一种有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂dh-1及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH?1及其应用。其含有假单胞菌(Pseudomona)属的细菌、申氏杆菌(Shinella)属的细菌、热单胞菌(Thermomonas)属的细菌、德沃斯氏菌(Devosia)属的细菌和另类希灭氏菌(Alishewanella)属的细菌。本发明通过向水体中投入特定的功能微生物?复合菌剂DH?1，发挥微生物水生微生态调节和“藻菌互作”的作用，从而达到抑制(去除)铜绿微囊藻的微生物除藻法，具有成本低、安全性高和不破坏水体生态环境的特色，对治理铜绿微囊藻水华水体具有重要的现实意义。
【专利说明】
一种有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH-1及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物应用领域，具体涉及一种有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂 DH-I及其应用。
【背景技术】：
[0002] 随着城市化和工农业生产的发展，大量富含氮(N)、磷(P)等营养物质的工业废水、 生活污水流入湖泊、河流等缓流水体，使水中营养物质迅速富集，水中藻类暴发性增长，蓝 藻水华频繁发生，造成水体严重富营养化，给水体质量、用水安全和景观环境等方面带来不 利影响。铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是引起水华的最常见藻种，也是我国蓝藻 水华的主要藻种，其特殊的生理生态特点使其在富营养化水体中容易成为优势藻种并导致 蓝藻水华的暴发。铜绿微囊藻在细胞生长及死亡过程中会释放出肝毒素，该毒素是一种强 促癌剂，对水生生物危害极大，间接危害人类的健康，因此，治理蓝藻水华污染已成为急迫 解决的问题。
[0003] 目前蓝藻水华的治理方法主要有物理法和化学法，这些方法存在一定的缺陷，如 物理法成本高、需要大量人力物力和处理能力有限。化学法容易造成二次污染，选择毒性差 或者只能适应小面积水域。因此，积极寻找新型、高效、环保的蓝藻水华防治方法具有十分 重要的意义。
【发明内容】
：
[0004] 本发明的目的是提供一种能有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH-I及其应用。
[0005] 本发明的能有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH-I，其特征在于，含有假单胞 菌属（Pseudomona sp.)的细菌、申氏杆菌属（Shinella sp.)的细菌、热单胞菌属 (Thermomonas sp.)的细菌、德沃斯氏菌属（Devosia sp.)的细菌和另类希灭氏菌属 (Alishewanella sp.)的细菌。
[0006] 优选，所述的能有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH-I中，假单胞菌属的细菌、 申氏杆菌属的细菌、热单胞菌属的细菌、德沃斯氏菌属的细菌和另类希灭氏菌属的细菌数 量比为 160:27:8:3:1。
[0007] 优选，所述的假单胞菌属的细菌优选为门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina)ACCC01078或假单胞菌（Pseudomonas sp. )FIM_20151013001;所述的申氏杆菌 属的细菌为申氏杆菌（Shinella sp.)ACCC19821或申氏杆菌（Shinella sp.)FIM_ 20151013002;所述的热单胞菌属的细菌为热单胞菌（Thermomonas sp.)F頂-20151013003; 所述的德沃斯氏菌属的细菌为德沃斯氏菌(Devosia honganense)ACCC19737或德沃斯氏菌 (Devosia sp . )FIM-20151013004,所述的另类希灭氏菌属的细菌优选为另类希灭氏菌 (Alishewanella fetalis)ACCC10045或另类希灭氏菌（Alishewanella sp.)FIM_ 20151013005〇
[0008] 本发明的第二个目的是提供能有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH-I的制备 方法，其特征在于，将假单胞菌属的细菌、申氏杆菌属的细菌、热单胞菌属的细菌、德沃斯氏 菌属的细菌和另类希灭氏菌属的细菌的菌液混合后，去除菌液留下菌体，菌体即为复合菌 剂DH-I。
[0009]优选，是分别将假单胞菌属的细菌、申氏杆菌属的细菌、热单胞菌属的细菌、德沃 斯氏菌属的细菌和另类希灭氏菌属的细菌分别进行发酵，然后稀释至菌体浓度为IXIO8 个/ml，再将I X IO8个/ml的假单胞菌属的细菌、申氏杆菌属的细菌、热单胞菌属的细菌、德 沃斯氏菌属的细菌和另类希灭氏菌属的细菌按照体积比160:27:8:3:1混合均匀，然后离心 去除上清，留下菌体，菌体即为复合菌剂DH-I。
[0010]本发明的第三个目的是提供能有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH-I在抑制 水华铜绿微囊藻中的应用。
[0011]本发明依据微生物生态学原理和方法，对水华铜绿微囊藻功能菌进行合理复配， 获得对铜绿微囊藻具有良好的抑制(去除)效果的复合菌剂DH-I，具有推广应用的价值。
[0012] 本发明通过向水体中投入特定的功能微生物-复合菌剂DH-I，发挥微生物水生微 生态调节和"藻菌互作"的作用，从而达到抑制（去除）铜绿微囊藻的微生物除藻法，具有成 本低、安全性高和不破坏水体生态环境的特色，对治理铜绿微囊藻水华水体具有重要的现 实意义。
【具体实施方式】：
[0013] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0014] 以下实施例中使用的假单胞菌(Pseudomonas sp · )FIM_20151013001、申氏杆菌 (Shinella sp· )F頂-20151013002、热单胞菌（Thermomonas sp· )F頂-20151013003、德沃斯 氏菌（Devosia sp.)FIM_20151013004和另类希灭氏菌（Alishewanella sp.)FIM_ 20151013005均来自于福建省微生物研究所，其保藏于福建省微生物研究所，保藏于福建省 微生物研究所的菌株是对外销售的，这些菌株也是对外销售的，因此在申请日以前，现有技 术中的任何人都可以购买到这些菌株。并且上述菌株在申请日以前已经公开在网页上 (http: //www. fjim. org. cn/kytd/ktz/getNews · jsp?newsid = 220)，该菌株本
【申请人】也持 有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
[0015] 实施例1:
[0016] 1、斜面培养
[0017] 将假单胞菌（Pseudomonas sp · )FIM_20151013001、申氏杆菌（Shinella sp · )FIM_ 20151013002、热单胞菌（Thermomonas sp. )FIM_20151013003、德沃斯氏菌（Devosia sp.) F頂-20151013004和另类希灭氏菌(Alishewanella sp. )F頂-20151013005以及铜绿假单胞 菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和门多萨假单胞菌 (Pseudomonas mendocina)接种至营养琼脂培养基上，于28°C培养箱培养2~3d。
[0018]营养琼脂培养基配方：蛋白胨IOg，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15~20g，蒸馏水 1000 mL，混合均勾后，121 °C高压灭菌15min。
[0019] 2、发酵培养
[0020] 用接种环分别挑起少量斜面培养基上的上述菌株的菌体接入发酵培养基中，于28 °C、150r/min的摇床上振荡培养2~3d。用发酵培养基对菌液进行稀释，使其浓度为IX IO8 ~IO9个/ml。发酵培养基配方(g/1):胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠10.0，余量为水，pH 自然，将上述成份混合均匀后，灭菌备用。
[0021] 3、复合菌剂的制备
[0022] 将I X IO8个/ml的假单胞菌菌液、I X IO8个/ml的申氏杆菌菌液、I X IO8个/ml的热 单胞菌菌液、I X IO8个/ml的德沃斯氏菌菌液和I X IO8个/ml的另类希灭氏菌菌液，按照体积 比160:27:8:3:1的体积比混合均匀，8000r/min离心5min，弃上清液得到菌体，即为复合菌 剂，将此复合菌剂命名为复合菌剂DH-I。
[0023] 实施例2复合菌剂DH-I和假单胞菌属菌种对铜绿微囊藻的抑制作用试验
[0024] 采集福州长乐某蓝藻水华河水，该蓝藻水华优势种为铜绿色微囊藻。河水预先经8 层纱布过滤去除大颗粒物质。量取2L河水，加入到5L烧杯中，同时加入IL BG-11培养基，搅 匀混均。以不添加菌的组作为空白对照组(CK)，以分别添加实施例1的复合菌剂DH-1、铜绿 假单胞菌、恶臭假单胞菌、门多萨假单胞菌、申氏杆菌(Shinella sp. )F頂-20151013002、热 单胞菌（Thermomonas sp. )FIM_20151013003、德沃斯氏菌（Devosia sp. )FIM_20151013004 和另类希灭氏菌(Alishewanella sp. )F頂-20151013005的组为实验组，均设三个平行样， 铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、门多萨假单胞菌、申氏杆菌（Shine Ila sp. )FIM-20151013002、热单胞菌（Thermomonas sp. )FIM_20151013003、德沃斯氏菌（Devosia sp.) F頂-20151013004和另类希灭氏菌(Alishewanella sp. )F頂-20151013005的菌体添加量与 复合菌剂DH-I的添加量相同。由于叶绿素 a(chlorophyll-a，chl_a)作为藻类细胞的重要吸 光色素在光合作用中起着吸收和传递光能的关键作用，对藻类的生长起重要影响，是植物 生长状况的重要指标之一，所以以叶绿素 a的含量作为藻类含量的评价指标。采用丙酮提取 分光光度法（中华人民共和国水利行业标准(SL 88-2012))测定叶绿素 a含量。
[0025] 预先测定初始水体中的叶绿素 a含量。实验组分别按1%。的体积百分比投加复合菌 剂DH-I、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、门多萨假单胞菌、申氏杆菌（Shine I la sp. )FIM-20151013002、热单胞菌（Thermomonas sp. )FIM_20151013003、德沃斯氏菌（Devosia sp.) FIM-20151013004和另类希灭氏菌（Alishewanella sp. )FIM-20151013005,底部设有曝气 头，采用间歇曝气，即曝2h，停2h，实验在光照培养箱中进行，培养条件为(25±1)°C，光暗比 (光照时间与无光照时间之比）为12:12,光照强度为20001UX。定时观察。培养8d后测定水体 中的叶绿素 a含量。
[0026]实验结果表明（表1)，培养8d后，空白对照组(CK)以及加入复合菌剂DH-1、铜绿假 单胞菌、恶臭假单胞菌、门多萨假单胞菌、申氏杆菌(Shinella sp.)F頂-20151013002、热单 胞菌（Thermomonas sp. )FIM_20151013003、德沃斯氏菌（Devosia sp. )FIM_20151013004和 另类希灭氏菌(Alishewanella sp. )FIM_20151013005的处理组水体中的叶绿素 a平均含量 分别为 1 · 349yg/L、0 · 2 lyg/L、0 · 60yg/L、0 · 69yg/L、0 · 63yg/L、1 · 0 lyg/L、0 · 98yg/L、1 · 07yg/ L和0.95yg/L。与初始水体中的叶绿素 a含量0.29yg/L相比，空白对照组(CK)水体中的叶绿 素 a含量有显著的上升，说明经过Sd培养后空白对照组中的铜绿微囊藻迅速生长繁殖，含量 明显提高。与空白对照组(CK)相比，添加了假单胞菌属铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、门多 萨假单胞菌的处理组水体中的叶绿素 a含量有小幅度的上升，说明假单胞菌属铜绿假单胞 菌、恶臭假单胞菌和门多萨假单胞菌对铜绿微囊藻具有一定的抑制效果，而添加申氏杆菌 (Shinella sp· )F頂-20151013002、热单胞菌（Thermomonas sp· )F頂-20151013003、德沃斯 氏菌（Devosia sp.)FIM_20151013004 和另类希灭氏菌（Alishewanella sp.)FIM-20151013005的处理组水体中的叶绿素 a含量有一定的上升，说明申氏杆菌(Shinella sp.) F頂-20151013002、热单胞菌（Thermomonas sp· )FM-20151013003、德沃斯氏菌（Devosia sp· )F頂-20151013004和另类希灭氏菌(Alishewanella sp· )FIM-20151013005对铜绿微囊 藻不具有显著的抑制效果，而添加复合菌剂DH-I的处理组与空白对照组(CK)和添加铜绿假 单胞菌、恶臭假单胞菌和门多萨假单胞菌的处理组相比，其水体中的叶绿素 a含量变化不明 显，说明复合菌剂DH-I对水华铜绿微囊藻具有强烈的抑制作用，复合菌剂DH-I比单一的假 单胞菌属菌株具有更佳的抑制水华铜绿微囊藻的效果。
[0027]表1实验菌对铜绿微囊藻的抑制结果
[0029] BGll培养基组分：NaNO3 1.5g，K2HP〇4 0.04g，MgS〇4 · 7H20 0.075g，CaCl2 · 7H20 0.036g ,Na2CO3 0.02g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁0.006g，微量元素溶液A5 Iml，氨苄青霉素 (终浓度）50yg/mL，水定容至1000 mU微量元素溶液A5组分：H3B〇4 2.86g，MnCl2 · 4H201.81g，ZnS〇4 0.222g，Na2Mo〇4 0.39g，CuS〇4.5H20 0.079g，Co(N03)2.6H2〇 49.4g，水 定容至1000ml。
[0030] 本发明也可以用假单胞菌(Pseudomona)属的其他细菌、申氏杆菌(Shinella)属的 其他细菌、热单胞菌(Thermomonas)属的其他细菌、德沃斯氏菌(Devosia)属的其他细菌和 另类希灭氏菌(Al ishewanel la)属的其他细菌，如将实施例1中的假单胞菌(Pseudomonas sp. )FIM_20151013001 替换为门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina)ACCC01078、申氏 杆菌（Shinella sp.)F頂-20151013002替换为申氏杆菌（Shinella sp. )ACCC19821、德沃斯 氏菌（Devosia sp.)FIM_20151013004替换为德沃斯氏菌（Devosia honganense) ACCC19737，另类希灭氏菌（Alishewanel la sp · )FIM_20151013005替换为另类希灭氏菌 (Alishewanella fetalis)ACCC10045,然后按照实施例1的方法制备得到复合菌剂DH-I (2)，然后按照上述方法进行抑制水华铜绿微囊藻的实验，实验结果显示复合菌剂DH-1(2) 对水华铜绿微囊藻具有强烈的抑制作用，复合菌剂DH-1(2)比单一的假单胞菌属菌株具有 更佳的抑制水华铜绿微囊藻的效果。所述的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina) ACCC01078、申氏杆菌（Shinella sp.) ACCC19821、德沃斯氏菌（Devo si a honganense) ACCC19737、另类希灭氏菌(Alishewanel la fetal is )ACCC10045均保藏于中国农业微生物 菌种保藏管理中心，可以从那里购买到。
【主权项】
1. 一种能有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH-1，其特征在于，含有假单胞菌属 (卩8611(1〇1]10仙8。.）的细菌、申氏杆菌属（311；[11611&8。.）的细菌、热单胞菌属（1'1161'1]101]1011&8 sp.)的细菌、德沃斯氏菌属(Devosia sp.)的细菌和另类希灭氏菌属(Alishewanella sp.) 的细菌。2. 根据权利要求1所述的能有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH-1，其特征在于，所 述的能有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH-1中，假单胞菌属的细菌、申氏杆菌属的细 菌、热单胞菌属的细菌、德沃斯氏菌属的细菌和另类希灭氏菌属的细菌数量比为160:27:8: 3:1〇3. 根据权利要求1所述的能有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH-1，其特征在于，所 述的假单胞菌属的细菌为门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)ACCCO 1078或假单胞 菌(Pseudomonas sp. )FIM_20151013001;所述的申氏杆菌属的细菌为申氏杆菌（Shinella sp.)ACCC19821或申氏杆菌（Shinella sp.)F頂-20151013002;所述的热单胞菌属的细菌为 热单胞菌(Thermomonas sp. )FIM_20151013003;所述的德沃斯氏菌属的细菌为德沃斯氏菌 (Devosia honganense)ACCC19737或德沃斯氏菌（Devosia sp. )FIM_20151013004,所述的 另类希灭氏菌属的细菌为另类希灭氏菌(Alishewanella fetal is )ACCC10045或另类希灭 氏菌（Alishewanella sp. )FIM_20151013005〇4. 一种权利要求1所述的能有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH-1的制备方法，其 特征在于，将假单胞菌属的细菌、申氏杆菌属的细菌、热单胞菌属的细菌、德沃斯氏菌属的 细菌和另类希灭氏菌属的细菌的菌液混合后，去除菌液留下菌体，菌体即为复合菌剂DH-1。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，是分别将假单胞菌属的细菌、申氏杆 菌属的细菌、热单胞菌属的细菌、德沃斯氏菌属的细菌和另类希灭氏菌属的细菌分别进行 发酵，然后稀释至菌体浓度为1 X 1〇8个/ml，再将1 X 108个/ml的假单胞菌属的细菌、申氏杆 菌属的细菌、热单胞菌属的细菌、德沃斯氏菌属的细菌和另类希灭氏菌属的细菌按照体积 比160:27:8:3:1混合均匀，然后离心去除上清，留下菌体，菌体即为复合菌剂DH-1。6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的假单胞菌属的细菌为门多萨假 单胞菌（Pseudomonas mendocina)ACCC01078或假单胞菌（Pseudomonas sp.)FIM_ 20151013001;所述的申氏杆菌属的细菌为申氏杆菌(Shinella sp. )ACCC19821或申氏杆菌 (Shinella sp· )FIM_20151013002;所述的热单胞菌属的细菌为热单胞菌（Thermomonas sp. )FIM_20151013003;所述的德沃斯氏菌属的细菌为德沃斯氏菌(Devosia honganense) 八〇〇(319737或德沃斯氏菌(06￥〇813 8口.奸頂-20151013004，所述的另类希灭氏菌属的细菌 为另类希灭氏菌（Alishewanella fetal is )ACCC 10045或另类希灭氏菌（Alishewanella sp.)F頂-20151013005。7. 权利要求1、2或3所述的能有效抑制水华铜绿微囊藻的复合菌剂DH-1在抑制水华铜 绿微囊藻中的应用。
【文档编号】C12R1/38GK105861395SQ201610421245
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】聂毅磊, 陈宏 , 贾纬
【申请人】福建省微生物研究所