一株磺胺二甲嘧啶降解菌s-07及其筛选方法
【专利摘要】本发明涉及微生物降解处理的一株磺胺二甲嘧啶降解菌S?07及其筛选方法。所述的降解菌S?07经鉴定为地杆菌(Geobacillus)，该菌16S rDNA的Genbank登录号为KU588289。于2016年04月21日保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，其保藏号CGMCC No. 12382。本发明的磺胺二甲嘧啶降解菌S?07在温度为50?75℃范围内生长良好，对磺胺二甲嘧啶有很强的耐受力，并且能高效降解液相和固相中的磺胺二甲嘧啶。该菌能够应用于畜禽粪便或污泥高温堆肥中的磺胺二甲嘧啶残留物的降解去除，去除率大于95 %，具有良好的工业应用前景和环境效益。CGMCC No.1238220160421
【专利说明】
一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07及其筛选方法
技术领域
[0001]本发明涉及环境保护与有机污染物微生物降解技术领域，尤其是涉及一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07及其筛选方法。
【背景技术】
[0002]磺胺类抗生素是畜禽养殖业中常用的六大类抗生素之一，广泛用于畜禽动物疾病的治疗和添加于饲料中促进动物的生长。磺胺类抗生素的抗菌机理是:它们在结构上类似对氨基苯甲酸(PABA)，可与PABA竞争性作用于细菌体内的二氢叶酸合成酶，从而阻止PABA作为原料合成细菌所需要叶酸的过程，减少了具有代谢活性的四氢叶酸的量，而后者则是细菌合成DNA的必需物质，因此抑制了细菌的生长繁殖。磺胺二甲嘧啶是常用的磺胺类药物之一，其经过动物肠道不能被完全吸收而以原形或代谢产物的形式通过粪便和尿液排出。所以，在动物粪便中会有大量的磺胺二甲嘧啶残留物存在。而动物粪便常作为肥料应用于农业土地，这就导致残留的磺胺二甲嘧啶等其他抗生素药物进入生态环境中，引发系列环境问题。堆肥技术被认为是一种粪便无害化和资源化处理的简便易行方法，能有效去除粪便中多数抗生素残留。但磺胺二甲嘧啶是一类较顽固的抗生素，其在常规堆肥温度下不易分解，堆肥成熟之后仍然会有部分残留物未能去除。
[0003]通过对国内外研究的调查，发现目前筛选出的对磺胺类抗生素具有降解能力的菌大多数为常温或低温菌，无法应用于高温堆肥中。中国专利号:ZL 201210153552.7，申请公布日为2013年03月06日，发明创造名称为:一株Pseudomonas psychrophila HA-4低温磺胺甲基异恶唑降解菌及其筛选方法和应用。该菌可以以磺胺甲基异恶唑为唯一碳、氮及能源生长，其细胞液体培养可以降解磺胺甲基异恶唑，能够应用于城市污水中磺胺甲基异恶唑的生物降解，该菌在低温条件下对初始浓度为100 mg/L的磺胺甲基异恶唑去除率达到35.34 %。这种菌为常/低温菌种，无法应用于高温堆肥中，且该菌对抗生素的降解效率较低。因此，应该筛选出对磺胺类抗生素具有高效降解能力的高温菌，把它们制备成菌剂应用于实际的高温堆肥，不但能提高堆肥中微生物的多样性，提高堆肥温度，还可以进一步使残留的磺胺药物彻底降解，这对于降低堆肥产物的环境风险具有重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07及其筛选方法。筛选出的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，能在高温(50-75°C)下高效降解磺胺二甲嘧啶，可制备成微生物菌剂，应用于高温堆肥中，实现堆肥产品中磺胺二甲嘧啶抗生素的高效降解，为堆肥产品的农业应用奠定基础。
[0005]上述目的与任务是通过如下技术方案实现:
一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，其特征在于:所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07于2016年04月21日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为:CGMCCN0.12382。保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。经鉴定其为:喜热嗜油地芽孢杆菌(Geobacillus thermoleovorans)。该菌的 16S rDNA的Genbank登录号为KU588289。
[0006]进一步地，所述磺胺二甲啼啶降解菌S-07经I 6 s rRNA鉴定为地杆菌属(Geobacillus)的一种，与GeobaciI Ius thermoIeovorans的同源性达到99.65 %。该菌 16SrDNA 的 Genbank 登录号为 KU588289。
[0007]进一步地，所述磺胺二甲嘧啶降解菌S-07是在70°C下从抗生素制药厂车间污泥样品，通过富集、驯化和分离纯化得到。筛选方法的具体步骤如下:
1)富集驯化
取含水率为70-85 %的抗生素药厂车间原污泥，按20 ml/g的比例加入磺胺二甲嘧啶的初始浓度为5.0 mg/L的MMSM培养基中；在温度为70°C，摇床转速为100 rpm的条件下避光培养;每驯化10天后，将培养液离心，离心得到的沉淀物转接至新的MMSM培养基中，每转接一次，MMSM培养基中磺胺二甲嘧啶的浓度增加5 mg/L，直到磺胺二甲嘧啶浓度达到50 mg/L;
2)分离纯化
取0.1ml最终的培养液涂布于磺胺二甲嘧啶浓度为50 mg/L的选择性平板上，置于70°C培养箱中培养。将平板上长出的单菌落挑出，经过多次在磺胺二甲嘧啶选择性平板上划线，分离纯化得到磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，并将其划线至LB培养基斜面上，置于4°C冰箱保藏。
[0008]进一步地，所述的MMSM培养基组成为:Na2EDTA.2H20 (0.018 g/L)，FeSO4.7H20(0.013 g/L), CaCl2.2H20 (0.013 g/L), MgSO4.7H20 (0.25 g/L), Na2HPO4 (7.5 g/L), KH2PO4(5 g/L), NH4NO3 (5 g/L),酵母提取物(0.6 g/L)，葡萄糖(0.5 g/L)。
[0009]进一步地，所述的选择性平板的制备方法为在MMSM培养基中加入2%的琼脂粉摇匀，于121°C高压灭菌锅，灭菌20分钟，冷却至60-70 °C，向其中加入磺胺二甲嘧啶溶液，摇匀后倒入培养皿中，凝固后制备出选择性平板。
[0010]进一步地，所述的LB培养基组成为:胰蛋白胨(10.0g/L)，酵母提取物(5.0 g/L),NaCKlO g/L);也可向其中加入2.0 %的琼脂粉，制成固体LB培养基。
[0011]进一步地，所述的磺胺二甲嘧啶的降解能力测试方法为:将斜面保藏的菌S-07用LB液体培养基进行活化，并制成种子液。接种至磺胺二甲嘧啶的浓度为10 mg/L、pH为6.0的MMSM培养基中，置于70°C，摇床转速为50 rpm条件下避光培养。24 h后测得液体培养基中的磺胺二甲嘧啶的降解率大于90 %。
[0012]进一步地，所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07可以制备成微生物菌剂应用于畜禽粪便或污泥高温堆肥中，降解其中的磺胺二甲嘧啶。
【附图说明】
[0013]图1为磺胺二甲嘧啶降解菌S-07在扫描电镜下的形态。
[0014]图2为温度对磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的生长以及降解磺胺二甲嘧啶能力的影响。
[0015]图3为pH对磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的生长以及降解磺胺二甲嘧啶能力的影响。
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图和实施例对本发明技术方案作进一步阐述。
[0017]实施例1
称取5.0 g抗生素药厂车间污泥置于250 ml三角瓶中，其中加入100 ml MMSM培养基，其中磺胺二甲啼啶的浓度为5.0 mg/L，置于70°C，摇床转速为10rpm条件下避光培养。每驯化10天，取5.0 ml培养液转接I次，每次培养基中抗生素浓度增加5 mg/L，直到磺胺二甲嘧啶浓度达到50 mg/L。取0.1 ml培养液涂布于磺胺二甲嘧啶浓度为50mg/L的选择性平板，置于70°C培养箱中培养。将平板上长出的菌落挑出，分离纯化得到降解菌S-07。
[0018]其中，MMSM培养基制备方法为:Na2EDTA.2H20 (0.018 g/L) , FeSO4.7H20(0.013 g/L), CaCl2.2H20 (0.013 g/L), MgSO4.7H20 (0.25 g/L), Na2HPO4 (7.5 g/L), KH2PO4 (5 g/L), NH4NO3 (5 g/L),酵母提取物(0.6 g/L)，葡萄糖(0.5 g/L)，磺胺二甲嘧啶。筛选培养基制备方法为:MMSM培养基中加入2.0%的琼脂粉，制成磺胺二甲嘧啶选择性平板。培养基均是于121 °C高压灭菌锅，灭菌20分钟后使用。
[0019]采用16s rRNA基因序列法对降解菌S-07进行分类鉴定。测得的16s rRNA基因序列与GenBank中已报道的序列进行比对，结果表明降解菌S-07为地杆菌(Geobaci I Ius)的一种，该菌与地杆菌属的GeobaciIIus thermoIeovorans的同源性达到99.65 %。
[0020]温度对降解菌S-07降解能力的影响
LB培养基在70 0C下培养12 h后的种子液，在室温下6000 rpm，离心5分钟，得到的沉淀物用PBS缓冲液洗涤2次，再用生理盐水将菌体制成0D6QQ=2.0的菌悬液。MMSM培养基(pH=6.5)中磺胺二甲嘧啶的浓度为10 mg/L，50 ml培养基中接种1.0 %的菌悬液，摇床温度分别设定为50、55、60、65、70和75 V，24 h后取样检测磺胺二甲嘧啶的浓度，并测定菌体生长量(ODboo)，结果如图2所示。由图2可以看出，在70 °C下，磺胺二甲嘧啶的降解效果最佳。
[0021 ] pH对降解菌S-07降解能力的影响
LB培养基在70 0C下培养12 h后的种子液，在室温下6000 rpm，离心5分钟，得到的沉淀物用PBS缓冲液洗涤2次，再用生理盐水将菌体制成OD6qq为2.0的菌悬液。MMSM培养基中磺胺二甲嘧啶的浓度为10 mg/L，并用酸碱调节pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。50 ml培养基中接种1.0 %的菌悬液，摇床温度设定为70°C。24 h后取样测定磺胺二甲嘧啶的浓度，并测定菌体生长量(OD6qq )。由图3可以看出该菌在pH=6.0时，培养基中磺胺二甲嘧啶的降解率达到最大，并且生长量也达到最大。
[0022]最适温度和pH条件下降解菌S-07对磺胺二甲嘧啶的降解
LB培养基在70 0C下培养12 h后的种子液，在室温下6000 rpm，离心5分钟，得到的沉淀物用PBS缓冲液洗涤2次，再用生理盐水将菌体制成OD6qq为2.0的菌悬液。MMSM培养基中磺胺二甲嘧啶的浓度为10 mg/L，并用酸碱调节培养基pH值=6.0。实验组在50 ml培养基中接种1.0 %的菌悬液，对照组则是在50 ml培养基中加入1.0 %的无菌水，摇床温度设定为70°C，转速为50 rpm ο 24 h后取样测定对照组和实验组的磺胺二甲嘧啶的浓度，并计算得出相应的降解率。对照组24 h磺胺二甲嘧啶的降解率为23.35 %，实验组24 h磺胺二甲嘧啶的降解率可达97.45 %。除去温度的降解效果，降解菌S-07对磺胺二甲嘧啶的降解效果达到74.10%。
[0023]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1.一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，其特征在于:所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07于2016年04月21日保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，其保藏号CGMCC N0.12382。2.根据权利要求1所述的一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，其特征在于:所述磺胺二甲嘧啶降解菌S-07经16s rRNA鉴定为地杆菌属(Geobaci I Ius )的一种，与Geobaci I Iusthermoleovorans 的同源性达到 99.65%。3.根据权利要求1所述的一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，其特征在于:所述磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的16S rDNA的Genbank登录号为KU588289。4.根据权利要求1所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的筛选方法，其特征在于:所述磺胺二甲嘧啶降解菌S-07是在70°C下从抗生素制药厂车间污泥样品中，通过富集、驯化和分离纯化得到。5.筛选方法的具体步骤如下: 1)富集驯化:取含水率为70-85%的抗生素药厂车间原污泥，按20ml/g的比例加入磺胺二甲嘧啶的初始浓度为5.0 mg/L的无机盐培养基(MMSM)中；在温度为70°C，摇床转速为100rpm的条件下避光培养;每驯化10天后，将培养液离心，离心得到的沉淀物接至新的MMSM培养基中，每转接一次，MMSM培养基中磺胺二甲嘧啶的浓度增加5 mg/L，直到磺胺二甲嘧啶浓度达到50 mg/L； 2)分离纯化:取0.1ml最终的培养液涂布于磺胺二甲嘧啶浓度为50 mg/L的选择性平板上，置于70 0C培养箱中培养。6.根据权利要求5所述的选择性平板，将平板上长出的单菌落挑出，经过多次在磺胺二甲嘧啶选择性平板上划线，分离纯化得到磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，并将其划线至LB培养基斜面上，置于4 °C冰箱保藏。7.根据权利要求5所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的筛选方法，其特征在于:所述的MMSM培养基组成为:Na2EDTA.2H20 (0.018 g/L)，FeSO4.7H20 (0.013 g/L)，CaCl2.2H20 (0.013 g/L), MgSO4.7H20 (0.25 g/L), Na2HPO4 (7.5 g/L), KH2PO4(5 g/L),NH4NO3 (5 g/L),酵母提取物(0.6 g/L)，葡萄糖(0.5 g/L)。8.根据权利要求5所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的筛选方法，其特征在于:所述的选择性平板的制备方法为在MMSM培养基中加入2 %的琼脂粉摇匀，于121 0C高压灭菌锅，灭菌20分钟，冷却至60-70°C，向其中加入磺胺二甲嘧啶溶液，摇匀后倒入培养皿中，凝固后制备出选择性平板。9.根据权利要求5所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的筛选方法，其特征在于:所述的LB培养基组成为:胰蛋白胨(10.0 8/1)，酵母提取物(5.0 g/L)，NaCl(10.0 g/L);也可向其中加入2.0 %的琼脂粉，制成固体LB培养基。10.根据权利要求1，2或3所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，其特征在于:所述的磺胺二甲嘧啶的降解能力测试方法为:将斜面保藏的菌S-07用LB液体培养基进行活化，并制成种子液。11.根据权利要求10所述的种子液，其特征在于:将种子液接种至磺胺二甲嘧啶浓度为10mg/L，pH为6.0的MMSM培养基中，置于70°C，摇床转速为50 rpm条件下避光培养，24 h后测得液体培养基中的磺胺二甲嘧啶的降解率大于95 %。12.根据权利要求1、2或7所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，其特征在于:所述的磺胺二 。钽塑in趦鹅Kc/C f ^ 「I 七 Xl V 98298901 Zo
【文档编号】C05F3/00GK105861385SQ201610345650
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】汪印, 潘兰佳, 余广炜, 唐晓达, 李 杰
【申请人】中国科学院城市环境研究所