一种高效分泌表达溶解性多糖单加氧酶cbp21的重组菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种高效分泌表达溶解性多糖单加氧酶CBP21的重组菌及其应用。本发明提供的高效分泌表达CBP21蛋白的重组菌为在枯草芽胞杆菌中表达信号肽编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21编码基因；所述信号肽为枯草芽胞杆菌信号肽；所述枯草芽胞杆菌信号肽为信号肽YlqB或信号肽Pel。通过实验证明：本发明的重组菌发酵获得的CBP21蛋白对不同酶家族的几丁质酶均有明显促酶活作用，在几丁质酶的选择上具有一定普适性。
【专利说明】
一种高效分泌表达溶解性多糖单加氧酶CBP21的重组菌及其 应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效分泌表达溶解性多糖单加氧酶 CBP21的重组菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 几丁质又名甲壳素、几丁聚糖，是一种类似于植物纤维的六糖聚合体，其在自然界 中分布广泛，是仅此于纤维素的第二大天然生物有机资源，年生物合成量达100亿吨。几丁 质酶(EC. 3.2.14)能将几丁质水解为N-乙酰氨基葡萄糖，溶解性多糖单加氧酶能协同几丁 质酶降解几丁质，是一种对几丁质的降解至关重要的蛋白，作为"几丁质氧化水解酶"分类 到辅助酶AAlO家族中。
[0003] 枯草芽孢杆菌是一种安全、高效分泌且经济的表达宿主，其培养简单快速，具有较 强的分泌表达能力、无致病性及良好的发酵基础和生产技术，是饲料行业酶制剂的首选表 达系统。在外源蛋白表达分泌过程中，信号肽影响着外源蛋白的分泌效率。筛选最优信号肽 以提高外源蛋白的分泌量，是外源蛋白高效表达的关键因素之一，决定着工业生产蛋白的 大规模生产。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种重组菌。
[0005] 本发明的重组菌为在枯草芽胞杆菌中通过源于枯草芽胞杆菌的信号肽引导溶解 性多糖单加氧酶CBP21的表达。
[0006] 上述重组菌中，所述源于枯草芽胞杆菌的信号肽为信号肽HqB或信号肽Pel;
[0007] 所述信号肽HqB的氨基酸序列为序列9;
[0008] 所述信号肽Pel的氨基酸序列为序列11。
[0009] 上述重组菌中，
[0010]所述信号肽HqB的编码基因序列为序列22的第1-81位核苷酸分子；
[0011]所述信号肽Pel的编码基因序列为序列24的第1-63位核苷酸分子。
[0012] 上述重组菌中，所述在枯草芽胞杆菌中通过源于枯草芽胞杆菌的信号肽引导溶解 性多糖单加氧酶CBP21的表达的方法为如下1)或2):
[0013] 1)将含有信号肽HqB编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21编码基因的片段导入 枯草芽胞杆菌中；
[0014] 2)将含有信号肽Pel编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21编码基因的片段导入 枯草芽胞杆菌中。
[0015] 上述重组菌中，1)中，所述含有信号肽HqB编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21 编码基因的片段通过pYl qB_CBP21导入枯草芽胞杆菌中；所述pYl qB_CBP21为将序列22所示 的DNA片段插入pWB980载体的Hind III和Xho I酶切位点之间，且保持pWB980载体的其他序 列不变得到的载体；
[0016] 2)中，所述含有信号肽Pel编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21编码基因的片段 通过pPel-CBP21导入枯草芽胞杆菌中；所述pPel-CBP21为将序列24所示的DNA片段插入 PWB980载体的Hind III和Xho I酶切位点之间，且保持pWB980载体的其他序列不变得到的 载体。
[0017] 上述重组菌中，所述含有信号肽HqB编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21编码 基因的片段的核苷酸序列为序列22;
[0018] 所述含有信号肽Pel编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21编码基因的片段的核 苷酸序列为序列24。
[0019] 上述重组菌中，所述枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌168。
[0020]本发明的另一个目的是提供上述含有信号肽HqB编码基因和溶解性多糖单加氧 酶CBP21编码基因的片段或上述含有信号肽Pel编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21编码 基因的片段。
[0021]本发明还有一个目的是提供上述重组菌或上述信号肽HqB或上述信号肽Pel的新 用途。
[0022]本发明提供了上述重组菌或上述信号肽YlqB或上述信号肽Pel在促进和/或提高 几丁质酶活性中的应用。
[0023]本发明还提供了上述重组菌或上述信号肽HqB或上述信号肽Pel在在提高溶解性 多糖单加氧酶CBP21的分泌量中的应用。
[0024]本发明还提供了上述重组菌或上述信号肽HqB或上述信号肽Pel在生产溶解性多 糖单加氧酶CBP21中的应用。
[0025]本发明的最后一个目的是提供一种生产溶解性多糖单加氧酶CBP21的方法。
[0026]本发明提供的生产溶解性多糖单加氧酶CBP21的方法包括如下步骤:发酵培养上 述重组菌，得到所述溶解性多糖单加氧酶CBP21。
[0027]上述方法中，培养的条件为30°C培养1天。
[0028] 与现有技术相比，本发明产生如下有益效果：
[0029] 1、本发明是关于CBP21在枯草芽胞杆菌中的高效表达，为CBP21蛋白工业化生产提 供了新的方法。
[0030] 2、在枯草芽孢杆菌中表达CBP21蛋白具有如下优势：
[0031] (1)枯草芽孢杆菌属于国际公认的安全微生物(GRAS)，不含LPS，纯化相对简单； (2)枯草芽孢杆菌只具有单层的细胞外膜，且有一套高效的分泌信号肽和分子伴侣系统，有 利于胞外蛋白的分泌；（3)遗传背景清晰，Kunst F等1997年测序获得了枯草芽孢杆菌168菌 株全基因组序列，并且有许多质粒和噬菌体都可以作为克隆载体；（4)培养条件简单，且生 长速度较快，可显著降低生产成本。
[0032] 3、本发明对引导CBP21分泌的信号肽进行了筛选，提供的Pel和HqB较其他信号肽 能显著提高CBP21分泌量。
[0033] 4、本发明在前人基础上进一步完善了CBP21的应用研究。
[0034] 本发明提供了一种高效分泌表达CBP21蛋白的重组菌。通过实验证明：该重组菌发 酵获得的CBP21蛋白对不同酶家族的几丁质酶均有明显促酶活作用，具有一定普适性。
【附图说明】
[0035]图1为成功转化pWB980-signal-CBP21重组质粒的重组枯草芽胞杆菌的鉴定结果 图。其中，1_13:鉴定菌株，依次为含信号肽 Bpr、AspB、BglC、AmyE、AbnA、CccA、SacB、YolA、 YlqB、Pel、AprE、Epr、NprE; 14:含空载体 168 菌株。
[0036]图2为由不同信号肽引导分泌的CBP21的SDS-PAGE图。
[0037]图3为总蛋白标准曲线图及曲线方程。
[0038] 图4为由不同信号肽引导分泌的CBP21发酵液上清的几丁质结合率测定。
[0039] 图5为CBP21纯化后的SDS-PAGE图。
[0040]图6为N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)标准曲线图及曲线方程。
[0041 ]图7为CBP21纯品对两种几丁质酶酶促活性测定。
【具体实施方式】
[0042] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044] 下述实施例中的枯草芽胞杆菌(Baci IIus subti Iis) 168在文献"Mul Ier，J · P · and C· R· Harwood(1998) ·''Protein secretion in phosphate-limited cultures of Bacillus subtilis 168."Appl Microbiol Biotechnol，49(3):321_327."中公开过，公众 可从中国农业科学院饲料研究所获得。
[0045] 下述实施例中的pWB980载体在文献"Wu，S.C.and S.L.Wong( 1999) · "Development of improved pUBllO-based vectors for expression and secretion studies in Bacillus subtilis. "Journal of Biotechnology，72(3) :185-195." 中公开过，公众可从 中国农业科学院饲料研究所获得。
[0046] 下述实施例中的几丁质酶Chi92在文献"Wu M.L,Chuang Y.C. ,Chen J.P.，et aI. Identification and Characterization of the Three Chitin-Binding Domains within the Multidomain Chitinase Chi92from Aeromonas hydrophila JP101.Applied and Environmental Microbiology，2001,67(11) :5100-5106." 中公开过，公众可从中国农 业科学院饲料研究所获得。
[0047] 下述实施例中的LB培养基为：I %NaCl，0 · 5%yeast extract，1 % tryptone。
[0048] 下述实施例中的 SR培养基为：2 · 5 % tryptone，2 % yeast extract，0 · 3 %K2HP〇4。
[0049] 下述实施例中的各种抗性培养基中抗生素浓度为:氨苄青霉素(Amp)100mg/L，卡 那霉素(Kana)50mg/L。
[0050] 下述实施例中的质量分数为3.1 %的胶体几丁质的制备方法如下:准确称取IOg几 丁质粉末置于烧杯中，缓慢加入预冷的浓HCl 400mL，搅拌使其呈糊状，4°C静置24h;将其缓 慢加入到盛有2000mL乙醇:水（I: I，v/v)溶液的烧杯中，边加边使用磁力搅拌器搅拌，4°C静 置24h;将搅拌后的溶液于4°C、12000rpm离心10min，弃上清，取沉淀即胶体几丁质；将沉淀 用蒸馏水冲洗、离心、冲洗至pH 7.0,最后用蒸馏水定容至1000mL。置于4°C冰箱保存。
[0051 ]实施例1、溶解性多糖单加氧酶CBP21分泌表达载体
[0052] 一、溶解性多糖单加氧酶CBP21分泌表达载体的构建
[0053] 1、CBP21表达载体构建
[0054] 将溶解性多糖单加氧酶CBP21的编码基因序列插入pWB980载体的Hind III和Xho 頂每切位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变，得到表达载体pWB980-CBP21。
[0055] 2、信号肽片段的扩增
[0056] 以枯草芽胞杆菌168基因组为模板，分别采用如下引物进行PCR扩增，分别得到如 下13个信号肽片段= AbnA(氨基酸序列为序列l)、AmyE(氨基酸序列为序列2)、AspB(氨基酸 序列为序列3)、BglC(氨基酸序列为序列4)、Bpr(氨基酸序列为序列5)、CccA(氨基酸序列为 序列6)、5 &(^(氨基酸序列为序列7)、￥〇14(氨基酸序列为序列8)、￥1邱(氨基酸序列为序列 9)、恥也(氨基酸序列为序列10)、卩 61(氨基酸序列为序列11)^?也(氨基酸序列为序列12) 和Epr(氨基酸序列为序列13) ICR引物序列如下：
[0057] abnA-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAAAAAGAAAAAAACATGG；
[0058] abnA-R：CATATGTGCACCGGCCGCTGCCTCTGCGGGAGCAGCAG；
[0059] amyE-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGTTTGCAAAACGATTCAAAAC；
[0060] amyE-R：CATATGTGCACCGGCCGCAGCACTCGCAGCCGCCGGTCCTGC；
[0061 ] aspB-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAAACTGGCAAAAAGAGTATCC；
[0062] aspB-R：CATATGTGCACCGGCCGCCGCTTTCGCTGTGATTGCCAG；
[0063] bglC-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAAACGGTCAATCTCTATTTTTATTACG；
[0064] bglC-R：CATATGTGCACCGGCCGCTGCTGATGCCGGCGAAGCTAT；
[0065] bpr-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAGGAAAAAAACGAAAAACAGA；
[0066] bpr-R：CATATGTGCACCGGCCGCTGCCCCGGCTGCTCCCGGAAAC；
[0067] cccA-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAAATGGAACCCGCTTATTCCA；
[0068] cccA-R：CATATGTGCACCGGCCGCTCCTTTTACTGATAAAAAGAAAG；
[0069] sacB-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACATCAAAAAGTTTGCAAAACAAG；
[0070] sacB-R：CATATGTGCACCGGCCGCTTCTTTGGCAAAAGCTTGAGTTGC；
[0071 ] y〇IA-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAAGAGAATTACATATTCACTGCTTG；
[0072] y〇lA-R：CATATGTGCACCGGCCGCCGCTTTTGCTTTTGATGAATCAGTG；
[0073] ylqB-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAAAAAAATCGGTTTATTGTTTATG；
[0074] yIqB-R：CATATGTGCACCGGCCGCAGCGTCTGCTTGCTGTGCCGGG；
[0075] peI-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAAAAAAGTGATGTTAGCTACGGC；
[0076] peI-R：CATATGTGCACCGGCCGCTGCGTTCGCGCCAGCTGGAG；
[0077] aprE-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAGAAGCAAAAAATTGTGGATC；
[0078] aprE-R：CATATGTGCACCGGCCGCGTTCAGCAACATGTCTGTGCAGGCT；
[0079] epr-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAAAAACATGTCTTGCAAAC；
[0080] epr-R:CATATGTGCACCGGCCGCCATAGGCCCTCTCGCTCATGCG。
[0081] 3、分泌表达载体的获得
[0082] 将步骤2获得的13个信号肽片段通过无缝克隆分别插入步骤1获得的pWB980-CBP21载体中，分别得到如下13个溶解性多糖单加氧酶分泌表达载体:？41^-08?21、?411^-CBP21、pAspB-CBP21、pBglC-CBP21、pBpr-CBP21、pCccA-CBP21、pSacB-CBP21、pYolA-CBP21、 pYlqB-CBP21、pNprE-CBP21、pPel-CBP21、pEpr-CBP21和pAprE-CBP21;
[0083] pAbnA-CBP21为将序列14所示的DNA片段插入pWB980载体的Hind III和Xho I酶切 位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变得到的载体；
[0084] pAmyE-CBP21为将序列15为将序列14所示的DNA片段插入pWB980载体的Hind III 和Xho頂每切位点之间，且保持pWB980载体的其他序列不变得到的载体；
[0085] pAspB-CBP21为将序列16所示的DNA片段插入pWB980载体的Hind III和Xho I酶切 位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变得到的载体；
[0086] pBglC-CBP21为将序列17所示的DNA片段插入pWB980载体的Hind III和Xho I酶切 位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变得到的载体；
[0087] pBpr-CBP21为将序列18所示的DNA片段插入pWB980载体的Hind III和Xho頂每切 位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变得到的载体；
[0088] pCccA-CBP21为将序列19所示的DNA片段插入pWB980载体的Hind III和Xho I酶切 位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变得到的载体；
[0089] pSacB-CBP21为将序列20所示的DNA片段插入pWB980载体的Hind III和Xho I酶切 位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变得到的载体；
[0090] pYolA-CBP21为将序列21所示的DNA片段插入PWB980载体的Hind III和Xho I酶切 位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变得到的载体；
[0091] pHqB-CBP21为将序列22所示的DNA片段插入pWB980载体的Hind III和Xho I酶切 位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变得到的载体；
[0092] pNprE-CBP21为将序列23所示的DNA片段插入pWB980载体的Hind III和Xho I酶切 位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变得到的载体；
[0093] pPel-CBP21为将序列24所示的DNA片段插入pWB980载体的Hind III和Xho頂每切 位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变得到的载体；
[0094] pAprE-CBP21为将序列25所示的DNA片段插入pWB980载体的Hind III和Xho I酶切 位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变得到的载体；
[0095] pEpr-CBP21为将序列26所示的DNA片段插入pWB980载体的Hind III和Xho頂每切 位点之间，且保持PWB980载体的其他序列不变得到的载体。
[0096] 二、重组菌的获得
[0097]分别将步骤一获得的无缝连接产物 pAbnA-CBP21、pAmyE-CBP21、pAspB-CBP21、 pBglC-CBP21、pBpr-CBP21、pCccA-CBP21、pSacB-CBP21、pYolA-CBP21、pnqB-CBP21、pNprE-CBP21、pPeI-CBP21、pEpr-CBP21、pAprE-CBP21 和载体pWB980 (对照菌）导入枯草芽胞杆菌 168中，分别得到如下重组芽胞杆菌：pAbnA-CBP21/168、pAmyE-CBP21/168、pAspB-CBP21 / 168、pBglC-CBP21/168、pBpr-CBP21/168、pCccA-CBP21/168、pSacB-CBP21/168、pYolA-CBP21/168、pYlqB-CBP21/168、pNprE-CBP21/168、pPel-CBP21/168、pEpr-CBP21/168、 pAprE-CBP21/168和pWB980载体/168,将上述重组菌30°C摇菌3h，并将菌液涂于卡那霉素抗 性平板。次日挑取单克隆，进行PCR验证，扩大培养后-80°C保存菌株。PCR验证引物：
[0098] PWB980-F：ATACTACCTTGCTG；
[0099] PWBgSOKATTCCCTATCTCGACTTC^PCR 验证结果如图 1 所示。其中，1-13:鉴定菌株 依次为含信号肽 Bpr、AspB、BglC、AmyE、AbnA、CccA、SacB、YolA、YlqB、Pel、AprE、Epr、NprE的 菌株;14:含空载体168菌株。
[0100] 三、CBP21蛋白在不同信号肽的重组芽胞杆菌的表达分析
[0101] 1、分别将经 PCR 验证正确的 pAbnA-CBP21 /168、pAmyE-CBP21 /168、pAspB-CBP21 / 168、pBglC-CBP21/168、pBpr-CBP21/168、pCccA-CBP21/168、pSacB-CBP21/168、pYolA-CBP21/168、pYlqB-CBP21/168、pNprE-CBP21/168、pPel-CBP21/168、pEpr-CBP21/168、 pAprE-CBP21/168和pWB980载体/168接种（接种量为1%)在SR培养基中，200rpm，30°C发酵 培养24h后，分别得到发酵液。并用丙酮沉淀发酵液，获得的蛋白质沉淀。丙酮沉淀蛋白质的 具体步骤如下：
[0102] (1)使用分光光度仪在波长0D600下，测发酵液浓度，取100D菌液12000rpm离心 5min，取上清，等体积加入丙酮，-20 °C沉淀20min;
[0103] (2) 12000rpm 离心 5min，弃上清，80yL PBS 重悬沉淀，再加入 20yL SDS Ioadingbuffer，100°C 沸水浴 5min。
[0104] 2、分别将蛋白质沉淀制成蛋白样品进行蛋白电泳，电泳结果如2所示，从图中可以 看出，在20KD处对应的蛋白条带为CBP21，13条泳道中，信号肽YlqB和Pel对应的CBP21的蛋 白量要显著高于其他信号肽对应的信号肽。说明由HqB和Pel引导的CBP21分泌量最高。
[0105] 四、CBP21与胶体几丁质结合实验
[0106] 取步骤三获得的发酵液上清进行CBP21蛋白与胶体几丁质结合实验。实验步骤如 下：
[0107] (1)取发酵液上清，测总蛋白浓度，再用PBS(pH7 · 4，是将0 · 24g磷酸二氢钾、1 · 44g 磷酸氢二钠、8. Og氯化钠和0.2g氯化钾加水至1000 mL混匀得到的）把总蛋白浓度调到100μ g/ml；
[0108] (2)将20(^1发酵液与20(^1的质量分数为3.1%的胶体几丁质混匀，得到反应体 系，反应体系中总蛋白浓度为50yg/m 1，胶体几丁质的浓度是5mg/m 1;
[0109] (3)将反应体系在37°C水浴锅静置，16h后取样，13000rpm离心3min，取上清；
[0110] (4)检测上清中剩余蛋白含量；
[0111] (5)每组设置3个平行，并设置空白对照组(PBS+0.5mg/ml胶体几丁质）、胶体几丁 质+空载上清、对照组(buffer+总蛋白定量后上清）。
[0112] (6)计算每个实验组结合蛋白的量。公式为:结合蛋白=总蛋白-游离蛋白-空载体 (空载总蛋白-空载游离蛋白）。总蛋白标准曲线的制定方法如下：用PBS缓冲液将胎牛血清 蛋白BSA(lmg/mL)稀释成不同浓度的溶液，将45yL各个溶液(BSA浓度分别为：20yg/mL、40y g/mL、60yg/mL、80yg/mL、IOOyg/mL、120yg/mL、140yg/mL、160yg/mL、180yg/mL、200yg/mL)分 别与855yL考马斯亮蓝溶液混匀，将试管室温静置lOmin，使用紫外分光光度计测定595nm波 长处吸光度。以吸光度值为横坐标，BSA的浓度为纵坐标，绘制标准曲线（图3)。
[0113]各信号肽对应的结合蛋白量的检测结果如图4所示，从图中可以看出，和其他信号 肽相比，信号肽YlqB和Pel引导分泌的溶解性多糖单加氧酶CBP21的量明显高于其他信号 肽。其中，信号肽HqB引导分泌的溶解性多糖单加氧酶CBP21的量是最高。
[0114] 实施例2、溶解性多糖单加氧酶CBP21在提高几丁质酶活性中的应用
[0115] 本发明测定了溶解性多糖单加氧酶CBP21对几丁质酶Chi92和一种来自于 Serratia marcescens的几丁质酶(购自sigma)，这两种酶分别来自于几丁质酶家族19和几 丁质酶家族18。
[0116] I、溶解性多糖单加氧酶CBP21的纯化
[0117]将实施例1中的信号肽YlqB引导分泌的溶解性多糖单加氧酶CBP21发酵液上清经 截流量为IOkDa的膜包50倍浓缩、脱盐和利用HiTrap Q XL阴离子柱纯化后，得到纯化后的 溶解性多糖单加氧酶CBP21。
[0118] 纯化具体步骤如下：
[0119] (1)溶液配制：
[0120] Tris-HCl溶液:0·5mol Tris-HCl溶于IL去离子水中。
[0121] 结合液:20mmol Tris_HCl，0.5mol NaCl，20mmol咪唑溶于IL去离子水中。
[0122] 洗脱液：20mmol Tris-HCl，0.5mol NaCl，0.5mol咪唑溶于IL去离子水中。
[0123] (2)超滤浓缩:20mL上清液过0.22um滤器转移至超滤柱，4 °C，4000rpm超滤上清液 Ih，得到ImL浓缩液；
[0124] (3) 5mL结合液注射进镍柱，以平衡柱内pH;
[0125] (4) ImL浓缩液注射器缓慢流进镍柱；
[0126] (5) IOmL结合液洗镍柱；
[0127] (6) ImL洗脱液洗脱，收集洗脱液；
[0128] (7) 20 %乙醇I OmL洗柱子，封柱，4 °C保存；
[0129] (8)洗脱液置于透析袋里，过夜4 °C透析；
[0130] 结果如图5所示，纯化后带His标签的CBP21蛋白的大小在20-21kDa之间。
[0131] 2、溶解性多糖单加氧酶促进几丁质酶活性
[0132] 溶解性多糖单加氧酶促进几丁质酶活性的测定采用DNS法，具体步骤如下：
[0133] (I)N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)标准曲线的制定
[0134] 用pH7.0、0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液将N-乙酰基葡萄糖配置成不同浓 度的溶液，将〇 · 5mL各个溶液(N-乙酰氨基葡萄糖含量分别为:5 · 5μπι〇1、7 · Ιμπιο?、8 · 3μπι〇1、 10. Ομπιο?、12.5μL?〇1、16.7μL?〇1)分别与Iml的DNS溶液混勾，沸水浴5min后显色，然后用蒸馏 水补齐至2.5mL，冷却至室温后，在波长540nm吸收光测定OD值，绘制成标准曲线，标准曲线 及曲线方程(图6)。
[0135] (2)实验分组及方法
[0136] 按照是否加入溶解性多糖单加氧酶CBP21分成如下实验组和对照组：
[0137] 实验组（Chitinase from Serratia marcescens):将250yL 1 ·0%底物与250yL IOOnM的CBP21纯品（步骤1中纯化后的溶解性多糖单加氧酶CBP21)，于37°C分别孵育0h、2h、 6h、12h、24h、48h、96h后，加入250yL 42nM酶液（Chitinase from Serratia marcescens)， 进行反应(3个平行），于37°C准确孵育Ih后，加入2mL DNS终止反应。100°C水浴5min，流水冷 却至室温;室温12000rpm离心5min，测定上清的0D540值。
[0138] 实验组(Chi92):将250yL 1.0%底物与250yL IOOnM的CBP21纯品（步骤1中纯化后 的溶解性多糖单加氧酶CBP21)，于37°C分别孵育他、211、611、1211、2411、4811、9611后，加入25(^1^ 42nM酶液(Chi92)，进行反应(3个平行），于37°C准确孵育Ih后，加入2mL DNS终止反应。100 °C水浴5min，流水冷却至室温;室温12000rpm离心5min，测定上清的0D540值。
[0139] 对照组：将250yL 1.0%底物与250yL PBS(不含CBP21)，于37°C分别孵育0h、2h、 6h、12h、24h、48h、96h后，加入250yL 42nM酶液，进行反应(3个平行），于37°C准确孵育Ih后， 加入2mL DNS终止反应。100°C水浴5min，流水冷却至室温；室温12000rpm离心5min，测定上 清的0D540值。
[0140]上述底物:质量分数为1 %的胶体几丁质。具体制备方法:准确称取IOg几丁质粉末 置于烧杯中，缓慢加入预冷的浓HCl 400mL，搅拌使其呈糊状，4°C静置24h;将其缓慢加入到 盛有2000mL乙醇:水（l:l，v/v)溶液的烧杯中，边加边使用磁力搅拌器搅拌，4°C静置24h;溶 液于4°C、12000rpm离心10min，弃上清；沉淀即胶体几丁质用蒸馏水冲洗、离心、冲洗至pH 7.0，最后用蒸馏水定容至1000 mL。置于4 °C冰箱保存。
[0141 ] 上述酶液:几丁质酶Chi92和来自于Serratia marcescens的几丁质酶。
[0142] 酶活定义:单位几丁质酶对底物作用单位时间，所产生的N-乙酰氨基葡萄糖的量 (mol);相对酶活:在相同时间点实验组(加 CBP21)和对照组(不加 CBP21)产生N-乙酰氨基葡 萄糖的比值。
[0143] 结果表明如图7所示:和不加入溶解性多糖单加氧酶CBP21的对照组相比，加入溶 解性多糖单加氧酶CBP21的实验组对几丁质酶Chi92和一种来自于Serratia marcescens的 几丁质酶的酶活均能产生极显著的促进作用，说明CBP21对几丁质酶酶促作用具有普适性。
【主权项】
1. 一种重组菌，为在枯草芽胞杆菌中通过源于枯草芽胞杆菌的信号肽引导溶解性多糖 单加氧酶CBP21的表达。2. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于:所述源于枯草芽胞杆菌的信号肽为信号 肽HqB或信号肽Pel; 所述信号肽HqB的氨基酸序列为序列9; 所述信号肽Pel的氨基酸序列为序列11。3. 根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于： 所述信号肽HqB的编码基因序列为序列22的第1-81位核苷酸分子； 所述信号肽Pel的编码基因序列为序列24的第1-63位核苷酸分子。4. 根据权利要求1-3中任一所述的重组菌，其特征在于:所述在枯草芽胞杆菌中通过源 于枯草芽胞杆菌的信号肽引导溶解性多糖单加氧酶CBP21的表达的方法为如下1)或2): 1) 将含有信号肽YlqB编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21编码基因的片段导入枯草 牙胞杆囷中； 2) 将含有信号肽Pel编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21编码基因的片段导入枯草 芽胞杆菌中。5. 根据权利要求1-4中任一所述的重组菌，其特征在于： 所述含有信号肽HqB编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21编码基因的片段的核苷酸 序列为序列22; 所述含有信号肽Pel编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21编码基因的片段的核苷酸 序列为序列24。6. 根据权利要求1-5中所述的重组菌，其特征在于:所述枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌 168〇7. 权利要求1-6中任一所述的含有信号肽YlqB编码基因和溶解性多糖单加氧酶CBP21 编码基因的片段或权利要求1-6中任一所述的含有信号肽Pel编码基因和溶解性多糖单加 氧酶CBP21编码基因的片段。8. 权利要求1-6中任一所述的重组菌或权利要求1-6中任一所述的信号肽YlqB或权利 要求1-6中任一所述的信号肽Pel在促进和/或提高几丁质酶活性中的应用。9. 权利要求1-6中任一所述的重组菌或权利要求1-6中任一所述的信号肽YlqB或权利 要求1-6中任一所述的信号肽Pel在提高溶解性多糖单加氧酶CBP21的分泌量中的应用； 或权利要求1 -6中任一所述的重组菌或权利要求1 -6中任一所述的信号肽Y1 qB或权利 要求1-6中任一所述的信号肽Pel在生产溶解性多糖单加氧酶CBP21中的应用。10. -种生产溶解性多糖单加氧酶CBP21的方法，包括如下步骤:发酵培养权利要求1-6 中任一所述的重组菌，得到所述溶解性多糖单加氧酶CBP21。
【文档编号】C12N1/21GK105861403SQ201610236250
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】周志刚, 李志敏, 潘兴亮, 杨雅麟, 柳学伟, 李娟 , 刘智, 徐俐
【申请人】中国农业科学院饲料研究所