一种蜜环菌反复分割补料发酵工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种蜜环菌反复分割补料发酵工艺，发酵培养基为：玉米粉6％，豆粕2％，无水乙醇0.3％，VB1 0.003％，磷酸二氢钾0.15％，七水硫酸镁0.075％，α?淀粉酶0.01％，pH为3，在25－28℃，160r/min，通气比0.25－1.0V/V.min培养。发酵5—6天，至生物量达到30g/L以上，将发酵液分割到3－5个同体积发酵罐，一次性补充灭菌的发酵培养基，进行反复补料发酵。依此工艺，视蜜环菌的生长状况，可继续分割2－5次，采用了反复分割补料发酵工艺，减少了种子培养周期，工作量减少，设备利用率提高；接种量增大，降低杂菌污染；可以缩短生产周期；生物量大；工艺稳定。
【专利说明】
一种蜜环菌反复分割补料发酵工艺
技术领域
[0001]本发明涉及一种蜜环菌分割发酵工艺，具体涉及蜜环菌的培养基成分，培养条件，以及后续的工艺改进，属于液态发酵技术领域。
【背景技术】
[0002]蜜环菌是属于担子菌门、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属，其能与传统中草药猪苓和天麻有一种特殊的共生关系。根据生长和发育阶段的不同，蜜环菌可分为菌丝体与子实体两部分，菌丝体作为蜜环菌的营养器官，其有菌丝或菌索两种形态存在，而子实体是蜜环菌发育成熟的蘑菇。蜜环菌液体深层发酵技术能获得大批量的菌丝体以及代谢产物。液体深层发酵技术最早始于20世纪40年代中期抗生素的生产，它是利用给菌种提供最适的培养基成分，以及培养条件，从而获得相关产物。实现药用真菌工业化生产的主要途径就是通过液体深层发酵技术，我国是在1958年开始研究真菌的液态深层发酵，在20世纪60末实现了大规模生产药用真菌。液体深层发酵技术与传统的固态发酵相比，有能实现连续化生产，缩短发酵周期以及产生丰富的生理活性物质等优点，蜜环菌液态发酵产物中有核苷类，多糖类，氨基酸类以及倍半萜类化合物等活性成分，其中核苷类化合物具有增强机体免疫力，抗肿瘤，抗病毒等多种生理活性，多糖类化合物延缓衰老，增强免疫力以及辐射保护作用，氨基酸类是构建生命体大分子活性物质的原料，能为机体提供营养，蜜环菌菌丝体以及发酵液都具有良好的神经调节，脑保护作用，还能增强血流量，调节机体免疫力等生理活性，在这些方面具有跟天麻相同的药理效果。
[0003]真菌类的发酵工艺一般都存在发酵周期过长，从而原料利用率低，生产能力低，大大提高了生产成本。分割发酵是利用菌种发酵到生长对数后期，分离出一定比例的发酵液，然后在加入相同比例的培养基继续发酵，继续连续分割，使菌种一直保持较快的生长速度，由于蜜环菌前期种子液生长缓慢，而分割发酵工艺能省去前期制备种子的过程，从而缩短发酵周期，提高设备利用率，大大降低生产成本。分割发酵工艺对蜜环菌的发酵生产以及工艺质量监控有良好的指导作用，促进蜜环菌产业化生产具有良好的应用意义和现实意义，能带来良好的经济效益。
[0004]蜜环菌液态发酵的产物经离心或者过滤后分离得到菌丝体和发酵液，发酵液经浓缩后得到蜜环菌浓缩液，随着人们对蜜环菌相关药理活性成分研究的深入，市场上关于蜜环菌液态发酵产物相关产品的开发也越来越多，目前国内有关产品主要有三类:①根据蜜环发酵液经浓缩后制得产品，如脑心舒口服液，该产品主治滋补强壮，镇静安神。身体虚弱，心神不安，失眠多梦，神经衰弱，头痛眩晕的人可以服用。②根据蜜环菌发酵分离后的菌丝体制得产品，如蜜环菌片和晕痛片，蜜环菌片能有效降低高胆固醇血症和高甘油三酯血病，晕痛定能有效预防头痛，对神经性疾病有很好的预防和治疗效果。③对蜜环菌菌丝体进行有效提取，然后跟发酵液一起混合而得到的相关产品有蜜环菌糖浆和健脑露，蜜环菌糖浆主治神经衰弱，失眠多梦以及美尼尔综合征，健脑露能有效增强体质，降低高血压以及神经发弱等症状。
【发明内容】
[0005]发明目的:本发明提供一种利于蜜环菌液态培养的最佳培养基，培养条件，以及在此基础上进行分割发酵，确定分割时间，分割比例和分割培养时间，再进行分割级数的确定，从而提高蜜环菌液态发酵生物量以及缩短发酵培养的时间。
[0006]技术方案:蜜环菌经过固体种子、摇瓶种子、发酵罐种子培养过程，再进入生产发酵罐，可以在生产发酵罐进行2 — 5次的分割，然后进行补料反复发酵。其工艺过程:
[0007](I)蜜环菌固态种子培养与活化
[0008](2)蜜环菌摇瓶种子培养[0009 ] (3)蜜环菌种子罐发酵培养
[0010](4)种子成熟后移种到生产发酵罐，控制条件进行发酵培养
[0011](5)当培养至稳定期，菌丝增长缓慢，将发酵液分割至3—5个同体积发酵罐，补充同样发酵培养基，继续发酵培养
[0012](6)依此工艺，视蜜环菌的生长状况，继续分割2 — 5次。
[0013]—种蜜环菌反复分割补料发酵工艺，进一步的技术方案是:
[0014]蜜环菌反复分割补料发酵工艺，种子罐培养基为:糊精30g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水硫酸镁0.75g/L，pH为3，在22 — 25 °C，160r/min，通风比0.5-1.0V/V.min发酵培养8天，菌丝量大于30g/L。
[0015]蜜环菌反复分割补料发酵工艺，发酵培养基为:玉米粉6%，豆柏2%，无水乙醇
0.3%,VBl 0.003%,磷酸二氢钾0.15%,七水硫酸镁0.075%,α-淀粉酶0.01%,pH为3，培养条件为:温度25 — 28 0C，搅拌转速160r/min，通气比0.5 — 1.0V/V.min。
[0016]蜜环菌反复分割补料发酵工艺，当发酵培养5— 6天，菌丝生物量达到30g/L以上，将发酵液分割至3 — 5个同体积发酵罐，一次性补充灭菌的发酵培养基，继续进行发酵。
[0017]蜜环菌反复分割补料发酵工艺，可分割级数为2— 5次。当分割后培养6天，菌丝量低于25g/L时，分割工艺全程结束。
[0018]有益效果:1.本发明阐述了蜜环菌液态发酵工艺最佳培养基成分以及最佳培养条件，大大提高了蜜环菌液体发酵生物量。2.本发明结合分割发酵工艺，分割比例为20 —30%，培养5 —6天，此时菌丝量干重可达30g/L以上。且在此条件下能连续分害U2 —5次，大大缩短了发酵培养时间，效率高，工艺简易稳定，容易操作控制，适合大工业生产，成本低。3.蜜环菌液态发酵后，菌丝体可制成蜜环菌片以及相关产品，发酵液经浓缩后可制成脑心舒口服液，具有广阔市场前景以及良好经济价值。
【附图说明】
[0019]图1为蜜环菌种子培养生长曲线
【具体实施方式】
[0020]实施例一:
[0021]1.制备固体试管种子
[0022]试管下层:80g/L麸皮与40g/L玉米粉混匀，煮成糊状后填于试管底部5-7cm高；试管上层:马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸一氢钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，琼脂17g/L，pH自然。待麸皮下层装入后向试管内倒入5ml上层培养基，115°C20min灭菌。在无菌条件下，用接种铲将蜜环菌菌种接种到固体试管培养基上，菌丝块铺满试管平面即可，28°C培养15-20天，待白色菌丝长满试管底部即可。
[0023]2.种子活化
[0024]糊精30g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水硫酸镁0.75g/L，调节pH至3，然后分装至250ml的三角瓶中，装液量为100ml，于115°C20min灭菌。在无菌条件下，将固体试管培养基活化好的菌种用接种铲铲取0.25cm2大小的菌苔3-4块接种到灭过菌的三角瓶中，于摇床上，25°C、160r/min培养7-10天左右。
[0025]3:摇瓶种子液制备
[0026]种子液培养基:玉米粉6%，豆柏2%，无水乙醇0.3%，VB1 0.003%，磷酸二氢钾
0.15%,七水硫酸镁0.075%,α-淀粉酶0.01%；调节pH 3，然后分装至三角瓶中，装液量为100ml，于115°C20min灭菌。在无菌条件下，接种1ml活化培养基种子液于种子液培养基中，25°C，160r/min培养8 天。
[0027]4.发酵种子液制备
[0028]发酵种子液培养基配方:糊精30g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氢钾
1.5g/L，七水硫酸镁0.75g/L，pH为3，于115 °C 20min灭菌。在无菌条件下，接种1ml种子液于发酵培养基中，在240C，160r/min，通风比1.0V/V.min，发酵培养8天，菌丝量达到30g//L以上。
[0029]5.第一次发酵培养
[0030]发酵培养基配方:玉米粉6%，豆柏2%，无水乙醇0.3%，VB1 0.003%，磷酸二氢钾
0.15%,七水硫酸镁0.075%, α-淀粉酶0.01%, pH为3。115 °C 30min灭菌后，按发酵培养基体积接入10%的种子液，进行发酵培养。培养条件为:温度25°C，搅拌转速160r/min，通气比
0.5V/V.min，培养5天，菌丝生物量达到30g/L。
[0031]6.分割补料发酵
[0032]当第一次发酵培养5天，菌丝生物量达到30g/L，将发酵液分割成3个同体积发酵罐，一次性补充灭菌的发酵培养基，即玉米粉6%，豆柏2%，无水乙醇0.3%，VB10.003%，磷酸二氢钾0.15%,七水硫酸镁0.075%, α-淀粉酶0.01%, pH为3。培养条件为:温度26 °C，搅拌转速160r/min，通气比0.5V/V.min，培养6天，菌丝生物量达到30g/L以上。
[0033]7.分割发酵终点控制
[0034]当经过3次分割后，蜜环菌培养6天，菌丝量低于25g/L时，分割工艺全程结束。
[0035]实施例二:
[0036]1.制备固体试管种子、种子活化、摇瓶种子液制备、发酵种子液制备等培养基配方与操作同实施例一；
[0037]2.第一次发酵培养
[0038]发酵培养基配方:玉米粉6%，豆柏2%，无水乙醇0.3%，VB1 0.003%，磷酸二氢钾
0.15%,七水硫酸镁0.075%, α-淀粉酶0.01%, pH为3。115 °C 30min灭菌后，按发酵培养基体积接入10%的种子液，进行发酵培养。培养条件为:温度26°C，搅拌转速160r/min，通气比
0.7V/V.min，培养5天，菌丝生物量达到33g/L。
[0039]3.分割补料发酵
[0040]当第一次发酵培养5天，菌丝生物量达到33g/L，将发酵液分割成4个同体积发酵罐，一次性补充灭菌的发酵培养基，即玉米粉6%，豆柏2%，无水乙醇0.3%，VB10.003%，磷酸二氢钾0.15%,七水硫酸镁0.075%, α-淀粉酶0.01%, pH为3。培养条件为:温度26 °C，搅拌转速160r/min，通气比0.7V/V.min，培养6天，菌丝生物量达到33g/L以上。
[0041]4.分割发酵终点控制
[0042]当经过4次分割后，蜜环菌培养6天，菌丝量低于25g/L时，分割工艺全程结束。
[0043]实施例三:
[0044]1.制备固体试管种子、种子活化、摇瓶种子液制备、发酵种子液制备等培养基配方与操作同实施例一；
[0045]2.第一次发酵培养
[0046]发酵培养基配方:玉米粉6%，豆柏2%，无水乙醇0.3%，VB1 0.003%，磷酸二氢钾
0.15%,七水硫酸镁0.075%,α-淀粉酶0.01%, pH为3。115 °C 30min灭菌后，按发酵培养基体积接入10%的种子液，进行发酵培养。培养条件为:温度28°C，搅拌转速160r/min，通气比
1.0V/V.min，培养5天，菌丝生物量达到35g/L。
[0047]3.分割补料发酵
[0048]当第一次发酵培养5天，菌丝生物量达到35g/L，将发酵液分割成5个同体积发酵罐，一次性补充灭菌的发酵培养基，即玉米粉6%，豆柏2%，无水乙醇0.3%，VB10.003%，磷酸二氢钾0.15%,七水硫酸镁0.075%, α-淀粉酶0.01%, pH为3。培养条件为:温度28 °C，搅拌转速160r/min，通气比0.9V/V.min，培养6天，菌丝生物量达到35g/L以上。
[0049]4.分割发酵终点控制
[0050]当经过5次分割后，蜜环菌培养5天，菌丝量低于25g/L时，分割工艺全程结束。
[0051]本发明权利要求保护范围不限于上述实施例。
[0052]附:蜜环菌种子培养生长曲线确定
[0053]糊精30g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水硫酸镁0.75g/L，pH为3，在25°C，160r/min，通风比1.0V/V.min，发酵培养11天，每天测定菌丝量，以时间(天)和菌丝干重含量(g/L)制定曲线，见附图1。
【主权项】
1.一种蜜环菌反复分割补料发酵工艺，其特征在于，蜜环菌经过I次种子培养过程，进入生产发酵罐，在生产发酵罐进行2 — 5次的分割，然后进行补料反复发酵，其工艺过程为:(I)蜜环菌种子罐发酵培养，(2)种子成熟后移种到发酵罐，发酵培养，(3)当培养至稳定期，将发酵液分割至3—5个同体积发酵罐，补充培养基，继续发酵培养(4)依此工艺，视蜜环菌的生长状况，可继续分割2 — 5次。2.根据权利要求1所述的蜜环菌反复分割补料发酵工艺，其特征在于，种子罐培养基为:糊精30g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水硫酸镁0.75g/L，pH为3，在22 — 25°C，160r/min，通风比0.5 — 1.0V/V.min发酵培养8天，菌丝量大于30g/L。3.根据权利要求1所述的蜜环菌反复分割补料发酵工艺，其特征在于，发酵培养基为:玉米粉6%，豆柏2%，无水乙醇0.3%，VB1 0.003%，磷酸二氢钾0.15%，七水硫酸镁0.075%，α-淀粉酶0.01 %，PH为3，培养条件为:温度25 — 28°C，搅拌转速160r/min，通气比0.25-1.0V/V.mino4.根据权利要求1所述的蜜环菌反复分割补料发酵工艺，其特征在于当发酵培养5— 6天，菌丝生物量达到30g/L以上，将发酵液分割至3 — 5个同体积生产发酵罐，一次性补充灭菌的发酵培养基，继续进行发酵。5.根据权利要求1所述的蜜环菌反复分割补料发酵工艺，其特征在于可分割级数为2—5次，当分割后培养6天，菌丝量低于25g/L时，分割工艺全程结束。
【文档编号】C12R1/645GK105861327SQ201610341615
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月21日
【发明人】石振拓, 刘宇, 黄小莉
【申请人】湖北诺克特药业股份有限公司