发酵生产咖啡碱的工程菌、其构建方法及应用

发酵生产咖啡碱的工程菌、其构建方法及应用
【专利摘要】本发明提供一种发酵生产咖啡碱的工程菌，所述工程菌是通过将咖啡碱生物合成途径中的关键酶基因导入谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)构建而成的重组谷氨酸棒状杆菌。本发明通过过量表达咖啡碱合成途径中的关键酶基因，使谷氨酸棒状杆菌具备生产咖啡碱的能力，且产物咖啡碱能够大量分泌到胞外，分离纯化步骤少，咖啡碱的得率高，摇瓶发酵结果显示，咖啡碱的产量达3.75mg/L，表明该重组工程菌具有良好的工业应用前景，为利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产食品安全级咖啡碱奠定了理论基础。
【专利说明】
发酵生产咖啡碱的工程菌、其构建方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种发酵生产咖啡碱的 工程菌、其构建方法及应用。
【背景技术】
[0002] 咖啡碱即1，3，7-三甲基黄嘌呤，是风靡世界的三大软饮料植物（茶树、咖啡和可 可）中嘌呤碱的主体成份。研究发现，世界上至少60多种植物含有咖啡碱，含量比较高的有 茶（Camellia sinensis)2%_5%、咖啡豆（Coffea arabica) 1 %_2%、可可（Theabronma cacao)0.03%、苏丹可乐果（Cola acuminata)l .5%、爪拉拿泡林藤（Paullinia capana) 4% 以上、巴拉圭茶（Ilex paraguariensis)0 · 7%等。
[0003] 咖啡碱作为一种重要的植物次级代谢产物，具有抗菌、抵御生物入侵等生理作用， 对富含咖啡碱的植物的生长而言，咖啡碱是不可或缺的一种物质。同时，咖啡碱作为一种甲 基黄嘌呤衍生物，对人体的基本功能是对腺嘌呤受体的竞争性拮抗作用。咖啡碱对人体中 枢神经系统有较强的兴奋作用，适量摄入能够改善思维活动，振奋神经，消除和抵抗疲劳 等。咖啡碱还具有增强肌体免疫功能，解热镇痛，强心利尿等多种药理功能，因此被广泛用 于复方阿司匹林、复方感冒药等多种药品和多种可乐型饮料工业中，是贵重的药物原料和 饮料、食品添加剂。国际市场上咖啡碱的价格达到25美元/公斤左右，且供应市场主要为西 方少数大企业垄断控制。
[0004] 目前，市售咖啡碱的制备方法主要包括人工合成法、传统溶剂萃取法、升华法和沉 淀法及新技术柱层析、微波萃取和超临界流体萃取法等。其中化学合成方法最为常见，但存 在工艺繁琐、附加产物多，产品纯度低及毒害有机物质残留弊端，有些欧美国家在法律中明 文禁止将化学合成的咖啡碱添加到食品饮料中。超临界CO 2萃取法因具备良好的选择性、萃 取效率高、产品纯度高等优点而成为从茶叶中提取"天然咖啡碱"的主流技术。但是此方法 存在设备价格昂贵，生产成本相对较高等弊端。
[0005] 基于以上现状，采用生物工程技术手段，通过构建重组工程菌，利用微生物体外发 酵生产咖啡碱成为制备天然咖啡碱的发展趋势，具有广阔的应用前景。而使原本不具备咖 啡碱代谢途径的微生物能够大量合成咖啡碱，提高咖啡碱的产量，需要对受体菌的生物合 成途径进行改造。最常用的方法是将咖啡碱生物合成中关键酶基因连接到合适的表达载体 上，再导入到微生物中，使这些基因能够在微生物体内实现过量表达。
[0006] 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是呈短杆状的非致病土壤细菌， 具有过量合成多种氨基酸的能力，被称作食品级安全菌，其全基因组测序工作已完成。近年 来利用谷氨酸棒状杆菌来发酵生产已清楚合成路径的生化物质的成功案例越来越多。目前 为止，尚未发现任何利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产咖啡碱的报道。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的是提供一种发酵生产咖啡碱的工程菌，特别是一种产咖啡碱的重组 谷氨酸棒状杆菌工程菌。
[0008] 具体策略为通过在谷氨酸棒状杆菌中过表达咖啡碱生物合成核心途径中的关键 基因，实现利用工程菌发酵生产咖啡碱的目的。
[0009] 为了实现本发明目的，本发明提供的发酵生产咖啡碱的工程菌，所述工程菌是通 过将咖啡碱生物合成途径中的关键酶基因导入谷氨酸棒状杆菌构建而成的重组谷氨酸棒 状杆菌，所述关键酶基因包括CaXMT (7-黄嘌呤核苷甲基转移酶)基因、TCS1 (茶树咖啡碱合 成酶)基因、TAMPD(AMP脱氨酶)和TIDHaMP脱氢酶)基因。
[0010] 优选地，所述关键酶基因为来源于茶树的TCSl基因、TAMPD基因、TIDH基因和来源 于咖啡果的CaXMT基因。
[0011] 更优选地，通过将所述关键酶基因全部构建到同一穿梭表达载体PZ8-1上，然后导 入谷氨酸棒状杆菌(ATCC 13032)中得到重组菌。
[0012] 本发明还提供所述工程菌的构建方法，将咖啡碱生物合成途径中的关键酶基因构 建到原核表达载体上，然后导入谷氨酸棒状杆菌中，筛选阳性克隆。
[0013] 前述的方法，将CaXMT基因、TCSl基因、TAMH)基因和TIDH基因构建到同一穿梭表达 载体PZ8-1上，然后导入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中，筛选阳性克隆。
[0014] 在本发明的一个【具体实施方式】中，根据谷氨酸棒状杆菌的密码子使用频率，对全 部四个目的基因的序列进行密码子优化，再于目的基因序列前面各设计一段RBS序列。最终 构建得到含有启动子、核糖体结合位点(RBS序列）、操纵子和终止子四大表达元件以及优化 的全部四个目的基因序列的表达盒（SEQ ID NO: 1)，然后将上述表达盒连接到载体pZ8-l 上，然后导入谷氨酸棒状杆菌中得到重组菌。
[0015] 本发明进一步提供所述工程菌在发酵生产咖啡碱中的应用。
[0016] 所述应用是在发酵培养过程中，向发酵液中添加一定浓度的磷酸腺苷(AMP)，进行 发酵生产咖啡碱。
[0017] 所用发酵培养基配方为：（NH4)2S〇4 20g/L，K2HP〇4 lg/L，KH2P〇4 lg/L，MgS〇4.7H20 250mg/L，M0PS 42g/L，尿素5g/L，维生素 H 0 · 2mg/L，硫胺素500yg/L，微量元素0 · 2mg/L，葡 萄糖25g/L，pH值7.0-7.2。其中，微量元素的组成如下：FeS〇4 · 7H20 10g/L，MnS〇4 · 7H20 lOg/L,ZnSO4· 7H20 lg/L,CuSO4 0.2g/L,NiCl2· 6H2O 0.02g/L〇
[0018] 发酵条件为:250mL发酵罐内盛放50mL发酵液，于30 °C转速200rpm的条件下进行发 酵。
[0019]前述的应用，发酵培养Sh后，向发酵液中添加终浓度为O.Hmg/mL的磷酸腺苷(优 选lmg/mL)，继续振荡培养120h。采用超高效液相色谱(UPLC)定量测定发酵产生的咖啡碱。
[0020] 咖啡碱样品的制备：向4mL发酵液中加入等体积的乙酸乙酯或氯仿，充分振荡并静 置分层后，取有机层，30 °C真空离心干燥后，重悬于无菌水中，0.22μπτ2?|膜过滤后，滤液用于 UPLC检测分析。
[0021] 本发明通过过量表达咖啡碱合成途径中的关键酶基因，使谷氨酸棒状杆菌具备生 产咖啡碱的能力，且产物咖啡碱能够大量分泌到胞外，分离纯化步骤少，咖啡碱的得率高， 摇瓶发酵结果显示，咖啡碱的产量达到3.75mg/L，表明该重组工程菌具有良好的工业应用 前景，为利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产食品安全级咖啡碱奠定了理论基础。
【附图说明】
[0022]图1为本发明实施例1中构建的重组表达载体的质粒图谱。
[0023]图2为本发明实施例2中重组谷氨酸棒状杆菌工程菌的发酵液UPLC检测结果。
【具体实施方式】
[0024]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0025]以下实施例中所用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR试剂、In-f us ion试剂盒等 均购自TaKaRa生物公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自Axygen公司，大肠杆菌感受 态细胞trans T1、DNA marker均购自北京全式金生物科技有限公司。所用引物由通用生物 公司合成，全基因合成由南京金斯瑞生物科技公司完成。
[0026] 实施例1产咖啡碱的谷氨酸棒状杆菌重组工程菌的构建
[0027] 1、茶树咖啡碱生物合成途径中关键酶基因的克隆
[0028]本实施例中四个目的基因的原始序列来自于GenBank，其中基因 TAMPD登录号为 AB480359963,基因 TIDH 登录号为 AB156763654,基因 CaXMT 登录号为 AB048793,基因 TCSl 登 录号为AB031280。
[0029] 首先，为使插入的TAMPD、TIDH、CaXMT和TCSl基因能够在谷氨酸棒状杆菌中正常表 达，需构建含有启动子、核糖体结合位点(RBS序列）、操纵子和终止子四大表达元件的表达 盒。同时，根据谷氨酸棒状杆菌的密码子使用频率，对四个目的基因的序列进行密码子优 化，再于四个目的基因序列前面各设计一段RBS序列。
[0030] 此外，为了使其定向插入表达载体PZ8-1中，分别在TAMPD基因序列的5'端加入 EcoRI酶切位点，在TIDH基因序列的3 '端加入BamHI酶切位点，在CaXMT基因序列的5 '端前加 入新的Ptac启动子，Ptac序列的5'端加入BamHI酶切位点，在TCSl基因序列的3'端加入PstI 酶切位点。最后将优化后的基因片段交由南京金斯瑞生物科技公司人工合成。构建得到的 表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0031] 2、重组表达载体的构建
[0032] 纯化后的表达盒，利用T4DNA连接酶将其与经EcoRI和PstI消化处理的表达质粒 PZ8-1在16°C水浴条件下过夜连接，并将连接液转化至大肠杆菌感受态细胞trans Tl中，取 IOOyL转化液涂布于含有50yg/mL卡那霉素的LB平板上，37°C培养箱中培养10-12h，并通过 菌落PCR筛选阳性单克隆，得到的阳性单克隆送公司测序，进一步验证目的基因序列的正确 性，从而得到重组表达载体pZ8-TAMPD-TIDH-CaXMT-TCSl，质粒图谱如图1所示（即pZ8-A-B-C-D) 〇
[0033] 3、转化宿主及重组工程菌的筛选
[0034] 利用化学方法制备C.glutamicum ATCC 13032感受态细胞，并将上述重组表达质 粒电转化至C.glutamicum ATCC 13032感受态细胞中，取IOOyL转化液涂布于含有25yg/mL 卡那霉素的LB平板上，30°C培养箱中培养36-48h至长出单菌落，并通过菌落PCR筛选目的重 组菌株。同时，为了排除表达载体PZ8-1的干扰，将不含有目的基因的空质粒pZ8-l也电转入 ATCC 13032感受态细胞中作为对照组CK，最终成功构建得到重组工程菌C.glutamicum ATCC 13032/pZ8-TAMPD-TIDH-CaXMT-TCSl〇
[0035]实施例2重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产咖啡碱
[0036] 1、种子液的制备
[0037]所用种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH值7 · 0，121°C 高温灭菌20min。
[0038] 种子液的制备方法:挑取活化后的新鲜重组工程菌接种于含有25yg/mL卡那霉素 的种子培养基中，30°C，200rpm条件下振荡培养12h，即得种子液。
[0039] 2、重组谷氨酸棒状杆菌的发酵培养
[0040] 所用发酵培养基配方为：（NH4)2S〇4 20g/L，K2HP〇4 lg/L，KH2P〇4 lg/L，MgS〇4 · 7H20 250mg/L，M0PS 42g/L，尿素 5g/L，维生素 H 0 · 2mg/L，硫胺素 500yg/L，微量元素 0 · 2mg/L，葡 萄糖25g/L，pH值7.0-7.2。其中，微量元素的组成如下：FeS〇4 · 7H20 10g/L，MnS〇4 · 7H20 lOg/L,ZnSO4· 7H20 lg/L,CuSO4 0.2g/L,NiCl2· 6H2O 0.02g/L〇
[0041] 发酵条件为:将上述种子液在4°C，6000rpm条件下冷冻离心收集菌体沉淀，并将所 有菌体沉淀接入盛放有50mL发酵培养基的250mL发酵罐内，于30°C转速200rpm的条件下进 行发酵。
[0042]发酵培养8h后，即OD6(K)nm值为2.0-2.5时，向发酵液中添加终浓度为lmg/mL的磷酸 腺苷，继续振荡培养120h。
[0043]发酵结束后，采用超高效液相色谱(UPLC)定量测定发酵产生的咖啡碱。
[0044]咖啡碱样品的制备：向4mL发酵液中加入等体积的乙酸乙酯或氯仿，充分振荡并静 置分层后，取有机层，30 °C真空离心干燥后，重悬于无菌水中，0.22μπτ2?|膜过滤后，滤液用于 UPLC检测分析。
[0045] 仪器:Waters ACQUITY超高效液相色谱仪
[0046] 色谱柱：Phenomenex kinetex 2· 6μηι XB-C18 100A
[0047] 流动相:Α:0·2%乙酸水;Β:纯乙腈
[0048] 梯度洗脱条件：0-8min，A:98%-90% ;8-10min，A:90%-75% ; 10-11.5min;
[0049] A：75% ；11.5min-14min,75%-98% ；14min-18min,A：98%
[0050] 色谱条件:流速，0.4mL/min;柱温，30 °C ;进样量，IOyL;紫外检测波长，274nm。
[0051] 重组谷氨酸棒状杆菌工程菌的发酵液UPLC检测结果见图2。其中，标准品是指黄嘌 呤核苷、7-甲基黄嘌呤、可可碱和咖啡碱四种标准品的UPLC检测结果;样品组是指重组谷氨 酸棒状杆菌工程菌发酵液的UPLC检测结果；对照组1是指含有空载体pZ8-l的出发菌株 C. glutamicum ATCC 13032发酵液的UPLC检测结果；对照组2是指出发菌株C. glutamicum ATCC 13032发酵液的UPLC检测结果。
[0052]摇瓶发酵结果显示，重组工程菌中咖啡碱的产量达到3.75mg/L，而两个对照组菌 株在整个发酵过程中均检测不到咖啡碱的积累。本发明的重组谷氨酸棒状杆菌工程菌适合 用于大规模工业化发酵生产咖啡碱，具有良好的应用前景。
[0053]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 发酵生产咖啡碱的工程菌，其特征在于，所述工程菌是通过将咖啡碱生物合成途径 中的关键酶基因导入谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)构建而成的重组谷 氨酸棒状杆菌，所述关键酶基因包括CaXMT基因、TCS1基因、TAMH)基因和TIDH基因。2. 根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述关键酶基因为来源于茶树的TCS1基 因、TAMH)基因、TIDH基因和来源于咖啡果的CaXMT基因。3. 根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，其是将所述关键酶基因构建到同一 穿梭表达载体PZ8-1上，然后导入谷氨酸棒状杆菌中得到的重组菌。4. 根据权利要求1-3任一项所述的工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌为ATCC 13032。5. 权利要求1-4任一项所述工程菌的构建方法，其特征在于，将咖啡碱生物合成途径中 的关键酶基因构建到原核表达载体上，然后导入谷氨酸棒状杆菌中，筛选阳性克隆。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将CaXMT基因、TCS1基因、TAMPD基因和TIDH 基因构建到同一穿梭表达载体PZ8-1上，然后导入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中，筛选阳性 克隆。7. 权利要求1-4任一项所述工程菌在发酵生产咖啡碱中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在发酵培养过程中，向发酵液中添加一定 浓度的磷酸腺苷，进行发酵生产咖啡碱。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所用发酵培养基配方为：（NH4)2S〇4 20g/L， K2HP〇4 lg/L，KH2P〇4 lg/L，MgS〇4*7H20 250mg/L，M0PS 42g/L，尿素5g/L，维生素 H 0.2mg/ L，硫胺素 500yg/L，微量元素 0 · 2mg/L，葡萄糖 25g/L，pH值 7 · 0-7 · 2; 发酵条件为:250mL发酵罐内盛放50mL发酵液，于30 °C转速200rpm的条件下进行发酵。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，发酵培养8h后，向发酵液中添加终浓 度为0.1-lmg/mL的磷酸腺苷，继续振荡培养120h。
【文档编号】C12N15/77GK105861408SQ201610475914
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】张正竹, 李萌萌, 邓威威, 宁井铭, 邓骋
【申请人】安徽农业大学