一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用
【专利摘要】本发明公开了白介素?1β（IL?1β）优化的脐带间充质干细胞来源外泌体在治疗脓毒症中的应用，具体涉及用重组人的IL?1β优化处理人脐带间充质干细胞，使其免疫抑制功能增强，提取其产生的外泌体用于脓毒症的治疗。所述外泌体能有效缓解脓毒症症状，增加脓毒症小鼠的生存率，且这种外泌体还具有保存和运输方便的优势，这就为脓毒症等难治性炎症相关疾病的治疗提供了新的策略。
【专利说明】
一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及间充质干细胞来源的外泌体、外泌体的制备方法及其用途，具体是用IL-Ιβ优化处理后的间充质干细胞产生的外泌体在脓毒症治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]脓毒症(sepsis)—种严重的由感染引起的系统性炎症。其发病过程包括全身性的炎症爆发，伴随多器官功能障碍综合症、急性呼吸窘迫综合症和循环系统崩溃等，最终导致死亡。对这种疾病目前仍缺乏有效的治疗手段，其死亡率在重症病人中居高不下。自从2011年撤销Xygris和Eritoran的使用后，目前还没有针对脓毒症的有效药物。因此，急需开发新的有效的治疗手段。
[0003]间充质干细胞(MSCs)是一群具有多向分化潜能的多能干细胞，几乎存在于所有组织中。除了分化功能外，MSCs还具有显著的免疫调节功能、低免疫源性、易于在体外分离培养和迅速扩增的特性，这使得MSCs在免疫性和炎症性相关疾病的细胞治疗方面备受关注。然而，最近的研究发现，静息状态的MSCs免疫调节功能很弱，疗效欠佳;在炎症因子如IFN-T、TNF-a、IL-Ιβ和NO等的刺激活化后，MSCs能更加有效地发挥其免疫调节功能。因此，可以在体外培养过程中用炎症因子对MSCs进行优化处理，以提高MSCs的免疫调节功能，改善其治疗效果。
[0004]然而MSCs的临床应用仍面临着许多挑战，包括体外培养MSCs的不均一性、细胞注射导致的血管阻塞、细胞移植后在体内存活有限、衰老引起的遗传不稳定性或功能丧失等。更为严重的是MSCs用于临床还存在恶性转变及致瘤的可能性。鉴于这些结果，潜在的MSCs临床转化的选择应慎重考虑。
[0005]值得关注的是，MSCs在静息或活化状态下能分泌大量的外泌体(exosome)，这些外泌体携带了MSCs的重要信号分子，如蛋白质、mRNAs、miRNAs和ncRNAs等，参与细胞间的通讯并调控细胞功能。许多研究证实MSCs来源的外泌体保持着与其母细胞相似的生物学功能。而外泌体的的直径足够小(30-150nm)，不仅可以快速通过毛细血管到达病损部位，还可以透过血脑屏障等其他屏障，其作用范围将比细胞更加广泛;且外泌体具有便于储存和运输的优势。同时也避免了直接注射MSCs的不利生物学效应，减少了临床风险。
[0006]我们首次提取了用IL-Ιβ优化的MSCs产生的外泌体，应用于小鼠脓毒症的治疗中，取得了良好的治疗效果。与传统的细胞治疗相比，外泌体具有稳定性好、保存及应用方便快捷的特点。与静息状态MSCs来源的外泌体(MSC-exo)相比，IL-1 β优化的MSCs来源外泌体(βMSC-exo)的治疗效果更强。
【发明内容】
[0007]本发明提供一种IL-Ιβ优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体(MSC-exo)、该外泌体的制备方法及其在治疗脓毒症中的应用。这种外泌体能有效增加脓毒症模型小鼠的生存率，加强体内细菌清除率，降低全身炎症反应，缓解组织器官损伤的作用。
[0008]本发明所述外泌体来源于体外优化的脐带间充质干细胞，并经过一定方法提取，可以在-80度冰箱中长期保持活性(至少I年)。
[0009]制备间充质干细胞之后，将间充质干细胞按以下方法进行IL-Ιβ的优化:取第3-7代的间充质干细胞接种于1cm培养皿中，待细胞融合达到60-70 %时，加10ng/ml重组人IL-1β(美国PeproTech公司)处理12-24小时。用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞两次，更换含无外泌体胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养48-72小时，无菌收集培养上清，用于提取外泌体。
[0010]所述的外泌体按以下方法制备而得:将收集的培养上清于4°C、2，000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片；小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4°C、10，000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒;小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4°C、110，OOOg超速离心70分钟，小心弃去上清，再加注射用生理盐水清洗一次，于4°C、110，OOOg超速离心70分钟，得到的沉淀即为外泌体。根据最初收集的培养基的体积不同，酌情加入注射用生理盐水重悬，用Bradf ord试剂盒检测总蛋白浓度，-80 °C分装保存。
[0011]所述的外泌体表达标志性蛋白⑶63和Alix，平均直径在10nm左右，透射电镜下观察到的形态都符合外泌体的特征。
[0012]本发明通过细胞实验证明:通过IL-Ιβ优化的间充质干细胞(MSCs)比静息状态的间充质干细胞(MSCs)免疫抑制功能更强，更有效地抑制T细胞增殖和活化，抑制巨噬细胞炎性因子TNF-α的分泌，而促进抗炎因子IL-10的分泌。
[0013]进一步地，本发明首次证明MSCs来源外泌体(MSC-exo)比MSCs来源外泌体(MSC-exo) 的免疫抑制功能更强 ，表现为更有效地抑制T 细胞增殖和活化 ，抑制巨噬细胞炎性因子TNF-α的分泌，而促进抗炎因子IL-10的分泌。
[0014]盲肠结扎穿刺(CLP)诱导的小动物脓毒症症状比较接近临床病患的症状，该模型被认为是最经典的脓毒症模型，已被延用了超过20年。因此，我们采用此方法构建小鼠脓毒症模型，通过尾静脉注射MSC-exo和MSC-exo，观察外泌体对脓毒症症状的改善作用。
[0015]本发明首次通过动物实验证明:MSC-exo比MSC-exo更有效地增加脓毒症小鼠的生存率、加强体内细菌清除率、降低全身炎症反应并缓解肝脏和肺组织的损伤。
[0016]本发明的有益效果是:
[0017]1.本发明用IL-Ιβ对MSCs进行优化处理，使MSCs的免疫抑制功能增强，从而得到的外泌体(MSC-exo)比静息状态的MSCs外泌体(MSC-exo)的免疫抑制功能更强，对小鼠脓毒症的治疗效果更佳:MSC-exo比MSC-exo更有效地增加脓毒症小鼠的生存率、加强体内细菌清除率、降低全身炎症反应并缓解肝脏和肺组织的损伤。因此，PMSC-exo在脓毒症等炎症相关疾病的临床治疗领域具有非常可观的应用前景。
[0018]2.与传统的细胞治疗相比，本发明提供的外泌体可在-80度长期保存(至少I年)，溶解后即可使用，避免了 MSCs冻存和复苏的不便，以及可能造成细胞活力和功能改变的风险。
[0019]3.本发明制备的间充质干细胞外泌体原料是脐带，脐带的采集为无创性操作且属于废弃物再利用，不涉及法律伦理等问题，脐带数量充足、来源广泛，可以进行规模化生产。【附图说明】:
[0020]图1为IL-Ιβ处理不影响MSCs的形态。
[0021]图2为IL-Ιβ处理不影响MSCs的表面标志:灰色为MSCs，黑色为MSCs。
[0022]图3为IL-Ιβ处理不影响MSCs的成骨和成脂分化能力:上图中被染成红褐色的为成骨细胞，下图中被染成橘红色的为脂肪细胞。
[0023]图4为IL-Ιβ处理增强了MSCs对T细胞增殖和活化的抑制作用:(A)T细胞增殖；(B)T细胞表面活化标志⑶69; (C)T细胞内活化标志IFN- γ。
[0024]图5为IL-Ιβ处理增强了MSCs对巨噬细胞的抑制作用:(A)炎性因子TNF-α的分泌水平；(B)抗炎因子IL-10的分泌水平。
[0025]图6为两种外泌体PMSCs-exo和MSCs-exo的鉴定:(A)western-blot检测外泌体标志蛋白⑶63和Alix ； (B)透射电镜观察外泌体的形态，标尺为10nm； (C)外泌体粒径分布图。
[0026]图7为两种外泌体MSCs-exo和MSCs-exo对小鼠脾脏T细胞的抑制作用:(A)T细胞表面活化标志⑶69; (B)T细胞内活化标志IFN- γ。
[0027]图8为两种外泌体mSCs-exo和MSCs-exo对小鼠骨髓诱导的巨噬细胞的抑制作用:(A)炎性因子TNF-a的分泌水平；(B)抗炎因子IL-10的分泌水平。
[0028]图9为两种外泌体MSCs-exo和MSCs-exo对脓毒症小鼠的生存率的影响。
[0029]图10为两种外泌体MSCs-exo和MSCs-exo对脓毒症小鼠体内细菌清除率的比较:(A)细菌培养图片；(B)菌落数的统计图。
[0030]图11为两种外泌体0MSCs-exo和MSCs-exo对脓毒症小鼠血清中炎症因子和炎因子的影响:血清中炎症因子TNF-a(A)和IL-6⑶的水平；(C)血清中抗炎因子IL-10的水平。[0031 ] 图12为两种外泌体01308-610和1308-610对胺毒症小鼠血清中肝脏和肾脏功能相关生化指标的影响:血清谷丙转氨酶(A)、谷草转氨酶(B)和肌酐(C)的水平。
[0032]图13为两种外泌体MSCs-exo和MSCs-exo对脓毒症小鼠肝脏和肺脏组织损伤的影响:HE染色观察两种脏器的组织损伤情况。
具体实施例:
[0033]实施例1用IL-Ιβ对脐带间充质干细胞进行优化
[0034]1.分离培养人脐带间充质干细胞(MSCs)(实验室所用的试剂耗材均经过无菌处理)
[0035]经产妇知情同意，采集正常足月妊娠剖宫产胎儿的脐带。脐带采集之前产妇需经过严格的病原体检测，包括梅毒螺旋体、艾滋病病毒、巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒和支原体等微生物，确认安全后使用。
[0036]剪取近胎盘端脐带20-30cm，置于4°C预冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中保存，4小时内使用。在超净工作台内，将脐带剪成5cm左右的小段，用PBS洗净脐带表面残余的血液；剥离脐动脉和脐静脉后，置于含0.01%青霉素和链霉素(购于Sigma公司)的DMEM/F12培养基(购于Gibco公司，下同)中，用手术剪刀剪成2mm3左右的组织块；将剪碎的组织转移到50ml离心管中，4°C、300g离心，小心弃去上层培养基，加入与组织等体积的混合消化酶，置于37°C摇床中，200rpm振荡，消化1.5-2小时；其中混合消化酶含Π型胶原酶2mg/ml (购于Sigma公司)，中性蛋白酶0.8mg/ml (购于Amresco公司)，透明质酸酶0.03mg/ml (购于Sigma公司)，用DMEM/F12培养基配置。将消化后的组织液于4°C、400g离心10分钟，小心弃去上清；用PBS洗两次，每次4°C、400g离心10分钟，弃上清;最后将沉淀重悬于含有12%胎牛血清(购于Gibco公司，下同)的DMEM/F12培养基中，铺入T-25培养瓶(Corning公司)，在37°C、5%C02培养箱中培养。3天后，弃去未贴壁的细胞与组织，加入新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM/Fl2培养基。待细胞长至80 %融合度时(约7天)，用0.25 %胰酶(购于Gibco公司)消化，传代至1cm培养皿(Corning公司，下同)中继续扩增培养，并记为第I代。以后每三到四天换液或消化后传代培养，每传代一次记为一代。
[0037]2.用 IL-Ιβ优化处理MSCs
[0038]取第3-7代的MSCs接种于1cm培养皿中，待细胞融合达到60-70%时，加入重组人IL-Ιβ(购于P印roTech公司)，使得终浓度为10ng/ml，处理12-24小时。用PBS清洗细胞两次，更换含无外泌体牛血清的DMEM/F12培养基继续培养48-72小时。其中无外泌体的牛血清是通过100，000g超速离心18小时后去除沉淀的牛血清。无菌收集培养上清备用。
[0039]3.1L-Ιβ优化处理的MSCs表型及分化功能鉴定
[0040]取上述IL-Ιβ优化处理的MSCs (MSCs)进行表型鉴定。在倒置显微镜下观察MSCs的形态及贴壁性，如图1所示，IL-Ιβ刺激后的MSCs仍保持良好的贴壁性，且形态不变，呈长梭形，涡旋状排列。分别收集MSCs和i3MSCs，用PBS洗两次，分成每管4 X 15个细胞，分别加入抗人CD29-PE、CD44-PE、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CDllb-PE、CD14-PE、CD19-APC、CD31-PE 和 HLA-DR-PE 抗体，以及 FITC-mouse-1gGl、PE-mouse-1gGl 和 APC-mouse-1gGl 同型对照抗体(所有抗体全部购于eB1science公司)，4°C避光孵育30分钟，PBS洗两次，流式细胞术检测细胞表面标志。如图2所示，PMSCs和MSCs均阳性表达CD29、CD44、CD73、CD90和0)105，阴性表达0)1113、0)14、0)19、0)31和!11^-01?。
[0041]MSCs和mSCs的成骨和成脂分化鉴定采用Gibco公司的成骨和成脂分化试剂盒，货号分别是A10072-01和A10070-01，实验操作按说明书进行。实验结果如图3所示，成骨细胞被茜素红染成红棕色，脂肪细胞被油红O染成橘黄色，i3MSCs与MSCs的成骨和成脂分化能力没有显著差异。
[0042]4.1L-Ιβ优化处理的MSCs的免疫抑制功能分析
[0043]本实验中获取T细胞和骨髓巨噬细胞所用的C57BL/6小鼠，雄性，6?8周龄，购于南京大学模式动物研究所。
[0044]对T细胞的抑制作用:
[0045]用美天旎公司的小鼠总T细胞磁珠分选试剂盒分选得到小鼠脾脏T细胞，铺于96孔培养板(购于Corning公司)中，每孔2 X 15个细胞，总体积200μ1。将MSCs与静息MSCs分别与T细胞共培，MSCs与T细胞的数量比为l:10，同时加入刀豆蛋白A(COnA，终浓度5μg/ml，下同)刺激48小时，收集T细胞，加入[3H]后继续培养8小时，液闪计数检测细胞增殖情况。结果如图4Α所示，IL-Ιβ优化处理的MSCs更有效地抑φ?」Τ细胞增殖。另外，在与上述同样的MSCs与T细胞的共培体系中，于收集细胞前4小时加入终浓度10yg/ml的细胞内蛋白转运抑制剂Brefeldin A(BFA，购于ENZO公司)，收集T细胞，流式细胞术检测T细胞内IFN-γ和细胞表面CD69的蛋白水平，结果如图48和(:所示，MSCs比MSCs更有效地抑φ?」Τ细胞内IFN-γ和细胞表面CD69的蛋白水平。
[0046]对巨噬细胞的抑制作用:
[0047]分离小鼠骨髓细胞，用含10%胎牛血清、25ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，购于PeproTech公司)的1640培养基(购于Gibco公司)诱导4天，得到巨噬细胞(BMDMs )。BMDMs铺于24孔培养板(购于Corning公司)中，每孔2.5 X 15个细胞，总体积500μ1。将MSCs与静息MSCs分别与BMDMs以1:1O的比例共培，LPS (终浓度100ng/ml)刺激24小时后，收集培养上清，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测培养上清中炎症因子TNF-α和抗炎因子IL-10的蛋白水平。所用的小鼠TNF-α和IL-10ELISA试剂盒购于B1legend公司。结果如图5所示，MSCs比MSCs更有效地抑制TNF-a的水平，而促进IL-10的水平。
[0048]本实施例中获取间充质干细胞的原料是脐带，脐带的采集为无创性操作且属于废弃物再利用，不涉及法律伦理等问题，脐带数量充足、来源广泛，可以进行规模化生产。该实施例结果表明，经过IL-Ιβ处理之后，间充质干细胞的基本形状包括形态、表面标志和分化功能没有改变，而其免疫抑制功能显著增强。
[0049]实施例2 IL-Ιβ优化的间充质干细胞外泌体(MSC-exo)与静息状态的间充质干细胞外泌体(MSC-exo)的提取与鉴定
[0050]1.0MSC-exo 及 MSC-exo 的提取
[0051 ]分别收集MSCs与静息MSCs的细胞培养上清于500ml无菌离心瓶或50ml聚丙烯离心管中(购于Beckman公司)，于4°C、2000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片。小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4°C、10，000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒。小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4°C、110，000g(Beckman超速离心机)超速离心70分钟，小心弃去上清，再加注射用生理盐水清洗一次，于4°C、110，000g超速离心70分钟，得到的沉淀即为外泌体。根据最初收集的培养基的体积不同，酌情加入小体积的注射用生理盐水重悬，用Bradf ord试剂盒(购于Thermo公司)检测总蛋白浓度后，-80°C分装保存。
[0052]2.MSC-exo 及 MSC-exo 的鉴定
[0053]用western-blot法分析两种外泌体的标志性蛋白:加适量的蛋白裂解液裂解外泌体沉淀，充分漩涡震荡；测定蛋白质浓度后，每个样取20yg，加5 X SDS上样缓冲液，99 °C金属浴中加热10-15分钟；12，OOOg离心5分钟;上样，做10 % SDS-PAGE ； 100V转膜70分钟，5 %脱脂牛奶封闭I小时；分别加入抗⑶63和Alix的一抗(用TBS按1: 500稀释，购于Santa Cruz公司)，4°C孵育过夜;TBST洗膜5分钟X4次，加相应二抗，室温孵育1.5小时;TBST洗膜5分钟X4次，加ECL发光液(购于Millipore公司)，通过化学发光凝胶成像系统成像拍照。结果如图6A所示，CD63和Al ix在MSCs和MSCs来源的两种外泌体中均有表达。
[0054]用透射电镜观察两种外泌体的形态:将两种外泌体各自充分混匀，分别吸取20μ1滴到直径2mm的载样铜网上，室温静置5分钟，用滤纸小心吸掉多余液体。滴加醋酸双氧铀负染2分钟，用滤纸吸掉多余液体，在白炽灯下烘干;透射电镜80-120kv成像并拍照。结果如图6B所示，可见直径为I OOnm左右的圆形囊泡状结构。
[0055]外泌体粒径检测:将两种外泌体送公司检测粒径分布，所用仪器是qNano(新西兰Izon science公司)。结果如图60所示，MSC-exo的粒径为92 ± 34.lnm，0MSC_exo的粒径为106±45nm。
[0056]该实施例结果说明，用差速离心法成功获取MSCs和MSCs来源的外泌体，它们都表达标志性蛋白⑶63和Al ix，平均直径在10nm左右，透射电镜下观察到的形态都符合外泌体的特征。
[0057]实施例3 IL-Ιβ优化的间充质干细胞外泌体(MSC-exo)与静息状态的间充质干细胞外泌体(MSC-exo)对体外培养的T细胞和巨噬细胞的抑制作用
[0058]1.对T细胞的抑制作用
[0059]小鼠脾脏T细胞的获取和处理方法同实施例1。将mSC-exo和MSC-exo分别加入T细胞中，外泌体终浓度为10yg/ml。同时加入5yg/ml ConA刺激48小时，于收集细胞前4小时加入细胞内蛋白转运抑制剂BFA，收集T细胞，流式细胞术检测T细胞内IFN- γ和细胞表面CD69的蛋白水平。结果如图7所示，MSC-exo比MSC-exo更有效地抑制IFN- γ和⑶69的蛋白水平。
[0060]2.对巨噬细胞的抑制作用
[0061 ] 小鼠骨髓巨噬细胞BMDMs的获取和处理方法同实施例1。将MSC-exo和MSC-exo分别加入BMDMs中，外泌体终浓度为10yg/ml。1^3(终浓度100ng/ml)刺激24小时后，收集培养上清，ELI SA法检测培养上清中炎症因子TNF-α和抗炎因子IL-10的蛋白水平。结果如图8所示，MSC-exo比MSC-exo更有效地抑制TNF-α的水平，而促进IL-10的水平。
[0062]该实施例结果表明，外泌体与其母细胞-MSCs的功能类似，具有免疫抑制作用，且βMSC-exo比MSC-exo的免疫抑制功能更强。值得注意的是，根据现有文献报道，外泌体可以在-80度保存，至少I年保持活性不变，溶解后即可使用。这就避免了传统细胞治疗所用的MSCs冻存和复苏的不便，以及由此带来的细胞活力和功能改变的风险。
[0063]实施例4 IL-Ιβ优化的间充质干细胞外泌体(MSC-exo)与静息状态的间充质干细胞外泌体(MSC-exo)对小鼠脓毒症的治疗作用
[0064]实验所用C57BL/6小鼠，雄性，8?10周龄，购于南京大学模式动物研究所。
[0065]参照DanielRittirsch等的方法(Daniel Rittirsch et al.1mmunodesign ofexperimental sepsis by cecal ligat1n and puncture,Nat Protoc.2009；4(I):31-6)，用盲肠结扎穿刺(CLP)的方法诱导小鼠重度脓毒症模型。实验分组:假手术组:除了不进行结扎穿刺外，其余操作同模型组;模型组:CLP手术后4小时尾静脉注射150μ1无菌生理盐水;mSC-exo治疗组:CLP手术后4小时尾静脉注射30ygmSC-exo(溶于150μ1无菌生理盐水中)；MSC-exo治疗组:同样方法注射30yg MSC-exo。
[0066]1.小鼠生存率观察
[0067]CLP手术后每隔12小时观察小鼠生存状况，记录死亡情况，连续观察7天。采用GraphPad软件绘制生存曲线。结果如图9所示，与Daniel Rittirsch等报道的结果一致，假手术组小鼠全部存活，而模型组小鼠在4天内全部死亡。MSC-exo治疗组小鼠生存率为69.2%，MSC-exo治疗组生存率为33.3%，可见mSC_exo能更有效地增加脓毒症小鼠的生存率。
[0068]2.血液及腹腔灌洗液细菌培养及计数
[0069]血液细菌培养及菌落计数:CLP手术48小时后，小鼠眼球取血，滴于1.5ml无菌EP管中，立刻吸取5μ1血，加入145μ1无菌PBS中，混匀后涂布于血琼脂平板中。平板倒置于37°C细菌培养箱中，培养12小时，拍照，计算细菌集落数。腹腔灌洗液细菌培养及菌落计数:将处死的小鼠置于超净工作台内，用注射器吸取5ml无菌PBS打入腹腔，轻轻揉捏腹部2分钟，吸出灌洗液。吸取5μ1血，加入145μ1无菌I3BS中，混匀后涂布于普通LB营养平板中。平板倒置于37°C细菌培养箱中，培养过夜，拍照，计算细菌集落数。结果如图10所示，MSC-exo治疗组比MSC-exo治疗组更有效地清除腹腔和血清中的细菌。
[0070]3.血清细胞因子及肝肾功能相关生化指标检测
[0071 ] CLP手术48小时后，小鼠眼球取血，滴于1.5ml无菌EP管中，室温静置I小时后3000rpm、20 °C离心10分钟，吸取血清置于无菌EP管中。用ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6和IL-10的浓度。结果如图11所示，MSC-exo治疗组比MSC-exo治疗组更有效地降低血清中炎症因子TNF-a(A)和IL-6(B)的水平，促进抗炎因子IL-10的水平(C)。另外，血清送至江苏省药物研究所检测肌酐、谷丙转氨酶和谷草转氨酶的浓度。结果如图12所示，MSC-exo比MSC-exo 更有效地降低血清谷丙转氨酶 (A)、谷草转氨酶 (B) 和肌酐 (C) 的水平。
[0072]4.小鼠肝肺组织HE染色
[0073]采血后断颈处死小鼠，迅速摘取肝脏和肺，肝脏切取约I X Icm左右大小，肺取一叶，置于含4%多聚甲醛的EP管中固定过夜，送至南京市鼓楼医院病理科做HE染色。结果如图13所示，模型组小鼠的肝组织出现明显的组织松散、水肿和脂肪变性，肺组织出现充血和肺泡间隔增厚的现象，MSC-exo比MSC-exo更有效地改善这些病变。
[OO74 ]该实施例结果表明，MSC-e XO对小鼠脓毒症的治疗作用显著优于MSC-e XO，主要表现为MSC-exo比MSC-exo更有效地增加脓毒症小鼠的生存率、加强体内细菌清除率、降低全身炎症反应并缓解肝脏和肺组织的损伤。
[0075]统计学分析
[0076]统计数据以平均值土标准误的形式给出，用GraphPad Prism 5软件(美国圣地亚哥)进行统计分析并作图，组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用t-test，p〈0.05为具有显著差异，*P〈0.05，**p〈0.001, ***p〈0.0001。实验结果均重复三次以上。
【主权项】
1.一种外泌体，其特征为:所述外泌体为IL-Ιβ优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体。2.如权利要求1所述的外泌体，其特征为所述外泌体由以下方法制备: (1)分离培养人脐带间充质干细胞； (2)用IL-Ιβ优化处理人脐带间充质干细胞； (3)收集步骤(2)中的培养基上清液，用差速离心的方法收集外泌体即得到IL-1M尤化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体。3.如权利要求1所述的外泌体，其特征为所述外泌体由以下方法制备: (1)分离培养人脐带间充质干细胞:采集正常足月妊娠剖宫产胎儿的脐带，剪取近胎盘端脐带20-30cm，置于4°C预冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中保存，4小时内使用;在超净工作台内，将脐带剪成5cm左右的小段，用PBS洗净脐带表面残余的血液；剥离脐动脉和脐静脉后，置于含0.0l %青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基中，用手术剪刀剪成2mm3左右的组织块;将剪碎的组织转移到50ml离心管中，4°C、300g离心，小心弃去上层培养基，加入与组织等体积的混合消化酶，置于37°C摇床中，200rpm振荡，消化1.5_2小时；其中混合消化酶含Π型胶原酶2mg/ml，中性蛋白酶0.8mg/ml，透明质酸酶0.03mg/ml，用DMEM/F12培养基配置;将消化后的组织液于4°C、400g离心10分钟，小心弃去上清；用PBS洗两次，每次4°C、400g离心10分钟，弃上清;最后将沉淀重悬于含有12%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基中，铺入T-25培养瓶，在37 °C,5% C02培养箱中培养;3天后，弃去未贴壁的细胞与组织，加入新鲜的含有10 %FBS的DMEM/F12培养基;待细胞长至80 %融合度时，用0.25 %胰酶消化，传代至1cm培养皿中继续扩增培养，并记为第I代。以后每三到四天换液或消化后传代培养，每传代一次记为一代。 (2)用IL-Ιβ优化处理人脐带间充质干细胞:取第3-7代的间充质干细胞(MSCs)接种于1cm培养皿中，待细胞融合达到60-70 %时，加入重组人IL-Ιβ，使得终浓度为10ng/ml，处理12-24小时；用I3BS清洗细胞两次，更换含10%无外泌体FBS的DMEM/F12培养基继续培养48-72小时。其中无外泌体的FBS是通过100，000g超速离心18小时后去除沉淀的FBS; (3)收集步骤(2)中的培养基上清液，用差速离心的方法收集外泌体:无菌收集步骤(2)中最后一步所得的培养基上清液于500ml无菌离心瓶或50ml聚丙稀离心管中，于4°C、2000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片；小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4°C、10，000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒;小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4°C、110，OOOg超速离心70分钟，小心弃去上清，再加注射用生理盐水清洗一次，于4°C、110，OOOg超速离心70分钟，得到的沉淀即为IL-Ιβ优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体。用生理盐水重悬外泌体，测定蛋白浓度后-80 °C分装保存。4.一种外泌体的制备方法，其特征为步骤如下: (1)分离培养人脐带间充质干细胞； (2)用IL-Ιβ优化处理人脐带间充质干细胞； (3)收集步骤(2)中的培养基上清液，用差速离心的方法收集外泌体即得到IL-1M尤化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体。5.如权利要求4所述的一种外泌体的制备方法，其特征为步骤如下: (I)分离培养人脐带间充质干细胞:采集正常足月妊娠剖宫产胎儿的脐带，剪取近胎盘端脐带20-30cm，置于4°C预冷的无菌PBS中保存，4小时内使用;在超净工作台内，将脐带剪成5cm左右的小段，用PBS洗净脐带表面残余的血液;剥离脐动脉和脐静脉后，置于0.0l %青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基中，用手术剪刀剪成2mm3左右的组织块;将剪碎的组织转移到50ml离心管中，4°C、300g离心，小心弃去上层培养基，加入与组织等体积的混合消化酶，置于37°C摇床中，200rpm振荡，消化1.5_2小时；其中混合消化酶含Π型胶原酶2mg/ml，中性蛋白酶0.8mg/ml，透明质酸酶0.03mg/ml，用DMEM/F12培养基配置;将消化后的组织液于4°C、400g离心10分钟，小心弃去上清；用I3BS洗两次，每次4°C、400g离心10分钟，弃上清；最后将沉淀重悬于含有12%FBS的DMEM/F12培养基中，铺入T-25培养瓶，在37°C、5%C02培养箱中培养；3天后，弃去未贴壁的细胞与组织，加入新鲜的含有10%FBS的DMEM/F12培养基;待细胞长至80 %融合度时，用0.25 %胰酶消化，传代至1cm培养皿中继续扩增培养，并记为第I代。以后每三到四天换液或消化后传代培养，每传代一次记为一代。 (2)用IL-Ιβ优化处理人脐带间充质干细胞:取第3-7代的MSCs接种于1cm培养皿中，待细胞融合达到60-70 %时，加入重组人IL-Ιβ，使得终浓度为10ng/ml，处理12-24小时；用PBS清洗细胞两次，更换含无外泌体FBS的DMEM/F12培养基继续培养48-72小时，其中无外泌体的FBS是通过100，000g超速离心18小时后去除沉淀的FBS。 (3)收集步骤(2)中的培养基上清液，用差速离心的方法收集外泌体:无菌收集步骤(2)中最后一步所得的培养基上清液于500ml无菌离心瓶或50ml聚丙稀离心管中，于4°C、2000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片；小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4°C、10，000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒;小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4°C、110，OOOg超速离心70分钟，小心弃去上清，再加注射用生理盐水清洗一次，于4°C、110，OOOg超速离心70分钟，得到的沉淀即为IL-Ιβ优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体。用生理盐水重悬外泌体，测定蛋白浓度后-80 °C分装保存。6.权利要求1-3任意一项所述的外泌体在制备治疗脓毒症的药物或者制剂中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述外泌体通过增加脓毒症体内细菌清除率、降低全身炎症反应并缓解肝脏和肺组织的损伤达到治疗脓毒症的目的，从而实现在制备治疗脓毒症的药物或者制剂中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的外泌体溶解在注射用生理盐水中制成针剂使用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的外泌体的给药方式为静脉注射。10.权利要求1-3任意一项所述的外泌体在制备免疫抑制药物或者制剂中的应用。
【文档编号】A61P31/04GK105861430SQ201610279473
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】侯亚义, 宋玉仙, 窦环, 泥艳红, 樊竑冶, 赵晓寅
【申请人】南京大学