一种苯胺降解菌及其用图
【专利摘要】本发明属于生物降解技术领域，本发明提供了一种具有苯胺降解能力的Pigmentiphaga daeguensis。该菌为革兰氏阴性菌，菌落白色，圆形，光滑不透明，稍突起，边缘整齐。该菌于2016年3月10日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为：GDMCC No:60017。该菌应用于低浓度苯胺废水的深度处理，能在低浓度的苯胺废水中生长良好，降解苯胺速度快，无二次污染，使用安全，不会影响原有处理系统的微生物系统。GDMCC No：6001720160310
【专利说明】
一种苯胺降解菌及其用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物降解技术领域，具体涉及一种苯胺降解菌及其用途，尤其是涉及 一种低浓度苯胺的降解菌及其用途。
【背景技术】
[0002] 芳香族有机化合物对地表水和地下水的污染已成为人类面临的最严重的环境问 题之一。苯胺作为最简单的一级芳香胺，是一种用量较大的化工原料，被广泛应用于印染、 国防、农药、橡胶等行业。同时，苯胺也是一些含苯胺类化合物生物降解后的中间产物，它的 毒性极强，是一种较为常见的水体污染物。随着工业的发展，生产或使用苯胺的企业所释放 的含苯胺工业废气会污染大气。苯胺可以通过工业企业和居民点的废水进入环境。对人而 言，苯胺是典型的高铁血红蛋白的形成体，使细胞失去携氧功能，具溶血作用，它主要通过 吸入或食入等方式进入人体，然后与血红蛋白结合，降低甚至剥夺了其与氧的结合机率，最 终导致中毒现象的发生;而且它能够损伤肝功能，引起肝炎，甚至引发一些癌症。故苯胺类 污染物已被美国、日本等国列入主要监测项目或优先监测的污染物黑名单。1989年苯胺类 化合物已被中国列为"环境优先控制污染物"物质之一。
[0003] 目前处理苯胺废水的方法主要有物理法、化学法和生物法。
[0004] 物理法包括吸附法和萃取法，主要适用于高浓度苯胺废水，可实现苯胺的回收利 用。吸附法是采用吸附材料处理苯胺废水的方法，在工程运用中操作简易，运营简单，但吸 附剂购置成本高，再生困难，且吸附法常会造成二次污染。萃取法是采用能溶解污染物但不 溶于水的萃取剂，在其与废水充分混合接触后，利用污染物在水中和溶剂中不同的分配比 实现污染物分离和提取的一种废水净化方法。萃取法对处理设备要求简单，工艺简易，但同 样需要再生处理，且有机溶剂可能造成二次污染。萃取只是一个污染物的物理转移过程，而 非真正意义上的降解。
[0005] 化学法包括光催化氧化法、超临界水氧化法和超声波降解法等。光催化氧化技术 需要光、催化剂和空气，具有能耗低、操作简便、反应条件温和、反应范围广、可减少二次污 染等突出优点。而光催化氧化法在处理高浓度工业废水中存在纳米材料容易聚集的问题， 且处理费用高。超临界水氧化技术(SCWO)以超临界水为反应介质，空气、氧气或过氧化氢等 为氧化剂，通过高温高压下的自由基反应，将苯胺等有机物氧化分解为二氧化碳、水、氮气 以及无机盐等无毒的小分子化合物，具有反应速率快和二次污染小的优点。但其不足之处 是反应需在高温高压下进行，设备要求高，造价高。超声波降解法是利用声空化能量加速和 控制化学反应提高反应速率的一种新技术，具有降解效率高、反应时间短、设施简单、占地 面积小等优点，但耗能巨大，噪音大，经济性不够理想。
[0006] 利用微生物法降解废水中苯胺类化合物是一种经济有效且无二次污染的方法，尤 其适合于含有低浓度苯胺类化合物的废水深度处理。目前，国内外的学者对苯胺类化合物 降解菌开展了大量的研究工作，已筛选到多株高效的降解菌，但都是针对菌株耐受性和对 高浓度苯胺降解性的研究开发，仍不能满足对低浓度苯胺废水深度处理和零排放的需求。 因此，通过筛选能够快速完全降解低浓度苯胺的菌株，丰富微生物菌种资源，阐明微生物快 速完全降解苯胺的特性等研究显得尤为重要。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种苯胺降解菌及其用途。
[0008] 一种苯胺降解菌，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No: 60017。
[0009] 本发明所述苯胺降解菌是筛选自中山某印染废水处理厂的印染污泥，经苯胺驯 化、分离及纯化得到的一株菌。具体方法为:将印染污泥进行洗泥除去杂质，取20g污泥放在 200mL以苯胺(50mg/L)为唯一碳氮源的无机盐液体培养基中培养7天后，以10%的接种量转 接到苯胺浓度为l〇〇mg/L的无机盐液体培养基中进行驯化培养7天，之后再以10%的接种量 继续转接到苯胺浓度为150mg/L的无机盐液体培养基中驯化培养7天。取适量培养液经十倍 系列稀释，并在以苯胺为唯一碳氮源的固体培养基（l〇〇mg/L)表面进行涂布培养，培养7天 后，挑取单菌落进行划线纯化，直至培养基上为单一菌落即为纯菌，分别测定各菌的降解效 果，选取其中的优势菌株，得到苯胺的降解菌AN-4a。
[0010] 本发明所述苯胺的降解菌AN_4a为革兰氏阴性好氧菌，杆状，菌落白色，圆形，光滑 不透明，稍突起，边缘整齐。氧化酶阳性，接触酶阳性，赖氨酸脱羧酶阴性，鸟氨酸脱羧酶阴 性，精氨酸双水解酶阴性。生长温度15~45°C、生长pH为5~10。经过16S rDNA测序及同源性 比较，得到与本发明所述苯胺的降解菌AN_4a最相近的是Pigmentiphaga daeguensis sp.， 同源性为99 %。结合生理生化鉴定结果，确定本发明所述苯胺的降解菌AN-4a属于 Pigmentiphaga daeguensis〇
[0011]本发明所述苯胺的降解菌AN-4a已于2016年3月10日在广东省微生物菌种保藏中 心(GDMCC)进行了保藏，保藏中心地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省 微生物研究所，保藏号为GDMCC N〇:60017。
[0012] 本发明还提供了所述苯胺的降解菌AN_4a在处理苯胺类废水中的用途。尤其是低 浓度苯胺类废水的生物强化处理。
[0013] 本发明还提供了一种苯胺类废水的处理方法，将本发明所述苯胺的降解菌4a悬浮 于含苯胺的污水中培养。
[0014] 其中，所述处理方法中所述废水中苯胺的浓度为10mg/L。
[0015] 在一些实施方案中，本发明所述处理方法中所述苯胺的降解菌的接种量为20%以 上，优选为20 %。
[0016] 在一些实施方案中，本发明所述处理方法中所述培养pH值为7~9。优选为，pH值为 7〇
[0017] 本发明所述处理方法中所述培养温度为30~40°C。优选为30°C
[0018] 本发明所述处理方法中所述培养时间为12小时以上。优选为12小时。
[0019]由上述技术方案可知，本发明提供了一种具有苯胺降解能力的菌Pigmentiphaga daeguensis。该菌为革兰氏阴性菌，菌落白色，圆形，光滑不透明，稍突起，边缘整齐。该菌于 2016年3月10日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为:GDMCC No :60017。该菌应用 于低浓度苯胺废水处理，能在低浓度的苯胺废水中生长良好，降解苯胺速度快，无二次污 染，使用安全，不会影响原有处理系统的微生物系统。
【附图说明】
[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0021] 图1示苯胺降解菌AN-4a的PCR产物琼脂糖电泳图，图中标注1和2为苯胺降解菌4a 的16S rDNA条带；
[0022] 图2示苯胺降解菌AN_4a在苯胺初始浓度不同条件下对苯胺的降解效果图；
[0023]图3示苯胺降解菌AN_4a在接种量不同条件下对苯胺的降解效果图；
[0024] 图4示苯胺降解菌AN_4a在培养液pH值不同条件下对苯胺的降解效果图；
[0025] 图5示苯胺降解菌AN_4a在培养温度不同条件下对苯胺的降解效果图；
[0026] 图6示苯胺降解菌AN_4a在不同的反应时间下苯胺的降解效果图。
[0027]生物保藏说明
[0028] 分类命名：Pigmentiphaga daeguensis于2016年3月10日保藏在广东省微生物菌 种保藏中心，地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏 编号为GDMCC No :60017。
【具体实施方式】
[0029] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0030] 为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例，对本发明做详细阐述。如无特殊说 明，本发明所采用的方法均为本领域常规的方法。
[0031] 实施例1、菌种的分离、纯化
[0032]将印染污泥进行洗泥，取20g污泥放在200mL以苯胺(50mg/L)为唯一碳氮源的无机 盐液体培养基中培养7天后，以10%的接种量转接到苯胺浓度为100mg/L的无机盐液体培养 基中进行驯化，再培养7天后，以10%的接种量转接到苯胺浓度为150m g//L的无机盐液体培 养基中进行驯化。取培养液在以苯胺为唯一碳氮源的固体培养基中稀释涂布，培养7天后， 挑取单菌落划线纯化，直到平板上为单一菌落即为纯菌，分别测定各菌的降解效果，选取其 中的优势菌株AN-4a。
[0033] 其中，无机盐液体培养基的配方（IL)为:NaCl 0.2g，K2HP〇4〇.2g，KH2P〇4〇.2g，微量 元素溶液2mL。
[0034] 微量元素溶液的配方（IL) :FeS〇4 300mg，CuS〇4 · 5H20 38mg，ZnS〇4 · 7H20 115mg， MnS〇4 169mg，H3B03 116mg，CoCl · 6H2O 24mg，NaMo · 2H20 17mg。
[0035] 固体培养基配方（IL)为无机盐液体培养基中加20g琼脂。
[0036] 实施例2、菌株的生理生化试验鉴定
[0037]对筛选的菌株AN_4a进行初步的生理生化鉴定，包括菌落形态检测、革兰氏测定、 厌氧生长试验、氧化酶实验、接触酶反应、赖氨酸脱羧酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验、精氨酸双 水解酶实验等，所述试验方法采用本领域的测定这类生理生化指标的常规试验方法。
[0038]结果显示菌株AN_4a为革兰氏阴性好氧菌，杆状，菌落白色，圆形，光滑不透明，稍 突起，边缘整齐。氧化酶阳性，接触酶阳性，赖氨酸脱羧酶阴性，鸟氨酸脱羧酶阴性，精氨酸 双水解酶阴性。生长温度15~45 °C、生长pH为5~10。
[0039] 实施例3、菌株的16S rDNA鉴定
[0040] 通过16S rRNA序列分析和Biolog微生物鉴定系统鉴定，确定菌株AN_4a属于 Pigmentiphaga daeguensis sp·。具体步骤如下：
[00411 采用常规酚法提取菌株AN-4a的DNA，用通用引物扩增16S rDNA序列。
[0042] PCR反应体系（50yL)为：10X PCR缓冲液5yL、dNTP 4yL、引物各lyL、DNA模板2.5yL、 TakaraTaq酶0.25yL、超纯水36μΙ^Ρ0Κ扩增程序为94°C3min; 94°C Imin，52°C Imin，72°C 1.51^11，30个循环;72°(：1〇1^11。琼脂糖电泳检测扩增产物，结果见图1。扩增产物送上海生工 生物科技有限公司进行测序。测序结果如SEQ ID NO: I所示。
[0043] 将测得的16S rDNA序列输入GenBank，应用BLAST软件进行同源性搜索。选取不同 菌株的16S rDNA序列并与GenBank中已知的16S rDNA进行同源性比较。将该PCR扩增产物在 GenBank中进行blast比对结果表明，与其最相近的是Pigmentiphaga daeguensis sp.，同 源性为99 %。
[0044]由此结合实施例2所示的菌株生理生化指标可推断AN_4a属于Pigmentiphaga daeguensis sp.〇
[0045]实施例4、苯胺降解菌AN_4a在苯胺初始浓度不同条件下对苯胺的降解效果实验 [0046]取保存的苯胺降解菌AN-4a斜面菌种接种到LB液体培养基中，于30°C，160r/min条 件下摇床活化菌种，使菌液的0D600值达到0.5，以IOOyL活化菌液接种到苯胺浓度为IOmg/ L、50mg/L和100mg/L的无机盐液体培养基中，分别在0小时、12小时、24小时、36小时和48小 时后用N-(l-萘基)乙二胺偶氮光度法测定苯胺的浓度，结果见图2。
[0047]由图2可以看出，在苯胺浓度为10mg/L的条件下，在12小时后降解菌AN_4a对苯胺 的降解率达到95%以上，而在50mg/L和100mg/L条件下，在12小时后降解菌AN-4a对苯胺的 降解率分别只达到17%和44%。表明降解菌AN-4a适宜低浓度苯胺的高效降解。
[0048]实施例5、苯胺降解菌AN_4a在接种量不同条件下对苯胺的降解效果实验，
[0049]取保存的苯胺降解菌AN-4a斜面菌种接种到LB液体培养基中，于30°C，160r/min条 件下摇床活化菌种，使菌液的0D600值达到0.5，以0. lmL、0.5mL、lmL、2mL、4mL、8mL活化菌液 离心后，接种到20mL苯胺浓度为10mg/L的无机盐溶液中，分别在0小时和24小时后用N-(l-萘基)乙二胺偶氮光度法测定苯胺的浓度，结果见图3。
[0050]由图3可以看出，随着接种量的增加，降解菌AN_4a对苯胺的降解率逐步提高。当接 种量达到4mL以上时，苯胺的降解率达到100%。考虑实际应用，优选降解菌AN-4a的最佳接 种量为20 %。
[0051]实施例6、苯胺降解菌AN_4a在培养液pH值不同条件下对苯胺的降解效果实验 [0052]取保存的苯胺降解菌AN-4a斜面菌种接种到LB液体培养基中，于30°C，160r/min条 件下摇床活化菌种，使菌液的0D600值达到0.5，以4mL活化菌液离心后，接种到20mL pH值分 别为5、6、7、8、9、10，苯胺浓度为1〇11^/1的无机盐溶液中，分别在0小时和24小时后用1(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定苯胺的浓度，结果见图4。
[0053]由图4可以看出，pH值为5时，苯胺的去除率最低，只有22.5 %，随着pH值增加到7 时，苯胺的去除率达到1 〇〇 %，当pH值为10时，去除率下降到74.8 %。表明，降解菌AN-4a最适 生长、降解pH值处于7~9之间，考虑实际情况，降解菌培养pH值选择为7较为合理。
[0054]实施例7、苯胺降解菌AN_4a在温度不同条件下对苯胺的降解效果实验 [0055]取保存的苯胺降解菌AN-4a斜面菌种接种到LB液体培养基中，于30°C，160r/min条 件下摇床活化菌种，使菌液的0D600值达到0.5，以4mL活化菌液离心取上清液后，接种到 20mL苯胺浓度为IOmg/L的无机盐溶液中，分别置于15 °C、20 °C、25 °C、30 °C、35 °C、40 °C摇床 中培养，在〇小时和24小时后用N-(l-萘基)乙二胺偶氮光度法测定苯胺的浓度，结果见图5。 [0056]由图5可以看出，15°C时24小时后苯胺去除率最低，只达到3.3%;20°(：和25°(：时去 除率稍高，分别达到6.7 %和24.3% ; 30~40°C时，去除率达到100 %。表明降解温度处于30 ~40°C之间降解菌4a最适生长。考虑应用的实际情况，降解菌AN-4a的培养温度选定为30 cC。
[0057]实施例8、苯胺降解菌AN_4a不同的反应时间后的苯胺降解效果 [0058]取保存的苯胺降解菌AN-4a斜面菌种接种到LB液体培养基中，于30°C，160r/min条 件下摇床活化菌种，使菌液的0D600值达到0.5，以4mL活化菌液离心后，接种到20mL pH值为 7、苯胺浓度为I Omg/L的无机盐溶液中，置于30 °C摇床中培养，在0小时、6小时、12小时、15小 时、18小时、21小时、24小时后测定0D600值和用N-(l-萘基）乙二胺偶氮光度法测定苯胺的 浓度。结果见图6。
[0059]由图6可以看出，降解菌AN-4a在接种量为4mL、培养液pH值为7,培养温度为30 °C的 条件下，12小时后对苯胺的降解率达到100%，实现完全降解。菌浓度随时间增大，表明降解 菌AN-4a利用苯胺作为唯一碳氮源，提供生长所需的能量。在苯胺完全降解后，菌浓度仍然 继续增大，表明降解菌AN-4a能利用苯胺的降解产物，作为营养物质，为菌的生长提供能量。
【主权项】
1. 一种苯胺降解菌，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC N〇:60017。2. 权利要求1所述苯胺降解菌在处理低浓度苯胺废水中的用途。3. -种低浓度苯胺废水的处理方法，将权利要求1所述苯胺降解菌悬浮于含低浓度苯 胺的废水中培养。4. 根据权利要求3所述的处理方法，所述废水中苯胺的浓度为10mg/L。5. 根据权利要求3所述的处理方法，所述苯胺降解菌的接种量为20 %。6. 根据权利要求3所述的处理方法，所述培养pH值为7~9。7. 根据权利要求3所述的处理方法，所述培养温度为30~40°C。8. 根据权利要求3所述的处理方法，所述培养时间为12小时以上。
【文档编号】C12N1/20GK105861375SQ201610278249
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】许燕滨, 黄加兴, 梁卓颖, 孔秋丹, 张小花
【申请人】广东工业大学