一种产角蛋白酶的铜绿假单胞菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种产角蛋白酶的铜绿假单胞菌及其应用，所述铜绿假单胞菌于2016年03月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.12185；所述产角蛋白酶的铜绿假单胞菌降解含角蛋白的物质，包括以下步骤：1)准备液体无机盐培养基；2)取铜绿假单胞菌菌种和含角蛋白的物质，添加至步骤1)中制得的液体无机盐培养基中，所述铜绿假单胞菌菌种的菌龄为t，4h≤t≤24h，所述铜绿假单胞菌菌种在液体无机盐培养基中的接种量为a，0.5％≤a≤5％，在转速为150～220rpm，温度为27～47℃的条件下发酵，使含角蛋白的物质降解；该铜绿假单胞菌在以羽毛为唯一碳氮源的液体培养基中可以高效降解角蛋白。CGMCCNo.1218520160307
【专利说明】
一种产角蛋白酶的铜绿假单胞菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物菌株及应用领域，具体涉及一种产角蛋白酶的铜绿假单胞菌及 其应用。
【背景技术】
[0002] 羽毛是重要的蛋白质资源，其蛋白含量高达85-90%。但由于其主要成分角蛋白是 一种具有极强抗性、难生物降解的硬蛋白，难以直接利用，而传统的物理和化学加工方法： 高温高压、酸碱处理等不仅消耗大量能源还引发严重的环境污染问题。目前我国养殖业中 每年产生的羽毛废弃物达到百万余吨，随着我国养殖业的不断发展，这数量还在持续增长， 实现废弃资源的高值转化和循环利用已是必然选择。研究角蛋白资源的转化及应用，对含 有羽毛、毛发等角蛋白成分的养殖业废弃物的无害转化以及对和角蛋白有相似结构的物质 的转化均具有重要理论价值和创新意义。其中，角蛋白酶(keratinase)是一种主要由真菌、 放线菌、细菌等微生物产生，可特异降解角蛋白的蛋白酶。利用自然界中微生物分泌的角蛋 白酶特异性地消化羽毛等角蛋白，将角蛋白直接转变成蛋白质或复合氨基酸，以作为一种 饲科蛋白质应用于畜禽的饲养，从而变废为宝，既能保护环境又利用资源，这也将具有十分 显著的经济效益和深远的社会效益。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种产角蛋白酶的铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa，该铜绿假单胞菌在以羽毛为唯一碳氮源的液体培养基中可以 高效降解角蛋白。
[0004] 实现上述目的，本发明采用如下技术方案:所述铜绿假单胞菌，分类命名为铜绿假 单胞菌Pseudomonas aeruginosa，于2016年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(简称中国普通微生物菌种保藏管理中心），保藏单位的地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 12185,所述铜绿假单胞菌的菌体细胞为短 杆状，有鞭毛，无芽孢，无荚膜，革兰氏染色为阴性;菌体在牛奶平板培养基上培养24h后，菌 落形状不规则，表面粗糙，边缘模糊，产生透明降解圈，产生绿色荧光色素。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供产角蛋白酶的铜绿假单胞菌的应用，将该菌接种于 改进的液体无机盐培养基中发酵并产生角蛋白酶，提高了菌株降解含角蛋白的物质的效 率。
[0006] 实现上述目的，本发明采用如下技术方案:利用所述产角蛋白酶的铜绿假单胞菌 降解含角蛋白的物质。
[0007] 作为本发明的一种优选的方案:所述产角蛋白酶的铜绿假单胞菌降解含角蛋白的 物质，包括以下步骤：
[0008] 1)准备液体无机盐培养基；
[0009] 2)取铜绿假单胞菌菌种和含角蛋白的物质，添加至步骤1)中制得的液体无机盐培 养基中，所述铜绿假单胞菌菌种的菌龄为t，4h<t<24h，所述铜绿假单胞菌菌种在液体无 机盐培养基中的接种量为a，0.5%彡a彡5%，在转速为150~220rpm，温度为27~47°C的条 件下发酵12~120h，使含角蛋白的物质降解；
[0010] 当铜绿假单胞菌菌种的菌龄在4~24h，可以保证菌株具有较强的活性，有利于产 生角蛋白酶。
[0011] 作为本发明的一种优选的方案：步骤1)中，所述液体无机盐培养基按浓度计包括 以下组分： K2HPO4 lg/L, Mg2SCV 7H20 〇.5g/L;
[0012] Had ().5g/L; FeSO4 ·7Η20 0.01g/L; 羽毛 丨Og/L;
[0013] 其中，所述液体无机盐培养基的pH为4~11。
[0014] 作为本发明的一种优选的方案:所述液体无机盐培养基的pH= 11。
[0015] 作为本发明的一种优选的方案:所述铜绿假单胞菌菌种的菌龄为t，t = 12h;当菌 种的菌龄为12h时，铜绿假单胞菌菌株的活性好，接种于液体无机盐培养基中使得角蛋白的 降解率最高，其次是菌龄为16h时。
[0016] 作为本发明的一种优选的方案:所述铜绿假单胞菌菌种在液体无机盐培养基中的 接种量为a，a = 2%。
[0017] 作为本发明的一种优选的方案:步骤2)中，所述发酵的温度为37°C。
[0018] 本发明的有益效果在于：
[0019] 1、本发明利用铜绿假单胞菌降解多种含角蛋白的废弃物，提供了更灵活更环保的 生物降解角蛋白废弃物的方式；
[0020] 2、本发明的铜绿假单胞菌在液体无机盐培养基中发酵后，对角蛋白的降解率高， 可直接应用于降解整根羽毛，无需对羽毛进行预处理；
[0021] 3、本发明的铜绿假单胞菌对于含角蛋白的物质的降解条件简单，可以以羽毛为唯 一碳、氮源进行发酵，无需添加葡萄糖和酵母粉等有机营养物质，所产角蛋白酶活性高，稳 定性好。
【附图说明】：
[0022]本发明涉及的铜绿假单胞菌，分类命名为铜绿假单胞菌Pseudo monas aeruginosa，于2016年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称中国普通微生物菌种保藏管理中心），保藏编号为CGMCC No. 12185; 图1为实施例1菌株的电镜图；
[0023]图2为实施例1菌株16S rDNA序列系统发育树；
[0024]图3为实施例2不同pH对羽毛的降解率的曲线图；
[0025] 图4为实施例2不同温度对羽毛的降解率的曲线图；
[0026] 图5为实施例3不同菌龄对羽毛的降解率的曲线图；
[0027] 图6为实施例4不同接种量对羽毛的降解率的曲线图；
[0028] 图7为实施例5不同发酵时间对羽毛的降解率及发酵上清液角蛋白酶活性的曲线 图；
[0029] 图8为实施例6中对照组(CK)的羽毛降解状态图；
[0030] 图9为经实施例6处理的羽毛降解状态图；
【具体实施方式】
[0031] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0032] 所述产角蛋白酶的铜绿假单胞菌降解含角蛋白的物质，包括以下步骤：
[0033] 1)准备液体无机盐培养基；
[0034] 所述液体无机盐培养基按浓度计包括以下组分： K2HPO4 lg/L; Mg2SO4WH2O 0.5g/L;
[0035] NaCl 0.5g/L; FeSO4* TH2O 0.01g/L; 羽毛 lOg/L;
[0036] 其中，所述液体无机盐培养基的pH为4~11。
[0037] 2)取铜绿假单胞菌菌种和含角蛋白的物质，添加至步骤1)中制得的液体无机盐培 养基中，所述铜绿假单胞菌菌种的菌龄为t，4h<t<24h，所述铜绿假单胞菌菌种在液体无 机盐培养基中的接种量为a，0.5%彡a彡5%，在转速为150~220rpm，温度为27~47°C的条 件下发酵12~120h，使含角蛋白的物质降解；
[0038] 3)在步骤2)进行24h后取液体无机盐培养基的发酵上清液，对发酵上清液进行角 蛋白酶酶活测定，以每mL发酵上清液在规定条件下反应15min后OD值增加0.01为1个酶活单 位，测定包括以下步骤：
[0039] I)配制W/V为1/160的偶氮蛋白的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液pH=7.4;
[0040] Π )取3.2mL偶氮蛋白的磷酸缓冲液，置于37°C水浴中预热2min;
[0041] ΙΠ )取发酵上清液0.8mL，加入步骤Π )中的偶氮蛋白的磷酸缓冲液中，然后37°C水 浴中反应15min，获得混合液；
[0042] IV)在步骤ΙΠ )得到的混合液中加入0.8mL 10 %的三氯乙酸，终止酶反应，获得反 应液；
[0043] V )将步骤IV)中获得的反应液于转速为1000 Orpm的条件下离心6min，并在450nm 下测定吸光值；
[0044] VI)制备空白对照:在通过步骤Π )获得的磷酸缓冲液中，先加入0.8mL10%的三氯 乙酸，再加入发酵上清液〇. SmL，得到空白对照。
[0045] 实施例1
[0046] 实施例1用于说明菌种的筛选及鉴定过程：
[0047] 一、产角蛋白酶的菌种筛选方法：
[0048] 1) 土壤样品采自广东温氏食品集团股份有限公司某鸡场；
[0049] 2)将采集的样品置于无菌蒸馏水中混匀，静置后取上清液，按10-6、10- 7、10-8进行 梯度稀释后，分别涂布于含牛奶的琼脂平板培养基上；然后置于37°C恒温箱中倒置培养 24h；
[0050] 3)在琼脂平板培养基上挑选能产生透明降解圈的单个菌落，接种于含羽毛的液体 无机盐培养基中，在温度37°C，180rpm的条件下震荡培养72h，获得菌株培养液;最后挑选羽 毛降解明显的菌株培养液，接种至新的含羽毛的液体无机盐培养基上进行复筛培养；
[0051] 4)将复筛得到的菌株接种于含有一根完整羽毛和50mL无机盐发酵培养液的锥形 瓶中，在温度37°C，转速200rpm的条件下震荡培养48h，观察羽毛的降解情况，筛选出羽毛降 解能力较强的菌株，保种备用；
[0052]其中牛奶琼脂平板培养基包括以下组分:氯化钠 10g，琼脂粉20g，脱脂奶粉5g，双 蒸水1L。
[0053]二、产角蛋白酶的菌株形态及生理生化鉴定：
[0054] 1)将菌种分离纯化，然后划线接种琼脂平板培养基，温度为37°C的条件下培养 24h;通过光学显微镜和透射电子显微镜观察菌体的形态，电镜下的菌体形态如图1所不:短 杆状，有鞭毛，无芽孢，无荚膜，革兰氏染色为阴性；
[0055] 2)将菌株进行生理生化测定，其生理生化特征见表1:
[0056] 表1菌株的生理生化特征
[0059] 注:+ :阳性;阴性
[0060] 目的菌株能够水解牛奶、明胶，具有角蛋白酶活性;能利用柠檬酸盐;硝酸还原测 定为阴性。
[0061 ] 三、菌株16S rDNA鉴定：
[0062] 设计引物PCR扩增菌株16S rDNA序列，并送上海生工生物工程股份有限公司测序； [0063] PCR反应的扩增引物：
[0065] 反应体系： LUUO/」
[0068] 反应条件：
[0070] 获得的菌株的16S rDNA序列如下所示：
[0071] TGCAAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTG GTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACC TCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTG GTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG GACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGG GAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCA GCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTG GATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAAT TTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGAC ACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCC GTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAA ACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC TGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACG AGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCG GGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACG GCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACC GATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCAC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTA ACCGCAA；
[0072] 该序列记录在序列表SEQ No. 1中。
[0073]四、构建系统发育树：
[0074] 经GenBank核酸数据库与已知菌群的16S rDNA基因序列比对分析，调出与其序列 同源性较高的相关菌株的16S rDNA序列，计算目的菌株的核苷酸序列及其同源序列的遗传 距离，用邻接法(Neighbo r-joining)推演系统发生关系，构建系统发育树如图2所示；
[0075] 五、通过菌体的形态特征观察、菌株生理生化测定、16S rDNA扩增序列和构建系统 发育树，鉴定菌株为铜绿假单胞菌。
[0076] 实施例2
[0077] 实施例2用于说明产角蛋白酶的铜绿假单胞菌对角蛋白的降解条件：
[0078] 1)按梯度配制pH为4~11的液体无机盐培养基各50mL;
[0079] 2)在步骤1)中制得的每一个液体无机盐培养基中添加铜绿假单胞菌菌种0.5mL和 羽毛〇.5g，在转速为220rpm，温度为37°C的条件下发酵24h后，通过失重法检测羽毛的降解 率；
[0080] 3)不同pH对羽毛的降解率如图3所示：结果显示，当液体无机盐培养基的PH=Il 时，羽毛的降解率最尚；
[0081] 4)取铜绿假单胞菌菌种，添加至PH=Il的液体无机盐培养基中，在转速为220rpm， 分别在27 °C、32 °C、37 °C、42 °C和47 °C的温度条件下发酵24h，然后通过失重法检测羽毛的降 解率；
[0082] 5)不同温度对羽毛的降解率如图4所示：结果显示，温度为37°C时，羽毛的降解率 最尚。
[0083] 实施例3
[0084] 实施例3用于说明铜绿假单胞菌菌龄对角蛋白降解率的影响：
[0085]分别将菌龄为处、811、1211、1611、2011和2411的铜绿假单胞菌菌种接入液体无机盐培 养基，菌种的接种量为1%，在羽毛浓度为10g/L，pH=ll，温度为37°C的条件下发酵24h;羽 毛的降解率如图5所示：当菌龄为12h时，羽毛的降解率最高，其次是菌龄为16h时；12h之前， 随着菌龄的增加，铜绿假单胞菌菌株的活性逐渐提高，羽毛的降解率亦随之升高；16h之后， 羽毛的降解率随着菌龄的增加而迅速下降。
[0086] 实施例4
[0087] 实施例4用于说明液体无机盐培养基的接种量对角蛋白降解率的影响：
[0088]配制接种量分别为0.5%、1%、2%、5%的液体无机盐培养基，在羽毛浓度为IOg/ UpH=Il，温度为37°C的条件下发酵24h;羽毛的降解率如图6所示：当接种量为2%时，羽毛 的降解率最高；当接种量< 2 %时，羽毛的降解率随接种量的增加而增加；当接种量> 2 % 时，羽毛的降解率反而降低；即使在不同接种量的条件下发酵24h，羽毛的降解率均能达到 50%以上。
[0089] 实施例5
[0090] 实施例5用于说明发酵时间对角蛋白降解率和发酵上清液中角蛋白酶活性的影 响：
[0091] 配制接种量为2%、羽毛浓度为10g/L的液体无机盐培养基，在?!1=11，温度为371€ 的条件下发酵，测定发酵时间为12h、24h、48h、72h、96h、120h时羽毛的降解率及发酵上清液 中角蛋白酶的活性，结果如图7所示：在48h之前，羽毛的降解率随着时间的增加而迅速增 加;48h时羽毛的降解率达到85.7 % ; 48h之后，羽毛的降解率趋于平缓；120h时，羽毛的降解 率达到93.5 % ;而发酵上清液中角蛋白酶的活性，在24h内迅速升高，24~48h内缓慢升高， 48h时酶活达到60.3U/mL，48h后开始下降。由此可见，该菌产酶和降解羽毛的最佳时间为 48h〇
[0092] 实施例6
[0093] 实施例6用于说明利用产角蛋白酶的铜绿假单胞菌降解含角蛋白的物质的过程：
[0094] 所述产角蛋白酶的铜绿假单胞菌降解含角蛋白的物质，包括以下步骤：
[0095] 1)准备液体无机盐培养基；
[0096] 所述液体无机盐培养基按浓度计包括以下组分：
[0097] K2HPO4 lg/L; Mg2SO4eTH2O 0.5g/L; NaCl 0.5g/L,;
[0098] FeSO4 *7H?0 O.Olg/L; 羽毛 10g/L·
[0099]其中，所述液体无机盐培养基的pH= 11;
[0100] 2)取铜绿假单胞菌菌种0.5mL和羽毛0.5g，添加至步骤1)中制得的液体无机盐培 养基50mL中，在转速为220rpm，温度为37°C的条件下发酵48h，使羽毛降解；
[0101] 3)对照组(CK)为将羽毛0.5g置于液体无机盐培养基中，不添加菌种震荡48h:
[0102] 4)通过观察羽毛的降解情况，对照组（CK)的羽毛降解状态如图8所示：羽毛仍完 好，液体仍为无色透明澄清;经过实施例6处理的羽毛降解状态如图9所示:完整羽毛已经完 全脱落降解，降解液体为灰黑色浑浊液；
[0103] 5)通过步骤2)发酵48h后取液体无机盐培养基的发酵上清液，对发酵上清液进行 角蛋白酶酶活测定，得到角蛋白酶活力为60.3U/mL。
[0104] 对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各 种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范 围之内。
【主权项】
1. 一种产角蛋白酶的铜绿假单胞菌，其特征在于：所述铜绿假单胞菌于2016年03月07 日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 12185。2. 如权利要求1所述的产角蛋白酶的铜绿假单胞菌的应用，其特征在于:利用所述产角 蛋白酶的铜绿假单胞菌降解含角蛋白的物质。3. 如权利要求2所述的产角蛋白酶的铜绿假单胞菌的应用，其特征在于:所述产角蛋白 酶的铜绿假单胞菌降解含角蛋白的物质，包括以下步骤： 1) 准备液体无机盐培养基； 2) 取铜绿假单胞菌菌种和含角蛋白的物质，添加至步骤1)中制得的液体无机盐培养基 中，所述铜绿假单胞菌菌种的菌龄为t，4h<t<24h，所述铜绿假单胞菌菌种在液体无机盐 培养基中的接种量为a，0.5%彡a彡5%，在转速为150~220rpm，温度为27~47°C的条件下 发酵12~120h，使含角蛋白的物质降解。4. 如权利要求3所述的产角蛋白酶的铜绿假单胞菌的应用，其特征在于：步骤1)中，所 述液体无机盐培养基按浓度计包括以下组分： K2HP〇4 lg/L; Mg2S04*7H20 0.5g/L; NaCl 0.5g/L; FeS04*7H20 O.Olg/L; 羽毛 lOg/L; 其中，所述液体无机盐培养基的pH为4~11。5. 如权利要求4所述的产角蛋白酶的铜绿假单胞菌的应用，其特征在于:所述液体无机 盐培养基的pH=ll。6. 如权利要求3所述的产角蛋白酶的铜绿假单胞菌的应用，其特征在于:所述铜绿假单 胞菌菌种的菌龄为t，t = 12h。7. 如权利要求3所述的产角蛋白酶的铜绿假单胞菌的应用，其特征在于:所述铜绿假单 胞菌菌种在液体无机盐培养基中的接种量为a，a = 2 %。8. 如权利要求3所述的产角蛋白酶的铜绿假单胞菌的应用，其特征在于：步骤2)中，所 述发酵的温度为37°C。
【文档编号】C12R1/385GK105861373SQ201610272854
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】黄妙容, 钟楚红, 任广彩, 刘传高, 陈瑞爱, 叶俊贤
【申请人】广东温氏大华农生物科技有限公司, 肇庆大华农生物药品有限公司