有广谱抗菌活性，可 以抗多种革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌，而且还可通过免疫调节、促进创伤修复、诱导血管 生成等，是人体固有免疫防御系统的重要组成部分。文献《The lipid A palmitoyltransferase PagP: molecular mechanisms and role in bacterial pathogenesis》和《Biofilms formed by gram-negative bacteria undergo increased lipid a palmitoylation，enhancing in vivo survival》中指出革兰氏阴性菌细胞外膜 的棕榈酰转移酶PagP被激活后通过对脂质A酰化，修复细菌外膜通透性从而产生对抗菌肽 的抗性。
[0005] 目前，抗生素滥用导致的药物残留和细菌耐药等问题越来越受到人们的重视，细 菌对传统抗生素产生耐药性已成为亟待解决的全球性问题。因此，通过抑制脂质A酰化这一 途径，研发新的抗菌药物，是本发明课题研究的重要内容。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是针对细菌耐药性的问题，对抗菌肽LL-37进行优化设计，提供一 种抗菌活性更好、稳定性高的抗菌肽LL-37的突变体及其应用。
[0007] 本发明的一种人源抗菌肽LL-37突变体，所述序列中第一个氨基酸为甘氨酸(G)， 第三个氨基酸为亮氨酸(L)，第十六个氨基酸为谷氨酰胺(Q)，第二十六个氨基酸为赖氨酸 (K)，第三十四个氨基酸为苏氨酸(T)，第三十五个氨基酸为精氨酸(R)，其它氨基酸残基序 列不变。
[0008] 本发明的一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码的多肽与人源抗菌肽LL-37相 比，人源抗菌肽LL-37中的1号位亮氨酸、3号位甘氨酸、16号位谷氨酸、26号位天冬氨酸、34 号位精氨酸、35号位苏氨酸被分别替换成:甘氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、精氨 酸。
[0009] 本发明的一种载体，所述载体中含有上述的多核苷酸。
[0010] 本发明的一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞中含有上述载体。
[0011] 本发明的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，包括以下步骤： (1) 利用蛋白质在线分析工具ExPasy、序列对比软件MEGA software、蛋白质分析软件 Antheprot、分子对接软件autodock和动力学模拟软件ADF2014 (Amsterdam Density Functional)对抗菌肽LL-37的核酸序列进行分析，为抗菌肽LL-37突变体设计提供理论基 础； (2) 在抗菌肽LL-37突变体的两端引入限制性酶切位点，通过酶切操作连接到酵母表达 载体上； (3) 将表达载体转化导入GS115酵母菌中，经提取后鉴定得到重组基因工程菌； (4) 重组基因工程菌经诱导表达后离心分离收集上清液，经分离纯化获得重组抗菌肽 LL-37突变体蛋白。
[0012] 本发明中所述抗菌肽LL-37突变体基因前端加上组氨酸标签并引入限制性内切酶 EcoR的酶切位点，后端加上一个终止密码子并引入限制性内切酶XbaI的酶切位点。
[0013] 本发明中所述载体为pP I CZaA。
[0014] 本发明中所述酵母菌为毕赤酵母。
[0015] 本发明中所述分离纯化方法为现有技术盐析、沉淀、液相层析技术和透析的结合。
[0016] 本发明所述的突变体用于(a)抑制细菌、病毒的生长繁殖及肿瘤细胞的增殖;或 (b)杀灭细菌、病毒。
[0017] 本发明是基于抗菌肽LL-37不同长度的水解片段具有较好的生物学活性，以革兰 阴性菌细胞膜棕榈酰转移酶PagP的耐药机制为基础，阳离子抗菌肽通过细菌PhoP-PhoQ调 节系统调控调控细胞膜棕榈酰转移酶PagP表达与活性，促进脂质A酰化，进而影响阳离子抗 菌肽与细菌细胞膜的结合，抑制抗菌肽活性。以该途径为突破口，结合α-螺旋型阳离子抗菌 肽两亲性、α-螺旋程度等因素对抗菌肽LL-37的氨基酸残基进行替换、增减等方式，重新设 计，获得突变体的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0018] 选取大肠埃希菌Escherichia coli (strain K12)细胞细胞膜棕榈酰转移酶PagP 作为受体，参见附图1，以抗菌肽LL-37及其氨基酸残基为配体，参见附图2，进行分子对接和 动力学模拟。
[0019] 选取抗菌肽LL-37 5位苯丙氨酸到32位缬氨酸中间部位的氨基酸片段作为配体， 受体选取棕榈酰转移酶PagP外膜外侧。使用AutoDock对抗菌肽LL-37片段与棕榈酰转移酶 PagP进行分子对接，设定格点空间大小为60*60*60 A3，坐标为（7.063，32.452，49.199)，采 用拉马克遗传算法对接。
[0020] 通过对接发现抗菌肽LL-37与棕榈酰转移酶PagP的结合位点，参见附图3,包括抗 菌肽LL-37中的GLUl I，LEU28、LYS12、PHE27、ILE13和PHE6，棕榈酰转移酶PagP中的ARG94， TRP89，ASN65，SER3，GLU90、GLU90，ASN100、HIS102和THR92。重复多次对接后确定最好的对 接构象，对应的配体效率值见表1。 表i抗翦片段与榇瘸露转移駿為威、.对禳的梁体效率值、.
[0021] 从上表1可以看出，8种LL-37片段作为配体与受体对接时，配体效率从_1.6100~ -2.2389Kcal/mol，为后续LL-37突变体的设计奠定了实验基础。
[0022] 利用ADF2014 (Amsterdam Density Functional)软件，米用ReaxFF方法，首先对 抗菌肽LL-37和棕榈酰转移酶PagP进行优化，获得最小能量结构下的原子位置和晶格参数。 然后，设定ReaxFF模拟参数与条件，在100*100*100 A3的周期性空间内，采用随机均匀的方 式放入4个抗菌肽LL-37分子和1个棕榈酰转移酶PagP分子，温度设定为室温298K，采用 Velocity Verlet(NVT)系综，进行0皮秒内的内部压力弛豫分析，使温度和压力在预定值附 近波动，经过不同时间节点，分析体系构象。在对产物的识别分析中，为研究分子的性质，采 用密度泛函理论(使用PBE-D3(BJ)泛函，TZ2P基组)计算分子间键能。
[0023] ReaxFF方法模拟表明： 在〇皮秒时，体系呈周期性地随机分布于单元为100*100*100 A3的空间内，分子之间的 最短距离不小于2.5埃。
[0024]体系经过8.75皮秒时，由于LL-37与棕榈酰转移酶PagP的疏水基团互相融合发生 接触，参见图4,其中球形原子为LL-37与PagP发生接触的原子，结构图中红色、蓝色、白色、 灰色小球分别表示0、N、H、C原子，左边区域来自抗菌肽LL-37，右边区域来自棕榈酰转移酶 PagP0
[0025]体系经历20皮秒，没有观察到解离的趋势，此时计算弱键-C-O-H…NH2-CH2-的键 能为 _14 · 97kcal/mol。
[0026]上述研究结果表明，抗菌肽LL-37与大肠埃希菌外膜上的棕榈酰转移酶PagP发生 接触的原子构象比较稳定，其弱键-C-O-H…NH2-CH2-的键能达到-14.97kcal/mol，该键是连 接抗菌肽LL-37与棕榈酰转移酶PagP的重要桥梁，其中-NH 2来自抗菌肽LL-37分子的中部， 在抗菌肽LL-37弯折攀爬到棕榈酰转移酶PagP表面之后，-NH2基团被带到了接触区域，进而 形成稳定的化学键。
[0027]因此，抗菌肽LL-37分子结构的柔性，分子中的氨基在抗菌肽发挥抗菌活性的过程 中扮演了重要角色，同时为抗菌肽LL-37突变体设计提供了可靠的理论基础。
【附图说明】
[0028] 图1大肠埃希菌Escherichia coli (strain K12)细胞细胞膜棕榈酰转移酶PagP 3D模式图； 图2抗菌肽hCAP-18/LL-37 3D模式图； 图3抗菌肽LL-37片段与棕榈酰转移酶PagP结合位点； 图4体系经过8.75皮秒后抗菌肽LL-37与棕榈酰转移酶PagP的"纠缠"结构； 图5抗菌肽LL-37及其突变体的亲疏水性氨基酸分布和螺旋图（左边:抗菌肽LL-37;右 边:LL-37突变体）； 图6抗菌肽LL-37突变体的色谱图； 图7抗菌肽LL-37突变体的质谱图； 图8抗菌肽LL-37及其突变体对临床1号菌株的抗菌活性图； 图9抗菌肽LL-37及其突变体对临床2号菌株的抗菌活性图； 图10抗菌肽LL-37及其突变体对临床3号菌株的抗菌活性图； 图11抗菌肽LL-37及其突变体对临床4号菌株的抗菌活性图； 图12抗菌肽LL-37及其突变体对临床5号菌株的抗菌活性图； 图13抗菌肽LL-37及其突变体对临床6号菌株的抗菌活性图； 图14抗菌肽LL-37及其突变体对临床7号菌株的抗菌活性图； 图15抗菌肽LL-37及其突变体对临床8号菌株的抗菌活性图； 图16抗菌肽LL-37及其突变体对临床9号菌株的抗菌活性图； 图17抗菌肽LL-37及其突变体对临床10号菌株的抗菌活性图； 图18抗菌肽LL-37及其突变体对临床11号菌株的抗菌活性图； 图19抗菌肽LL-37及其突变体对ATCC25922菌株的抗菌活性图； 图20抗菌肽LL-37及其突变体对ATCC35218菌株的抗菌活性图； 图21抗菌肽LL-37、抗菌肽LL-37突变体及硫酸多粘菌素 B对ATCC25922大肠埃希菌标准 菌株的抑菌率。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法 (1)抗菌肽LL-37突变体基因的设计和合成 在抗菌肽LL-37突变体基因前端加上组氨酸标签并引入限制性内切酶EcoR的酶切位 点，后端加上一个终止密码子并引入限制性内切酶XbaI的酶切位点，合成密码子优化基因， 连接到大肠杆菌克隆载体PUC57上，得到重组载体pUC57-LL-37 revised。
[0030] (2)重组抗菌肽LL-37突变体基因的表达载体构建 选择PPICZaA作为载体，将上述重组载体pU57-LL-37 revised经酶切、纯化后与pPICZa A按照3:1的分子数进行连接，进行转化与诱导表达。
[0031] 连接体系的配制:2.5yL酵母表达载体PPICZaA，9. OyL纯化的核酸片段，4. OyL连接 酶缓冲液（10倍），〇.5yL T4连接酶，用二次蒸馏水补充至40yL混合均匀，在16°C条件下放置 12h，形成混合物备用。连接产物转化至感受态的大肠埃希菌感受态细胞DH5a中，筛选重组 质粒。
[0032] (3)重组抗菌肽LL-37突变体基因的毕赤酵母工程菌构建 将筛选的重组质粒进行测序，测序正确的质粒经SacI线性化处理后，转入毕赤酵母 63115。接种入51111^?0液体培养基中，30°(：，250印111振荡培养2411，取11^上述培养菌液接入 3001111710001^锥形瓶的￥1^液体培养基中，30°(：，250印111培养至光密度(00)达到1.3-1.5后， 在4°C，1500g离心5min，丢弃上清液，加入300mL的预冷二次蒸馏水重悬菌体，在4°C，1500g 离心5min，丢弃上清液，加入150mL的预冷二次蒸馏水重悬菌体，在4°C，1500g离心5min，丢 弃上清液，加入20mL的预冷lmo 1/L无菌山梨醇溶液重悬菌体，离心后，丢弃上清液，加入ImL 的预冷lmoI/L无菌山梨醇溶液(含10%-15%甘油），轻轻混匀后，IOyL每管分装备用。加入1 Ομ L线性质粒至IOOyL毕赤酵母菌GSl 15感受态细胞中，轻轻摇匀后将混合物转移至电转杯中， 将电转杯至于冰块上5-10min，电击IOms，电压为IOms，电阻为200 Ω，电击完成后立即加入 ImL预冷山梨醇溶液，婚后后转至1.5mL离心管中，30°C静置或缓慢摇菌培养lh。取200yL菌 液涂布在含l〇〇yg/mL Zeocin的YH)平板上，30°C培养3天后，平板上即长出克隆，随机挑选 10个克隆，并在含Zeocin的YPD平板上划线纯化，通过PCR鉴定阳性克隆菌pPICZaA-LL37 revised/GS115〇
[0033] (4)重组抗菌肽LL-37突变体的诱导表达及纯化 挑取经PCR鉴定的阳性克隆，接种至20mL BMGY培养基中，30°C，300 rpm培养16-18 h 至0D600=5; 3000g离心5 min收集菌体，加入少量BMGY培养基重悬菌体至0D600=1时转接至 200 mL BMGY培养基中，30°C，300rpm摇菌培养并进行诱导表达;每24h向培养基中补加100% 甲醇至其终浓度达0.5%，连续诱导72 h，将培养后的菌液经超声处理，裂解细胞，离心后洗 涤、溶解;3000g离心5min收集培养上清定容后，缓慢加入固体硫酸铵至其饱和度达到80%， 置于4 °C沉降过夜；1000 Og离心30min收集蛋白沉淀，加入TBS (pH 7.5)溶解蛋白沉淀 后，在TBS缓冲液中充分透析;4°C，8000g离心30min，取上清，使用0.45 μπι滤膜进行抽滤，除 去大蛋白颗粒；将TBS平衡的蛋白样品上到TBS充分清洗的Ni-NTA亲和层析柱 (GEHealthcare)中，再用TBS清洗柱子；用含200mM咪挫的TBS缓冲液洗脱，并收集洗脱峰，将 收集的蛋白样品于PBS缓冲液中充分透析，即得到了抗菌肽LL-37突变体蛋白。
[0034] (5)抗菌肽LL-37突变体检测 采用高效液相色谱分析上述抗菌肽LL-37突变体蛋白纯度，参见图6;采用质谱测定抗 菌肽LL-37突变体的分子大小，参见图7。
[0035]从图6可以看出，从IOmiη开始无杂峰出现，抗菌肽LL-37突变体的出峰时间为 12.078min，波峰单一、波形呈正态分布，抗菌肽LL-37突变体纯度达到96.85%，可以用于抑 菌实验等活性的研究。图7的质谱图显示，突变体的分子量为4505.4 Da，与理论估计的分子 量一致，说明该物质是目的多肽。
[0036]实施例2抗菌肽LL-37突变体的应用 将本发明的抗菌肽LL-37突变体加入按照药剂学上常用辅料，制成注射剂、喷雾剂、滴 剂、贴剂、软膏剂等。
[0037]实施例3抗菌肽LL-37及其突变体的理化性能 利用蛋白质在线分析工具和蛋白质分析软件Antheprot，分析抗菌肽LL-37及其突变体 的系列及其理化性能，得到抗菌肽LL-37及其突变体的核苷酸系列和理化性能表，分别见下 表2和表3所不。
[0038]
从上表3可以看出，抗菌肽LL-37突变体的理论等电点明显提高、半衰期明显延长，说明 在相同PH环境下，抗菌肽LL-37突变体的净电荷量明显提高、体外稳定性更好；突变体的螺 旋程度和亲疏水性与抗菌肽LL-37相比，未见明显差异，参见附图5。
[0039] 实施例4抗菌肽LL-37突变体的抑菌活性 将合成所得的多肽，采用抑菌实验研究其抗菌活性。以临床收集分离得到的11种致病 大肠埃希菌和2种大肠埃希菌标准菌株为抑菌对象，利用美国临床和实验室标准协会 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2012版检验标准及操作规范文 {φΜΟΤ-ΑΘ：Methods for Dilution Antimicrobial susceptibility Tests for Bacterial That Grow Aerobically；Approved Standard-Ninth Edition做抑菌实验，研 究多肽的抗菌活性。
[0040] 图 8-图20 表示经过浓度为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、500yg/mL 的抗菌 肽LL-37及其突变体处理过后的13株大肠埃希菌的光密度(OD)值的变化，结果显示抗菌肽 LL-37及其突变体对13株大肠埃希菌均有不同程度抑制作用。
[0041] 图8表示LL-37及其突变体对临床1号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为2.5 yg/ mL时，LL-37突变体对临床1号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强(p〈0.05)。
[0042] 图9表示LL-37及其突变体对临床2号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为0.625 μ g/mL时，LL-37突变体对临床2号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强(ρ〈0.05)。
[0043]图10表示LL-37及其突变体对临床3号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为0.625 yg/mL时，LL-37突变体对临床3号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强(ρ〈0.05)。
[0044] 图11表示LL-37及其突变体对临床4号菌株的抑菌作用，结果显示LL-37与其突变 体对临床4号菌株的抑菌能力相当。
[0045] 图12表示LL-37及其突变体对临床5号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为2.5 μ g/mL时，LL-37突变体对临床5号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强(ρ〈0.05)。
[0046]图13表示LL-37及其突变体对临床6号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为0.625 yg/mL时，LL-37突变体对临床6号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强(ρ〈0.05)。
[0047]图14表示LL-37及其突变体对临床7号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为1.25 μ g/mL时，LL-37突变体对临床7号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强(ρ〈0.05)。
[0048]图15表示LL-37及其突变体对临床8号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为1.25μ g/mL时，LL-37突变体对临床8号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强(ρ〈0.05)。
[0049]图16表示LL-37及其突变体对临床9号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为5yg/mL 时，LL-37突变体对临床9号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强(p〈0.05)。
[0050]图17表示LL-37及其突变体对临床10号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为1.25 yg/mL时，LL-37突变体对临床10号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强(p〈0.05)。
[00511图18表示LL-37及其突变体对临床11号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为1.25μ g/mL时，LL-37突变体对临床11号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强(ρ〈0.05)。
[0052]图19表示LL-37及其突变体对ATCC25922菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为 0.625yg/mL时，LL-37突变体对ATCC25922菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p〈 0.05)〇
[0053]图20表示LL-37及其突变体对ATCC35218菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为 0.625yg/mL时，LL-37突变体对ATCC35218菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p〈 0.05)〇
[0054]从上述抑菌实验结果可以得出，LL-37及其突变体对13种不同大肠埃希菌株的最 小抑菌浓度(MIC)，见下表4。
[0055]从表4可以看出，抗菌肽LL-37及其突变体对13株不同大肠埃希菌株的最小抑菌浓 度均< 20yg/mL，除临床4号菌株最小抑菌浓度相同外，抗菌肽LL-37突变体对其他12株大肠 埃希菌的最小抑菌浓度(MIC)均明显小于LL-37( p<0.01)。
[0056]实施例5抗菌肽LL-37突变体的稳定性 根据抑菌实验确定突变体的最低抑菌浓度，选择浓度为1.25yg/mL的抗菌肽LL-37及其 突变体、硫酸多粘菌素 B分别作用于ATCC25922大肠埃希菌标准菌株，分别经过6h、12h、24h、 48h处理后，抗菌肽LL-37及其突变体、硫酸多粘菌素 B对ATCC25922大肠埃希菌标准菌株的 抑菌效果，参见图21所示。硫酸多粘菌素 B是目前临床使用的多肽类抗生素，它主要通过干 扰细菌膜通透性与核糖体功能而发挥抗菌作用，对革兰阴性杆菌，如大肠杆菌、绿脓杆菌、 副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等有抑制或杀菌作用。 [0057] 从图21可以看出，抗菌肽LL-37突变体经过6h、12h、24h、48h作用于ATCC25922大肠 埃希菌标准菌株均可明显抑制大肠埃希菌的增殖，其抑菌效果明显好于硫酸多粘菌素 B(P〈 0.05)和抗菌肽LL-37(p〈0.01)。浓度为1.25yg/mL的LL-37突变体经过48h作用后，仍能较好 的抑制ATCC25922大肠埃希菌标准菌株，由此可见，抗菌肽LL-37突变体的稳定性好。
【主权项】
1. 一种人源抗菌肽LL-37突变体，其特征在于:所述序列中第一个氨基酸为甘氨酸(G)， 第三个氨基酸为亮氨酸(L)，第十六个氨基酸为谷氨酰胺(Q)，第二十六个氨基酸为赖氨酸 (K)，第三十四个氨基酸为苏氨酸(T)，第三十五个氨基酸为精氨酸(R)，其它氨基酸残基序 列不变。2. -种分离的多核苷酸，其特征在于:所述多核苷酸编码的多肽与人源抗菌肽LL-37相 比，人源抗菌肽LL-37中的1号位亮氨酸、3号位甘氨酸、16号位谷氨酸、26号位天冬氨酸、34 号位精氨酸、35号位苏氨酸被分别替换成:甘氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、精氨 酸。3. -种载体，其特征在于:所述载体中含有如权利要求2所述的多核苷酸。4. 一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于:所述宿主细胞中含有如权利要求3所述的 载体。5. -种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 利用蛋白质在线分析工具ExPasy、序列对比软件MEGA software、蛋白质分析软件 Antheprot、分子对接软件auto dock和动力学模拟软件ADF2014 (Amsterdam Density Functional)对抗菌肽LL-37的序列进行分析，为抗菌肽LL-37突变体设计提供理论基础； (2) 以分子对接和动力学模拟的结果为基础，对抗菌肽LL-37部分氨基酸残基进行替换 或顺序调整，得到其突变体，在抗菌肽LL-37突变体基因的两端引入限制性酶切位点，通过 酶切操作连接到酵母表达载体上； (3) 将表达载体转化导入GS115酵母菌中，经提取后鉴定得到重组基因工程菌； (4) 重组基因工程菌经诱导表达后离心分离收集上清液，经分离纯化获得重组抗菌肽 LL-37突变体蛋白。6. 根据权利要求5所述的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，其特征在于： 所述抗菌肽LL-37突变体基因前端加上组氨酸标签并引入限制性内切酶EcoR的酶切位点， 后端加上一个终止密码子并引入限制性内切酶Xbal的酶切位点。7. 根据权利要求5所述的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，其特征在于： 所述载体为pPICZaA。8. 根据权利要求5所述的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，其特征在于： 所述酵母菌为毕赤酵母。9. 根据权利要求5所述的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，其特征在于： 所述分离纯化方法为盐析、沉淀、液相层析技术和透析的结合。10. -种人源抗菌肽LL-37突变体的应用，其特征在于:所述突变体用于(a)抑制细菌、 病毒的生长繁殖及肿瘤细胞的增殖;或(b)杀灭细菌、病毒。
【文档编号】C07K14/47GK105859867SQ201610366249
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】杨浩, 刘俊, 付靖瑜, 韩跃武, 罗鹏程, 汪宏良
【申请人】黄石市中心医院