嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化cd30靶向性的nkt细胞及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化CD30靶向性的NKT细胞及其应用，所述嵌合抗原受体为CD30ScFv?CD8?CD137?CD3ζ，由CD30ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。采用本发明的嵌合抗原受体CD30ScFv?CD8?CD137?CD3ζ修饰的NKT细胞治疗CD30阳性的霍奇金淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤时，对淋巴瘤细胞具有很好的特异杀伤活性，且对已经过多次治疗(如采用CD30单克隆抗体结合细胞毒素药物或者放射性同位素治疗等)但均无明显疗效的CD30阳性的霍奇金淋巴瘤患者有一定的治疗效果。
【专利说明】
嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化CD30靶向 性的NKT细胞及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受 体⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ及其基因和重组表达载体、工程化⑶30靶向性的NKT细胞 (CAR30-NKT细胞）及其应用。
【背景技术】
[0002] 自然杀伤细胞（NKT)是一种特殊类型的T淋巴细胞亚群，具有T细胞和NK细胞细 胞两重性质。NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-Pl两种受体，在TCR和NKR介导 下，NKT细胞能够产生大量的IL-4及INF γ，对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。NKT细胞通过自 身表面的⑶16与特异性抗体的Fc段结合，发挥ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)作用。但在抗体依赖的细胞介导的杀伤作用过程中，由于抗体能与革El细胞上 的相应抗原表位特异性结合，NKT细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，因此抗体与靶细 胞上的抗原结合是特异性的，但NKT细胞对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。另外，通常情 况下，输注的NKT细胞在患者体内半衰期为2周左右，有效期短暂，需要反复多次输注。另 外，NKT细胞本身缺少特异性抗体，不足以在肿瘤周围或者瘤巢中富集，制约了 NKT细胞对 恶性肿瘤的靶向治疗。而且，研究表明，NKT细胞不是对所有的肿瘤都有杀伤效果，对部分 肿瘤的杀伤作用比较弱，特异杀伤活性有待提高。
[0003] ⑶30抗原是一个120kDa糖蛋白，属于TNF/nerve生长因子受体家族成员，几乎表 达于所有的霍奇金淋巴瘤、部分非霍奇金淋巴瘤及被病毒感染的淋巴细胞表面。由于以上 特性，CD30抗原成为抗体为基础治疗的理想靶点。目前，在治疗复发难治性霍奇金淋巴瘤 患者过程中，临床研究通常采用CD30单克隆抗体结合细胞毒素药物或者放射性同位素的 方案，这种方案在产生一定临床效应的基础上，同时也存在一定的缺陷，如：CD30单克隆抗 体靶向效应的短暂性及CD30单克隆抗体在肿瘤部位分布的不足等。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术中NKT细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀 伤活性有待提高以及现有临床研究中CD30单克隆抗体存在的上述缺陷，提供一种嵌合抗 原受体⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ及其基因和重组表达载体、工程化⑶30靶向性的NKT 细胞（CAR30-NKT细胞）及其应用。
[0005] 本发明的发明人在研究中意外发现，采用嵌合抗原受体 ⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修饰的NKT细胞治疗⑶30阳性的霍奇金淋巴瘤及非霍奇金淋 巴瘤时，对淋巴瘤细胞具有很好的特异杀伤活性，且对已经过多次治疗（如采用CD30单克 隆抗体结合细胞毒素药物或者放射性同位素治疗等）但均无明显疗效的CD30阳性的霍奇 金淋巴瘤患者有一定的治疗效果。
[0006] 因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合 抗原受体为 CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ，由 CD30 单链抗体 CD30ScFv、CD8 的铰链区（hinge 区）和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3 ζ的胞内信号结构域串联构成。
[0007] 第二方面，本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。
[0008] 第三方面，本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。
[0009] 第四方面，本发明提供了一种工程化⑶30靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是上 述嵌合抗原受体CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修饰的NKT细胞。
[0010] 第五方面，本发明提供了上述工程化CD30靶向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤 的制剂中的应用。
[0011] 在治疗CD30阳性的霍奇金淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤时，本发明的嵌合抗原受体 CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修饰的NKT细胞，即工程化CD30靶向性的NKT细胞能够特异性 结合CD30抗原，明显延长免疫细胞在患者体内的存活时间，增强免疫细胞靶向识别霍奇金 淋巴瘤细胞及非霍奇金淋巴瘤细胞CD30抗原的能力，加强对霍奇金淋巴瘤细胞及非霍奇 金淋巴瘤细胞的特异杀伤活性，而且对已经过多次治疗（如采用CD30单克隆抗体结合细胞 毒素药物或者放射性同位素治疗等）但均无明显疗效的CD30阳性的霍奇金淋巴瘤患者有 一定的治疗效果。本发明的工程化CD30靶向性的NKT细胞为治疗CD30阳性的霍奇金淋巴 瘤及非霍奇金淋巴瘤提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。
[0012] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0013] 图1为流式细胞术对分离培养的NKT细胞表型分析的结果。
[0014] 图2为本发明的慢病毒表达载体pWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的限制性内切酶MluI/ Sail双酶切片段的电泳鉴定图。
[0015] 图3为本发明的慢病毒表达载体pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的限制性内切 酶BamHI/Sall双酶切片段的电泳鉴定图。
[0016] 图4为本发明的慢病毒表达载体pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的结构示意 图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。
[0017] 图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体⑶30ScFv_⑶8-⑶137-⑶3 ζ的病毒浓 缩液对NKT细胞的感染效率。
[0018] 图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修饰的NKT细 胞（CAR30-NKT细胞）表型鉴定的结果。
[0019] 图7为本发明的CAR30-NKT细胞对⑶30阳性的人霍奇金淋巴瘤细胞的杀伤作用 的细胞毒性分析图。
[0020] 图8为本发明的CAR30-NKT细胞对⑶30阳性的霍奇金淋巴瘤患者治疗过程中，患 者白细胞总数、淋巴细胞总数、患者体温水平及白介素6水平的变化趋势图。
[0021] 图9为本发明的CAR30-NKT细胞对⑶30阳性的霍奇金淋巴瘤患者（肝转移）治 疗前后，患者肝转移病灶的影像图变化。
【具体实施方式】
[0022] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0023] 本发明提供了 一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为 CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ，由 CD30 单链抗体 CD30ScFv、CD8 的铰链区和跨膜区、CD137 的 胞内信号结构域和CD3G的胞内信号结构域串联构成。优选情况下，嵌合抗原受体的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0024] 本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。优选情况下，编码上述嵌合抗原受 体的基因的核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
[0025] 本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。优选情况下，重组表达载体为慢病 毒表达载体。对于慢病毒表达载体没有特别的限定，只要能够与辅助载体共转染包装细胞 如293T包装细胞，获得病毒浓缩液及嵌合抗原受体⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修饰的NTK 细胞即可，优选情况下，慢病毒表达载体为pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。
[0026] 对于慢病毒表达载体pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的制备方法没有特 别的限定，可以为本领域技术人员能够想到的各种方法，优选情况下，慢病毒表达载体 pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3G的制备方法包括以下步骤：
[0027] (1)从NKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞 内信号结构域和CD3G的胞内信号结构域，并克隆至载体pWPT-GFP中，构建得到 pWPT-CD8-CD137-CD3G ;
[0028] (2)合成编码大鼠生长激素信号肽和⑶30ScFv的核苷酸序 列，并克隆至PWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ中，经测序验证后得到序列正确的 pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。
[0029] 步骤（1)中，对于从NKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的 胞内信号结构域和CD3 ζ的胞内信号结构域的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的 各种方法，例如可以为RT-PCR法。其中，NKT细胞可以通过分离人静脉血中的单个核细胞， 然后进行培养获得。
[0030] 具体地，得到pWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的方法可以包括：提取NKT细胞的总RNA， 逆转录获得NKT细胞cDNA，以得到的NKT细胞cDNA为模板，利用引物Pl (SEQID NO. 11)和 P2(SEQID NO. 12)进行PCR扩增获得CD8基因的hinge区和跨膜区（SEQID NO. 3);利用引 物P3(SEQID NO. 13)和P4(SEQID NO. 14)进行PCR扩增获得CD137基因的胞内信号结构域 (SEQID NO. 4);利用引物 P5 (SEQID NO. 15)和 P6 (SEQID NO. 16)进行 PCR扩增获得 CD3 ζ 基 因的胞内信号结构域（SEQID NO. 5)，将获得的PCR产物分别进行双酶切，然后与Mlul/Sall 双酶切后的慢病毒表达载体PWPT-GFP连接。
[0031] 步骤（2)中，对于合成编码大鼠生长激素信号肽和⑶30ScFv的核苷酸序列的方法 没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以通过全基因合成技术合成。
[0032] 具体地，得到序列正确的pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的方法可 以包括：通过全基因合成技术合成编码大鼠生长激素信号肽和CD30ScFv融合基 因的核苷酸序列（SEQID NO. 8)，克隆至载体pGSI中，得到pGSI-CD30ScFv ;然 后将pGSI-CD30ScFv进行BamHI/MluI双酶切，与BamHI/MluI双酶切后的步骤 (1)得到的重组质粒PWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ连接，经测序鉴定，得到序列正确的 pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。其中，大鼠生长激素信号肽的核苷酸序列如SEQID NO. 6 所示，CD30ScFv核苷酸序列如SEQID NO. 7所示。
[0033] 本发明还提供了一种工程化⑶30靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是由上述嵌合 抗原受体 CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 修饰的 NKT 细胞（即 CAR30-NKT 细胞）。
[0034] 对于工程化⑶30靶向性的NKT细胞的制备方法没有特别的限定，可 以为本领域技术人员能够想到的任何方法，优选情况下，该方法包括：包装携带 pWPT-⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ编码基因的慢病毒；利用得到的慢病毒感染NKT细胞，使 NKT细胞表达嵌合抗原受体CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。
[0035] 对于包装携带pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ编码基因的慢病毒的方法没 有特别的限定，可以为本领域技术人员常用的各种方法，优选情况下，将慢病毒表达载体 pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3G 与辅助质粒（如 psPAX2、pMD2.G)共转染 293Τ 包装细胞， 转染48-72h时收集病毒上清，离心、过滤，在滤液中添加5XPEG6000-NaCl进行混匀，离心 后弃上清，沉淀用0-4°C预冷的无菌PBS溶解，获得病毒浓缩液。
[0036] 对于慢病毒感染NKT细胞的方法没有特别限定，可以为本领域常用的各种方法， 优选情况下，该方法包括：取IX 1〇7_5 X IO7个NKT细胞，弃掉旧的培养液，加入2-4mL新鲜 GT-T551培养液，再加入200-400 μ L病毒浓缩液、2-4 μ L I X 10 6mg/mL鱼精蛋白和终浓度 为800-1200U/mL的IL-2,置于30-37°C、饱和湿度为3-6%的CO 2培养箱中感染12-16h后， 弃培养液，将细胞转至未包被的培养瓶中，加入20-50mL的GT-T551培养基，再加入终浓度 为800-1200U/mL的IL-2,于30-37°C、饱和湿度为3-6%的CO 2培养箱中培养12-18h，获得 嵌合抗原受体CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修饰的NKT细胞。
[0037] 进一步优选地，慢病毒感染NKT细胞的方法还包括：将上述培养后获得的慢病毒 感染的NKT细胞用IL-2的终浓度为800-1200U/mL的GT-T551培养液进行体外诱导，待 细胞的密度为80-90%时将细胞转入细胞培养袋中，隔1. 5-2. 5天加入IL-2的终浓度为 800-1200U/mL的新鲜GT-T551培养液进行扩增培养并将细胞扩增至总量为I X 109-2 X IO9 个细胞。
[0038] 嵌合抗原受体⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修饰的NKT细胞表达的嵌合抗原受体 的成熟蛋白氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。其中，本领域技术人员应该理解的是，嵌合抗 原受体前体蛋白包括串联的信号肽、CD30ScFv、CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞内信 号结构域和CD3 ζ的胞内信号结构域，蛋白质翻译后在细胞内粗面型内质网切除信号肽后 成为成熟嵌合抗原受体蛋白，分泌输出后并定位于NKT细胞的细胞膜上。该嵌合抗原受体 的成熟蛋白氨基酸序列对应的基因编码序列如SEQID NO. 2所示。该嵌合抗原受体以基因 CD8的hinge区和跨膜区及CD137和CD3 ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导 结构域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示，对应的基因编码序列如SEQID NO. 10所示。
[0039] 本发明还提供了上述方法制备得到的工程化⑶30靶向性的NKT细胞。
[0040] 本发明还提供了工程化CD30靶向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的 应用。优选情况下，肿瘤是CD30阳性的淋巴瘤。所述淋巴瘤可以为霍奇金淋巴瘤或非霍奇 金淋巴瘤，进一步优选地，所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤。
[0041] 实施例
[0042] 以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
[0043] 以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所 用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，其中：
[0044] NKT细胞培养基GT-T551购自TaKaRa公司。
[0045] 淋巴细胞分离液购自TBD公司。
[0046] 0)3单克隆抗体、重组纤维连接蛋白（retronectin)均购自TaKaRa公司。
[0047] 重组人蛋白干扰素 -γ、重组人白介素 2购自protech公司。
[0048] 总 RNA 提取试剂盒 RNAiso Reagent、高保真 DNA 聚合酶（PrimeSTARK HS DNA Polymerase)、T4DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司。
[0049] RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit 购自 Fermentas 公司。
[0050] Bgl II、EcoRI、MluI、BamHI、Sal I 购自 Fermentas 公司。
[0051 ] 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天 根生化科技有限公司。
[0052] pWPT-GFP、psPAX2、pMD2· G 均购自 Addgene 公司。
[0053] pGSI购自北京天一辉远生物科技有限公司。
[0054] Transl-TlPhage Resistant化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。
[0055] Lipofectamine?2〇OOTransfection Reagent 转染试剂购自 Invitrogen 公司。
[0056] 293T包装细胞购自美国ATCC。
[0057] PEG6000-NaCl 中 PEG6000 终浓度为 25. 5 质量％，NaCl 终浓度为 I. 2M，PEG6000 和 NaCl均购自上海索莱宝生物科技有限公司。
[0058] 胎牛血清购自德国PAA公司。
[0059] ⑶30阳性的淋巴瘤细胞系karpas299及L428由南方医科大学提供。
[0060] 5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯购自上海谱振生物科技有限公司。
[0061] 膜联蛋白V-RPE试剂盒购自美国BD公司。
[0062] 所有引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。
[0063] 实施例1NKT细胞的制备
[0064] (1)取人静脉血于含肝素的真空管中。采用淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心方 法分离获得单个核细胞（PBMCs)。
[0065] (2)PBMCs洗三次后，采用含有0. 6体积％的胎牛血清的NKT细胞培养基GT-T551 调整细胞终浓度为2 X IO6个细胞/mL ;将细胞接种于预先经过终浓度为5 μ g/mL⑶3单克 隆抗体及终浓度为10 μ g/mL的retronectin包被的75cm2细胞培养瓶中。然后在培养基里 加入终浓度为1000U/mL的重组人蛋白干扰素-γ和1000U/mL的重组人白介素2,在37°C、 饱和湿度为5%的0) 2培养箱中培养。
[0066] (3)第四天，向培养瓶中补加 IOOmL含有0. 6体积％的胎牛血清的NKT细胞培养基 GT-T551，并加入终浓度为lOOOU/mL的重组人白介素2。于37°C、饱和湿度为5%的0)2培 养箱中培养4天，得到NKT细胞，流式细胞术对NKT细胞表型进行分析。结果见图1，其中 CD3+:49. 64% ;CD3+CD4+:27. 71% ;CD3+CD8+:21.93% ;CD3+CD56+:2. 95% ;CD8+CD56+:2. 86%。
[0067] 实施例2慢病毒表达载体pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的构建
[0068] (I) NKT 细胞 cDNA 的制备
[0069] 离心沉淀实施例1培养得到的NKT细胞，用总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent提 取细胞的总RNA，-80°C保存备用。提取的总RNA用逆转录试剂盒RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录得NKT细胞cDNA，-20°C保存备用。
[0070] (2)慢病毒质粒 pWPT-CD8-CD137-CD3 ζ 的制备
[0071] 设计并合成如下引物序列（其中，下划线标记为保护碱基，方框为酶切位点）：
[0072] pkseqid no. id ：gatc[acgcgtI ctgagcaactccatcatgtacttc
[0073] MluI
[0074] P2(SEQID NO. 12) ：GATC 1AGATCT[' GCAGTAAAGGGTGATAACCAGTGA
[0075] BglII
[0076] P3(SEQID NO. 13) ：GATC ^GATCTj AAACGGGGCAGAAAGAAACTCC
[0077] BglII
[0078] P4(SEQID NO. 14) ：GATC |〇AATTC[ CAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTCT
[0079] EcoRI
[0080] P5(SEQID NO. 15) ：GATC |GAATTC[ AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCG
[0081] EcoRI
[0082] P6 (SEQID NO. 16) ：GATC |GTCCtAC| TTAGCGAGGGGGCAGGGC
[0083] Sail
[0084] 以步骤⑴中NKT细胞cDNA为模板，用引物Pl和P2进行PCR扩增，得到长287bp 的⑶8的hinge区和跨膜区，核苷酸序列如SEQIDN0. 3所示，两端分别含有MluI和Bgl II酶 切位点和保护碱基；用引物P3和P4进行PCR扩增，得到长146bp的CD137胞内信号结构域， 核苷酸序列如SEQID NO. 4所示，两端分别含有Bgl II和EcoRI酶切位点及保护碱基；用引 物P5和P6进行PCR扩增，得到长359bp的⑶3 ζ的胞内信号结构域，核苷酸序列如SEQID NO. 5所示，两端分别含有EcoRI和Sail酶切位点及保护碱基。各步PCR扩增反应体系相 同，以扩增CD137胞内信号结构域为例，进行PCR扩增，PCR反应条件参照PdmeSTAR HS DNA Polymerase的说明书，反应体系（50 μ L)如下：
[0085] 双蒸水：32. 5 yL
[0086] 5 X 反应 buffer : 10 μ L
[0087] dNTP 混合物（每种 2. 5mM) :4 μ L
[0088] Ρ3 (IOmM) :1 yL
[0089] P4(IOmM) :1 yL
[0090] NKT 细胞 cDNA (200ng/ul) : 1 μ L
[0091] PrimeSTAR? HS DNA Polymerase ：0. 5 μ L
[0092] 将上述PCR产物用I %的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进 行DNA片段回收。得到片段后分别进行双酶切反应，酶切产物用普通DNA产物纯化试剂盒 回收备用。
[0093] 慢病毒表达载体pWPT-GFP用Mlul/SalI双酶切，酶切产物经1 %的琼脂糖凝 胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收大的载体片段，然后与之前回收的CD8、 CD137、CD3 ζ片段通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化Transl-TlPhage Resistant化 学感受态细胞，37°C培养16h后挑取单克隆，37°C，250rpm培养12h后用质粒小提试剂盒 提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶MluI和Sail双酶切鉴定，鉴定电泳图见图2,其 中，1泳道：DNA分子量标记D2000 ;2泳道：质粒pWPT-GFP的酶切片段（835bp) ;3泳道： 质粒pWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的酶切片段（756bp)。将鉴定正确的质粒送北京天一辉远 生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为 PWPT-CD8-CD137-CD3 ζ 〇
[0094] (3)慢病毒质粒 pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 的制备
[0095] 全基因合成编码大鼠生长激素信号肽和⑶30ScFv融合基因的核苷酸序列，序列 如SEQID NO. 8所示，由北京天一辉远生物科技有限公司合成，其5'端含有BamHI、kozak序 列，3'端含有MluI酶切位点，将前述融合基因克隆在质粒pGSI中，命名为pGSI-CD30ScFv。 质粒经BamHI/MluI双酶切，酶切产物经1 %琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试 剂盒回收目的片段备用。
[0096] pWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ质粒经限制性内切酶BamHI/MluI酶切，酶切产物经1 % 琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体片段备用。然后与回收的 含有大鼠生长激素信号肽和CD30ScFv的DNA片段通过T4DNA连接酶进行连接，具体方法 见说明书。将连接产物转化Transl-TlPhage Resistant化学感受态细胞，37°C培养16h 后挑取单克隆，3 7 °C，2 50r p m培养12 h后，用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒经 限制性内切酶BamHI/Sall双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，其中，Ml :DNA分子量标记 D2000 ;1 泳道：质粒pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 未酶切片段（10232bp) ;2 泳道：质粒 pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3G的酶切片段；M2 :DNA分子量标记D15000。将鉴定正确的 质粒送北京天一辉远生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确 的重组质粒命名为PWPT-⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ，其结构示意图如图4所示，其中包括 大鼠生长激素信号肽（核苷酸序列如SEQID NO. 6所示）、抗⑶30单链抗体（核苷酸序列 如SEQID NO. 7所示）、⑶8的hinge区和跨膜区及⑶137的胞内信号结构域和⑶3 ζ的胞 内信号结构域，其中，该嵌合抗原受体以基因 CD8的hinge区和跨膜区及CD137和CD3 ζ的 胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示，对 应的基因编码序列如SEQID NO. 10所示。
[0097] 实施例3嵌合抗原受体CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修饰的NKT细胞的制备
[0098] (1)慢病毒的包装和浓缩
[0099] 用分光光度计分别测定慢病毒表达质粒pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 和辅助质粒psPAX2、pMD2.G的浓度，三种质粒以4:2:1的质量比用 Lipofectamine?2000Transfection Reagent转染试剂共转染293T包装细胞。分别在转染 48h、72h时收集病毒上清于50mL EP管中，4°C，2000g离心10min，转移两次得到的上清至新 EP管中，用4. 5 μπι滤器过滤病毒上清；过滤的病毒上清与5XPEG6000-NaCl按照4:1的体 积比混匀，4°C静置2h，然后4°C，1000 Og离心20min，弃上清，沉淀用ImL的4°C预冷的无菌 PBS溶解，即得嵌合抗原受体的病毒浓缩液，按每管100 μ L进行分装，-80°C保存备用。
[0100] 按照上述方法，利用慢病毒表达质粒pWPT-GFP和辅助质粒psPAX2、pMD2. G共转染 293T包装细胞，收集病毒上清，浓缩，获得表达GFP绿色荧光蛋白的慢病毒浓缩液。
[0101] (2)慢病毒感染NKT细胞及感染后细胞的扩增培养
[0102] 取实施例1的在75cm2培养瓶中培养的I X 10 7个NKT细胞，弃掉旧的培养液，加入 2mL新鲜NKT细胞培养基GT-T551、200 μ L步骤（1)得到的病毒浓缩液、2 μ L I X 10 6mg/mL 鱼精蛋白，终浓度为lOOOU/mL的重组人白介素2,置于37°C、饱和湿度为5%的CO2培养箱 中感染12小时后，弃培养液，得到的NKT细胞称为CAR30-NKT细胞。同时用表达GFP绿色荧 光蛋白的慢病毒浓缩液对NKT细胞进行同步感染（得到的NKT细胞称为CART-GFP细胞）， 用于计算该病毒的感染效率。将感染后的细胞转至未经CD3和retronectin包被的75cm 2 培养瓶中，加入20mL的NKT细胞培养基GT-T551，再加入终浓度为lOOOU/mL的重组人白介 素2,于37°C、饱和湿度为5%的CO 2培养箱中培养18h。用流式细胞术检测该病毒的感染 效率，结果如图5所示，感染效率为36. 38%。
[0103] (3)体外诱导扩增CAR30-NKT细胞群
[0104] 将上述培养后的NKT细胞用重组人白介素2的终浓度为lOOOU/mL的NKT细胞培养 基GT-T551进行体外诱导，待细胞的密度为85%时将细胞转入细胞培养袋中，隔2天加入重 组人白介素2的终浓度为lOOOU/mL的新鲜NKT细胞培养基GT-T551进行扩增培养，待细胞 扩增到总量为I. 5X109个细胞左右后，采用流式细胞仪对感染的细胞群体进行鉴定，结果 见图 6，CD3+:89. 99% ;CD3 +CD4+:58. 18% ;CD3 +CD8+:31. 81% ;CD3 +CD56+:6. 38% ;CD8 +CD56+: 5. 37%。
[0105] 实施例4CAR30-NKT细胞对人霍奇金淋巴瘤细胞杀伤作用的细胞毒性分析
[0106] 分别取实施例3中制备的CAR30-NKT细胞、CART-GFP细胞和实施例1中培养的NKT 细胞接种于96孔板，用5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE)进行染色，与CD30阳性的淋巴 瘤细胞系1?1印&8299及1^428以效靶比（杀伤细胞 ：靶细胞）1:1，5:1，10:1，20:1，40 :1比率 进行共培养，经过24小时的共培养后，将细胞用膜联蛋白V-RPE试剂盒染色，同时设置对照 组分别为未加入免疫细胞杀伤处理的淋巴瘤细胞系karpas299及L428,并将细胞用膜联蛋 白V-RPE试剂盒染色。流式细胞术对细胞凋亡进行检测，细胞凋亡的量根据下面的公式计 算：凋亡率=(对照-样品）/对照X 100%，对照为未加免疫细胞杀伤处理的细胞存活数 目；样品为加入相对应的效靶比（杀伤细胞：靶细胞）的免疫细胞杀伤处理的细胞存活数 目，见图7。嵌合抗原受体⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修饰的NKT细胞对⑶30阳性淋巴瘤 细胞具有特异杀伤活性，且CAR30-NKT细胞的特异杀伤活性明显优于NKT细胞。
[0107] 实施例5CAR30-NKT细胞对⑶30阳性的霍奇金淋巴瘤患者的治疗效果
[0108] 取 5 X IO8个 CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 修饰的 NKT 细胞（即 CAR30-NKT 细胞）， 经过IOOrnl生理盐水稀释后，连续三天静脉回输到下述⑶30阳性的霍奇金淋巴瘤患者（在 利用本发明的CAR30-NKT细胞进行靶向免疫治疗前，已经过多次治疗（包括采用CD30单克 隆抗体结合细胞毒素药物或者放射性同位素治疗等），但均无明显疗效）体内，回输后对患 者的治疗状况进行评估。
[0109] 图8为血象分析CAR30-NKT细胞治疗⑶30阳性的霍奇金淋巴瘤患者过程中白细 胞总数、淋巴细胞总数、体温变化及白介素6水平的趋势图（FC为患者治疗前采取的清髓预 处理方案）。结果显示，霍奇金淋巴瘤患者治疗前表现为高热、炎症及骨痛症状（根据VAS 疼痛评分标准为7级骨痛），经CAR30-NKT细胞治疗后患者白细胞数目逐渐减少并趋于正 常状态，淋巴细胞数目逐渐增加（表明在⑶30阳性的霍奇金淋巴瘤患者体内CAR30-NKT细 胞能够逐渐扩增），同时患者体温及白介素6水平逐渐恢复至正常并能够维持在正常水平， 患者骨痛症状得到缓解（根据VAS疼痛评分标准为1级骨痛）。说明CAR30-NKT细胞治疗 ⑶30阳性的淋巴瘤患者是安全、可耐受的，而且CAR30-NKT细胞对⑶30阳性的霍奇金淋巴 瘤患者（经已有的多种治疗手段治疗后均无明显疗效）治疗后，对患者的疾病有一定的治 疗效果。
[0110] 图9为CT分析⑶30阳性的霍奇金淋巴瘤肝转移患者，经CAR30-NKT细胞治疗（一 个月）后，患者肝部位病灶变化。结果显示，霍奇金淋巴瘤患者治疗后肝病灶（参见箭头） 明显减少，进一步说明CAR30-NKT细胞对⑶30阳性的霍奇金淋巴瘤患者（经已有的多种治 疗手段治疗后均无明显疗效）治疗后，对患者的疾病有明显的治疗效果。
[0111] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0112] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0113] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ， 由⑶30ScFv、⑶8的铰链区和跨膜区、⑶137的胞内信号结构域和⑶3 ζ的胞内信号结构域 串联构成。2. 根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。3. 编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的基因。4. 根据权利要求3所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。5. 含有权利要求3或4所述的基因的重组表达载体。6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为慢病毒表达载体。7. 根据权利要求6所述的重组表达载体，其中，所述慢病毒表达载体为 pWPT-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。8. -种工程化CD30靶向性的ΝΚΤ细胞，其特征在于，所述ΝΚΤ细胞是由权利要求1或 2所述的嵌合抗原受体修饰的ΝΚΤ细胞。9. 权利要求8所述的工程化CD30靶向性的ΝΚΤ细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的 应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其中，所述肿瘤是CD30阳性的淋巴瘤，优选地，所述淋 巴瘤为霍奇金淋巴瘤。
【文档编号】A61K35/17GK105859890SQ201510024857
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月19日
【发明人】伍志强, 韩为东, 王瑶, 郭业磊, 代汉仁, 王晓慧, 王春萌
【申请人】西比曼生物科技（上海）有限公司