一种氟磺胺草醚降解菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种降解氟磺胺草醚的芽孢杆菌(Bacillus sp.)FE?1，其保藏号为CCTCC M 2016044。本发明氟磺胺草醚降解菌在pH中性条件下对氟磺胺草醚的降解率最大，并且随着培养温度的逐步升高，其降解率逐渐变大。且该菌株具有很好的污染土壤修复潜能。因此，本发明氟磺胺草醚降解菌对污染环境中氟磺胺草醚残留的降解具有积极的意义。CCTCC NO: M201604420160118
【专利说明】
一种氟磺胺草醚降解菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种细菌，尤其涉及一种氟磺胺草醚降解菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 早在20世纪70年代国内就开始引进技术，生产、使用二苯醚类除草剂。早期主要在 水稻田使用除草醚和草枯醚；中后期主要开始在大豆田使用虎威、克阔乐等。随着国内该除 草剂研发技术的进步，以及大田使用技术的熟练掌握，进入本世纪初的几年间，由于大豆、 花生等油料作物种植面积的进一步扩大，田间杂草草相发生变化，以阔叶杂草为主的恶性 杂草发生日趋严重，导致二苯醚类除草剂市场产销两旺。
[0003] 氟磺胺草醚[化学名称5-(2-氯-4 一三氟甲基苯氧基)-N -甲磺酰-2-硝基苯甲酰 胺]，即为一种二苯醚类触杀型除草剂，主要用于防除大豆田的阔叶杂草。施药后可导致叶 片迅速枯萎，膜脂过氧化，破坏叶绿素，因其高效低毒的特性而得到广泛的应用。随着大豆 种植面积的扩大，氟磺胺草醚的应用面积逐年扩大。特别是近几年大豆田多年生阔叶杂草 抗性增加，以及恶性杂草的增加和天气原因导致氟磺胺草醚的用量急剧增加，使土壤中残 留了大量的氟磺胺草醚，不但污染了土壤环境，同时对后茬多种敏感作物造成要害，造成后 茬敏感作物减产甚至绝产，严重影响了农业种植结构的调整和农业生产的安全。因此，研究 如何降低氟磺胺草醚在土壤中的残留量，减少其对后茬作物及环境造成的污染具有重要的 理论和实践意义。
[0004] 研究表明，微生物降解是降低氟磺胺草醚在土壤中残留量的主要途径，因此，氟磺 胺草醚降解菌的筛选与土壤修复成为近几年我国学者研究的热点内容之一。目前，关于氟 磺胺草醚的降解菌已有若干报道。梁波等从被农药污染的大田中分离筛选到氟磺胺草醚降 解菌ZB-I，该菌同时也可降解乳氟禾草灵以及乙羧氟草醚。吴彩秋等利用富集培养技术从 长期施用氟磺胺草醚的土壤中分离得到1株能够以氟磺胺草醚为唯一碳源生长的细菌，命 名为F-12,该菌在最适条件下，培养2天后对氟磺胺草醚的降解效率达到80%以上，具有应 用到氟磺胺草醚污染土壤生物修复的能力。此外，弗氏志贺菌FB5、门多萨假单胞菌FB8、微 嗜酸寡养单胞菌BX3等被鉴定为具有降解氟磺胺草醚的作用。这些微生物资源的发掘对氟 磺胺草醚污染的土壤修复具有重要的意义。因此，分离纯化出一株高效降解菌，旨在为解决 氟磺胺草醚在土壤中的残留药害问题，丰富降解氟磺胺草醚的微生物资源，为该除草剂的 生物修复研究工作提供更多的有效途径。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种降解效率高、速度快的氟磺胺草醚降解菌及其应用。
[0006] -种氟磺胺草醚降解菌，分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)FE-l，保藏于位于 湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期 为2016年1月18日，保藏号为CCTCC M 2016044。
[0007] 该菌株主要形态及生物学特征为:革兰氏染色反应阳性，菌体杆状，无鞭毛，大小 约为(〇.75μηι~0.8μηι) X (2.7μηι~3.7μηι)，菌落呈乳黄色、圆形、边缘整齐、光滑湿润，在生 理盐水中不易分散，接触酶阳性，氧化酶阳性。该菌株16 S r D N A的G e n B a n k登陆号为 KU145775。
[0008] 本发明提供了一种含有上述氟磺胺草醚降解菌的菌剂，该菌剂可通过将上述氟磺 胺草醚降解菌与常规的附加剂混合后制成水剂或粉剂得到。
[0009] 本发明还提供所述氟磺胺草醚降解菌在去除水体中残留氟磺胺草醚中的应用。
[0010] 具体包括:将所述氟磺胺草醚降解菌接种于待处理的水体中，培养一段时间。
[0011] 本发明氟磺胺草醚降解菌能快速、高效地降解水体中的氟磺胺草醚，上述菌剂以 菌种终浓度为107cfu/mL在含0.5、1或10mg/L氟磺胺草醚的无机盐培养基(含2.5g/L LB培 养基和3.6g/L葡萄糖）中培养Hh后，0.5或ImgAi且的氟磺胺草醚残留量已低于检测下限 (0.0111^/1)，1011^/1组的降解率为82.9%，降解速率分别为0.036、0.071和0.59211^/(11· L)，对应的降解半衰期分别为5.36h、5.66h和5.57h。
[0012] 本发明氟磺胺草醚降解菌在pH为中性的条件下对氟磺胺草醚的降解效果最好。
[0013] 本发明氟磺胺草醚降解菌在温度为15°C、25°C或35°C时，对氟磺胺草醚的降解效 果依次提高，其中35°C时降解率达到93.3%。
[0014] 本发明又提供了所述的氟磺胺草醚降解菌在对氟磺胺草醚污染土壤的修复中的 应用。
[0015] 使用本发明氟磺胺草醚降解菌处理氟磺胺草醚污染的土壤，可明显恢复敏感作物 玉米的各项生物指标(株高和鲜重），且对玉米无药害作用。
[0016] 本发明氟磺胺草醚降解菌可快速、高效地降解水体和土壤中的残留氟磺胺草醚， 该菌株培养工艺简单，生产成本低廉，使用也非常方便，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明氟磺胺草醚降解菌的电镜图；
[0018] 图2为本发明氟磺胺草醚降解菌在纯培养条件下对不同浓度氟磺胺草醚的降解曲 线图；a:0· 5mg/L;b: lmg/L;c: 10mg/L
[0019] 图3为本发明氟磺胺草醚降解菌在不同pH值条件下对氟磺胺草醚的降解曲线图；
[0020] 图4为本发明氟磺胺草醚降解菌在不同温度条件下对氟磺胺草醚的降解曲线图；
[0021] 图5为本发明氟磺胺草醚降解菌施用后对玉米生长的影响结果图。a: lmg/L;b: 2mg/L；c：3mg/L
【具体实施方式】
[0022] 培养基：
[0023] LB培养基购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0024] 无机盐培养基:MgS〇4 · 7H20 0.1g、K2HP〇4 1.0g、（NH4)2S〇4 1.0g、KH2P〇4 l.Og、蒸 馏水补足1000 mL，混合后搅拌均匀，调节pH值至7.0，高压蒸汽灭菌（121°C，20min)后制得。 此外，额外加入2.5g LB培养基和3.6g葡萄糖作为碳源和其他营养物质。葡萄糖溶液在使用 前经0.22μπι滤膜过滤除菌。
[0025] 液体培养基中氟磺胺草醚的检测：
[0026 ]将2 OmL含氟磺胺草醚的液体培养液转入2 5 OmL分液漏斗中，分别用5 OmL二氯甲烧 萃取3次，下层有机相经过无水硫酸钠层合并于250mL平底烧瓶中，在旋转蒸发器上减压浓 缩至ImL左右，然后用氮气流吹干，用色谱甲醇定容至IOmL供液相色谱分析。
[0027] 液相色谱仪：使用Agilent 1200液相色谱仪；色谱柱：Agilent 4.6mm(id) X 150mm，Eclipse XDB-C18;流动相：乙腈:磷酸（0· I % ) = 60:40(v/v);流速：I .OmL/min;检测 波长：290nm;进样量：IOyL0
[0028] 氟磺胺草醚残留量计算公式如下：
[0029]
[0030] 其中：X为待测样品中氟磺胺草醚的浓度(mg/L);Ax为样品中氟磺胺草醚的峰面 积;Ao为氟磺胺草醚标准样品峰面积;V x为样品体积(mL) ;Vo为最后定容体积(mL) ;CS为氟磺 胺草醚标准样品的浓度(mg/L)。
[0031] 实施例1
[0032] (1)菌株分离纯化
[0033] 土壤样品采自浙江省嘉兴水稻土。称取供试土壤样品10.OOg于IOOmL血清瓶中，加 入ImL人工合成的Fe(OH)3悬液(含Fe量为15.4mg/mL)及50mL去离子水，在30°C下静置暗光 培养1周。将培养后的土壤悬液于700rpm离心10min，取上清液作为微生物接种液。将接种液 稀释IOO倍，取I OOyL在LB固体培养基平板上涂布，培养皿用封口膜密封。置30 °C培养箱中避 光培养2d。选择菌落分布均匀的平板，全部挑取单菌落，分别接入柠檬酸铁液体培养基中培 养。培养瓶采用IOmL的血清瓶，每瓶加柠檬酸铁液体培养基5mL，冲氮气5min，密封。如果在 培养过程中柠檬酸铁液体培养基由黄绿色逐渐变为白色，表明柠檬酸铁已被还原，此菌株 具有还原Fe(III)的功能。据此分离筛选具有还原作用的目的菌株。
[0034] (2)菌株鉴定
[0035] 将分离纯化的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图1所 示。该菌株主要形态及生物学特征为:革兰氏染色反应阳性，菌体杆状，无鞭毛，大小约为 (0.75μηι~0.8μηι) X (2.7μηι~3.7μηι)，菌落呈乳黄色、圆形、边缘整齐、光滑湿润、在生理盐 水中不易分散，接触酶阳性，氧化酶阳性。该菌最适生长PH值为7.0,最适生长温度为35°C。 该菌可以还原氟磺胺草醚的硝基，转变为氨基。对该菌株的16S rDNA进行测序，序列如SEQ ID No: 1所示，经16S rDNA序列分析鉴定该菌株为芽孢杆菌属的一个未知种，命名为芽孢杆 菌(Bacillus sp.)FE_l〇
[0036] 实施例2
[0037] 农药浓度对氟磺胺草醚降解的影响：
[0038]为了研究氟磺胺草醚浓度对其自身微生物降解的影响，分别向三个25mL灭菌的血 清瓶中加入20mL pH 7.0无机盐培养基(含2.5g/L LB培养基和3.6g/L葡萄糖），然后每个瓶 分别添加氟磺胺草醚浓度至〇.5、1和10mg/L，将适量的处于对数生长期的菌株FE-I接种于 液体培养基中，使菌种数量达到l〇 7cfu/ml，然后置于摇床(30°C、150rpm)中黑暗振荡培养， 相应地配置3个不含该菌的空白对照，对照组同样在上述条件下进行培养。
[0039 ]在培养时间为0、2、4、6、8、10、12和14h定时取样，根据上述方法检测氟磺胺草醚残 留量。试验组与对照组各为三个重复。本发明菌株在纯培养条件下对不同浓度氟磺胺草醚 的降解曲线如图2所示。
[0040]观察图2发现，培养Hh后，处理组中0.5和lmg/L的氟磺胺草醚残留量已低于检测 限（0.011^凡）。降解菌对101^凡的氟磺胺草醚的降解率为82.9%。不同浓度的氟磺胺草醚 (0.5、1和10mg/L)降解速率分别为0.036、0.071和0.592mg/(h · L)，对应的降解半衰期分别 为5.36h、5.66h和5.57h。氟磺胺草醚的降解速率和其浓度分别成较好的线性关系(R 2分别 为0.998、0.970和0.998)，表明它们的降解符合Quiroga-Sales二级反应动力学方程。在不 加菌的对照中，氟磺胺草醚的水解率均小于4.8%。表明该菌株对氟磺胺草醚有很强的降解 能力。
[0041 ] 实施例3
[0042] pH值对氟磺胺草醚微生物降解的影响：
[0043]为了研究不同pH值对氟磺胺草醚微生物降解的影响，分别向三个25mL灭菌的血清 瓶中加入201111^!16.0、7.0和8.0缓冲液(含2.58/11^培养基和3.68/1葡萄糖），然后每个 瓶分别添加 l〇mg/L氟磺胺草醚。将适量的处于对数生长期的菌株FE-I接种于液体培养基 中，使菌种数量达到IO7Cfu/mL，然后置于摇床(30°C、150rpm)中黑暗振荡培养，相应地配置 3个不含该菌的空白对照，对照组同样在上述条件下进行培养。
[0044] 在培养时间为0、2、4、6、8、10、12和14h定时取样检测氟磺胺草醚残留量。试验组与 对照组各为三个重复。本发明菌株在不同pH值条件下对氟磺胺草醚的降解曲线如图3所示。
[0045] 观察图3所示，在pH 6.0、7.0和8.0的条件下，氟磺胺草醚的微生物降解符合 Quiroga-Sales二级反应动力学特征。在pH 6.0、7.0和8.0的条件下，氟磺胺草醚的降解率 分别是65.7%、84.0%和74.5%，相应的半衰期分别为11.5711、6.1911和8.2911。在不加菌的 对照中，氟磺胺草醚在pH 6.0、7.0和8.0的条件下的水解率均小于2.8%。氟磺胺草醚在pH 6.0的条件下的降解半衰期分别是其在pH 7.0、pH 8.0的条件下的1.87、1.40倍。氟磺胺草 醚在不同pH条件下的降解效果为pH 7.0>pH 8.0>ρΗ 6.0。结果表明降解菌FE-I在中性条 件下对氟磺胺草醚的降解效果最好。
[0046] 实施例4
[0047] 温度对氟磺胺草醚微生物降解的影响：
[0048]为了研究不同温度对氟磺胺草醚微生物降解的影响，分别向三个25mL灭菌的血清 瓶中加入20mL pH 7.0的无机盐培养基(含2.5g/L LB培养基和3.6g/L葡萄糖），然后每个瓶 分别添加 l〇mg/L的氟磺胺草醚。将适量的处于对数生长期的菌株FE-I接种于液体培养基 中，使菌种数量达到107cfu/mL，然后分别置于15、25和35°C的摇床（150rpm)中黑暗振荡培 养，同时做不加菌剂的空白对照，对照组同样在上述条件下进行培养。
[0049] 培养时间为0、2、4、6、8、10、12和14h定时取样检测氟磺胺草醚残留量。试验组与对 照组各为三个重复。本发明菌株在不同温度条件下对氟磺胺草醚的降解曲线如图4所示。
[0050] 观察图4所示，在25和35°C的条件下，氟磺胺草醚的微生物降解均符合Quiroga-Sales二级反应动力学特征，而在15°C条件下，氟磺胺草醚的降解率与对照组无明显差异(P <0.05)。表明在15°C条件下微生物代谢缓慢，降解氟磺胺草醚的能力较弱。在25、35°C的条 件下，氟磺胺草醚的微生物的降解率分别是69.3%和93.3%，相应的半衰期分别是10.65h 和4.79h。在不加菌的对照中，氟磺胺草醚在15、25和35°C的条件下的水解率均小于4.3 %。 本发明菌株在不同温度条件下对氟磺胺草醚的降解效果为35°C>25°C>15°C。结果表明随 着培养温度的上升，氟磺胺草醚的降解速率变大。
[0051 ] 实施例5
[0052] 菌株FE-I的土壤修复试验
[0053]为了验证菌株FE-I对氟磺胺草醚污染土壤的修复能力，本实验选取后茬敏感作物 玉米进行土壤接种盆栽试验。供试土壤采自浙江大学华家池校区〇~20cm的新鲜土壤，室内 风干，去杂物后过2. Omm筛。常温下（20-25Γ)放置备用。土样经灭菌后分装于铝盒（直径 6cm，高5.5cm)。氟磺胺草醚的添加浓度为l、2、3mg/kg。将适量的处于对数生长期的菌株FE-1接种于液体培养基中，使菌种数量达到l〇 7cfu/g，充分混匀后，加无机盐培养基(含2.5g/L LB培养基和3.6g/L葡萄糖）至淹水lcm。设置不添加氟磺胺草醚且不接菌的为空白组 (blank)，设置添加氟磺胺草醚且接菌的为处理组(treatment)，设置添加氟磺胺草醚但不 接菌的为CK-I，设置不添加氟磺胺草醚但接菌的为CK-2。每组重复6次。全部置于35°C培养 箱中静置黑暗处理5天((1)。5天后移至40°C烘箱使多余水分挥发至土壤含水量约为最大持 水量的70%。将3粒玉米种子均匀地种植于铝盒中。后将铝盒放置于人工气候培养箱中，种 植14天后测定株高与鲜重。
[0054] 观察图5所示，CK-I对照组中，在l、2、3mg/kg不同浓度氟磺胺草醚处理后玉米植株 矮小枯黄，株高抑制率分别为55%、80.1 %和86.3%，且显著低于空白对照组水平（P< 0.05)。降解菌FE-I施用后，株高抑制作用显著降低，株高达到空白组水平。同时，不同氟磺 胺草醚残留浓度处理后，植株鲜重受到较大抑制，与根长受抑制的表现相似。对照组CK-I， 植株鲜重与空白对照组存在着显著和极显著的差异。（P < 0.05或P < 0.01)。降解菌FE-I施 用后，不同浓度氟磺胺草醚处理后玉米植株的鲜重已接近空白对照组水平。盆栽生测实验 表明，菌株FE-I处理氟磺胺草醚污染的土壤，可明显恢复敏感作物玉米的各项生物指标(株 高和鲜重），且对玉米无药害作用，表现出较好的修复效果。
[0055]从上述试验可得，本发明氟磺胺草醚降解菌在中性存在的条件下对氟磺胺草醚的 降解率最大，并且随着培养温度的逐步升高，其降解率逐渐变大。且该菌株具有很好的污染 土壤修复潜能。因此，本发明氟磺胺草醚降解菌对污染环境中氟磺胺草醚残留的降解具有 积极的意义。
【主权项】
1. 一种氟磺胺草醚降解菌，其特征在于，命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)FE-l，保藏号 为：CCTCC Μ 2016044。2. -种包含如权利要求1所述氟磺胺草醚降解菌的菌剂。3. 如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为水剂或粉剂。4. 如权利要求1所述的氟磺胺草醚降解菌在去除水体中残留氟磺胺草醚中的应用。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括:将所述氟磺胺草醚降解菌接种于待处 理的水体中，培养一段时间。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，水体的pH值为中性。7. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，培养的温度为35 °C。8. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，氟磺胺草醚降解菌的接种浓度为107cfu/mL。9. 如权利要求1所述的氟磺胺草醚降解菌在对氟磺胺草醚污染土壤的修复中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，待修复的土壤种植玉米。
【文档编号】C12N1/20GK105861358SQ201610214645
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月7日
【发明人】虞云龙, 崔宁
【申请人】浙江大学