DoxA蛋白突变体及其编码基因与应用

DoxA蛋白突变体及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明公开了DoxA蛋白突变体及其编码基因与应用。本发明公开一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。本发明公开的表阿霉素高产菌可高效表达表阿霉素，其发酵液的表阿霉素效价达到102.0μg/ml。本发明在生物工程制药技术领域具有很好的应用前景。
【专利说明】
DoxA蛋白突变体及其编码基因与应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物工程制药技术领域，具体涉及DoxA蛋白突变体及其编码基因与应 用。
【背景技术】
[0002] 蒽环类抗肿瘤药物可广泛用于治疗白血病、乳腺癌、胃癌、肠癌等恶性肿瘤疾病， 是临床上的大品种药物。其中表阿霉素由于活性高、毒性小，因此得到了更广泛的临床应 用。
[0003] 目前表阿霉素是通过半合成方法生产的。然而化学合成过程复杂，成本高，反应条 件要求严格;同时生产过程中大量使用化学溶剂，容易对环境造成污染。因此寻求微生物发 酵这种绿色生产工艺来生产表阿霉素受到广泛关注。美国威斯康辛大学的研究人员在1998 年报道应用组合生物学的方法，将阿霉素产生菌ATCC29050的酮基还原酶基因 dnmV替换成 avrE后，成功构建了产表柔红霉素和表阿霉素（图1)的基因工程菌株，但是只有微量的表阿 霉素，代谢产物主要是其前体表柔红霉素。专利US20100255543A1用evaE替换dnmV后，表柔 红霉素效价相比avrE的替换菌株效价提高了近2倍，达到173μg/ml，但是没有表阿霉素产 生。上海医药工业研究院的朱宝泉在2006年对天蓝淡红链霉菌进行了相应的基因工程改 造，发酵可以得到少量表柔红霉素。专利US20100143977A1披露了一种基因工程改造方法， 可以通过链霉菌发酵得到700μg/ml表柔红霉素。
[0004] 综上所述，目前可以通过菌株的遗传改造得到表柔红霉素的高产菌株，但是却只 有微量的表阿霉素产生。表柔红霉素经过DoxA催化后得到表阿霉素，因此筛选高活性的 doxA突变体成为解决这一问题的关键。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是制备表阿霉素并提高表阿霉素产量。
[0006] 为了解决以上技术问题，本发明提供一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.16所 示；
[0007] 所述蛋白为DoxA蛋白突变体，可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表 达得到。
[0008] 为了解决以上技术问题，本发明还提供与所述蛋白相关的生物材料，为如下BI)或 B2)：
[0009] BI)编码所述蛋白的核酸分子；
[0010] B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
[0011] 其中，B1)所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等；
[0012] B2)所述的含有编码所述蛋白的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达 所述蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动编码所述蛋白的基因转录的启动子，还可包括终止 编码所述蛋白的基因转录的终止子;进一步，所述表达盒还可包括增强子序列；
[0013] 所述重组微生物具体可为细菌、藻和真菌，其中，细菌可为链霉菌。
[0014] 上述生物材料中，BI)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
[0015] I)SEQ ID No.15所示的DNA分子；
[0016] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0017] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。 [0018] 上生物材料中，所述严格条件可为如下：50°C，在7 %十二烷基硫酸钠（SDS)、0.5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50 °C，2 X SSC，0.1 % SDS中漂洗;还可为：50 °C，在 7 % SDS、0.5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50 °C，I X SSC，0.1 % SDS中漂洗;还可 为：50 °C，在7 % SDS、0 · 5M Na3PO4和 ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50 °C，0 · 5 X SSC，0 · 1 % SDS中漂洗；还可为：50 °C，在7 % SDS、0.5M NaP〇4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50 °C， 0.1 X SSC，0.1 % SDS 中漂洗;还可为：50 °C，在7 % SDS、0.5M Na3PO4和 ImM EDTA的混合溶液中 杂交，在65°(：，0.1\35(：，0.1%305中漂洗;也可为:在6\35(：，0.5%503的溶液中，在65°(：下 杂交，然后用2 X SSC，0 · 1 % SDS和I X SSC，0 · 1 % SDS各洗膜一次；
[0019] 所述90%以上的同一性，可为91%、92%、93%、94%或95%以上的同一性。
[0020] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码所述蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明 的编码所述蛋白的核苷酸序列有一定同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白且具有所述蛋白 的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0021] 这里使用的术语"同一性"指与核酸序列的序列相似性。"同一性"可以用肉眼或计 算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％)表 示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0022] 为了解决以上技术问题，本发明还提供一种表达表阿霉素的链霉菌的构建方法， 包括如下步骤:将出发链霉菌的dnmV基因原位替换为avrE基因，并将其doxA基因突变为编 码SEQ ID No. 16所不蛋白的基因序列。
[0023] 上述方法中，所述出发链霉菌的保藏编号为CGMCC No.4827。
[0024] 上述任一所述的方法中，所述dnmV基因的序列如SEQ ID No.9所示；
[0025] 所述avrE基因的序列如SEQ ID No. 10所示；
[0026] 所述编码SEQ ID No. 16所示蛋白的基因序列如SEQ ID No. 15所示。
[0027]上述任一所述的方法中，所述将出发链霉菌的dnmV基因原位替换为avrE基因的方 法如下：
[0028] (1)分别构建得到dnmV基因敲除载体pZHll和用于avrE基因原位替换dnmV基因的 载体PZH12;
[0029] (2)将所述pZHll和所述pZH12分别转化大肠杆菌，得到含有pZHll的重组大肠杆菌 和含有pZHl 2的重组大肠杆菌；
[0030] (3)将所述含有pZHll的重组大肠杆菌接合转移到链霉菌(CGMCC No.4827)，得到 dnmV基因敲除菌ZHll;
[0031] (4)将所述含有pZH12的重组大肠杆菌接合转移到所述ZHll，得到dnmV基因原位替 换为avrE基因的表阿霉素产生菌ZH12。
[0032] 上述任一所述的方法中，所述编码SEQ ID No. 16所示的蛋白的基因序列如SEQ ID No. 15所示。
[0033] 上述任一所述的方法中，所述将doxA基因突变为编码SEQ ID No. 16所示蛋白的基 因序列的方法如下:将含有SEQ ID No. 15的DNA分子替换pZH5的SacI和BglII酶切位点间序 列，得到重组质粒PZH99;将所述pZH99的XbaI和BglII酶切位点间含有ermE*+SEQ ID No· 15 所示的DNA分子的片段替换pSET152的XbaI和BamHI酶切位点间序列，得到pZHIOO;再将所述 pZHIOO转入大肠杆菌，得到含有pZHIOO的重组大肠杆菌;将所述含有pZHIOO的重组大肠杆 菌接合转移到所述ZH12,得到所述表达表阿霉素的链霉菌；
[0034] 所述pZH5的序列如SEQ ID No.2所示；
[0035] 所述ermE*基因序列为SEQ ID No.2的第46位至第325位；
[0036] 所述pSET152在文献"Bierman M,Logan R，0，Brien K,Seno ET,Rao RN,Schoner BE.Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.Gene.1992,116(1):43-9."中公开过，公众可从浙江海正药业 股份有限公司获得。
[0037]上述任一所述的方法中，所述步骤（1)中所述pZHll的构建方法如下：将dnmV基因 上游DNA片段替换pHY642的HindIII和XbaI酶切位点间序列，得到pZH9;用dnmV基因下游DNA 片段替换PZH9的EcoRI和XbaI酶切位点间序列，得到pZHIO;将pIJ773的阿伯拉抗性基因片 段插入PZHlO的Xba頂每切位点，得到pZHll;
[0038] 所述dnmV基因上游DNA片段和所述dnmV基因下游DNA片段的构建方法具体如下：以 链霉菌（CGMCC No. 4827)的基因组DNA为模板，分别用DnmVLF/DnmVLR引物对以及DnmVRF/ DnmVRR引物对扩增得到所述dnmV基因上游DNA片段以及所述dnmV基因下游DNA片段；
[0039] 所述DnmVLF的序列如SEQ ID No .3所示；
[0040] 所述DnmVLR的序列如SEQ ID No.4所示；
[0041 ] 所述DnmVRF的序列如SEQ ID No .5所示；
[0042] 所述DnmVRR的序列如SEQ ID No.6所示；
[0043] 所述pHY642的序列如SEQ ID No.l所示；
[0044] 所述pIJ773在文献"Gust BI ,Challis GL，Fowler K，Kieser T，Chater KF.PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.Proc Natl Acad Sci USA.2003Feb 18; 100(4):1541-6.Epub 2003Jan 31."中公开过，公众可从浙江海正药业股 份有限公司获得。
[0045]上述任一所述的方法中，所述步骤（1)中所述pZH12的构建方法如下：将avrE基因 片段插入所述PZHlO的XbaI位点，得到pZH12;
[0046] 所述avrE基因片段的构建方法具体如下：以除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis)的基因组DNA为模板，用avrEF/avrER为引物对扩增得到所述avrE基因片段；
[0047] 所述avrEF的序列如SEQ ID No .7所示；
[0048] 所述avrER的序列如SEQ ID No.8所示；
[0049] 所述除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis)在文献"Ikeda H, Ishikawa J, Hanamoto A,Shinose M,Kikuchi H,Shiba T,Sakaki Y,Hattori M1Omura S.Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis.Nat Biotechnol .2003May;21(5) :526-31 ·" 中公开过，公众可 从浙江海正药业股份有限公司获得。
[0050] 上述任一所述的方法中，所述大肠杆菌为大肠杆菌ET12567(pUZ8002);
[0051 ] 所述含有pZHll的重组大肠杆菌为重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002，pZHll);
[0052] 所述含有pZHl 2的重组大肠杆菌为重组大肠杆菌ETl 2567 (pUZ8002，pZHl 2)。
[0053]上述任一所述的方法中，所述含有pZHIOO的重组大肠杆菌为重组大肠杆菌 ET12567(pUZ8002，pZH100)。
[0054]为了解决以上技术问题，本发明还提供由上述任一所述的方法构建得到的链霉 菌；
[0055] 所述链霉菌为doxA突变体菌株，与链霉菌（CGMCC No.4827)菌相比，该菌表达的 DoxA蛋白发生了 A133T，A339D和C398S的突变；
[0056] 链霉菌（CGMCC No.4827)的doxA基因序列如SEQ ID No. 17所示，其编码的DoxA蛋 白的氨基酸序列如SEQ ID No. 18所示。
[0057]为了解决以上技术问题，本发明还提供一种制备表阿霉素的方法，包括将所述链 霉菌进行发酵培养。
[0058]上述方法中，所述发酵培养的培养基配方(g/L)如下：玉米淀粉80.0,酵母粉30.0， CaC033.0，NaCl 3.0,余量为水，pH 6.80。
[0059] 为了解决以上技术问题，本发明还提供如下（1)-(3)所示的至少一种在制备表阿 霉素中的应用：
[0060] (1)上述蛋白；
[00611 (2)上述任一所述的生物材料；
[0062] (3)上述链霉菌和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物。
[0063] 为了解决以上技术问题，本发明还提供如下（1)-(3)所示的至少一种在制备抗癌 药物中的应用：
[0064] (1)上述蛋白；
[0065] (2)上述任一所述的生物材料；
[0066] (3)上述链霉菌和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物。
[0067] 上述应用中，所述抗癌药物为抗白血病、乳腺癌、胃癌和/或肠癌的药物。
[0068] 本发明将链霉菌(CGMCC No.4827)的dnmV基因原位替换为avrE基因后，进一步通 过易错PCR对doxA基因进行定向进化，筛选得到对表柔红霉素到表阿霉素具有更高催化活 性的doxA突变体菌株，在本发明的发酵条件下，其发酵液的表阿霉素效价达到102. Oμg/ml， 提高了表阿霉素产量。本发明在生物工程制药技术领域具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0069]图1为表阿霉素的化学结构。
[0070] 图2为质粒pHY642示意图，其序列如SEQ ID No. 1所示。
[0071] 图3为质粒pZH5示意图，其序列如SEQ ID No.2所示。
[0072]图4为表阿霉素标准品的HPLC检测图谱。
[0073]图5为表阿霉素标准品的质谱图。
[0074]图6为ZH98发酵液的HPLC检测图谱。
[0075]图7为ZHl 00发酵液的HPLC检测图谱。
[0076]图8为ZHl 00发酵液中的表阿霉素的质谱图。
【具体实施方式】
[0077] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0078] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0079] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
[0080] 链霉菌(CGMCC No.4827)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 [0081 ]蔗糖-Tris缓冲液:溶质为蔗糖，溶剂为IOmM Tris-HCl，蔗糖在蔗糖-Tris缓冲液 中的质量百分含量为10.3%，该缓冲液的pH为8.0。
[0082] 溶菌酶溶液为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，产品目录号为A610308。 [0083] 饱和酚溶液（pH8.0)为生工生物工程（上海）股份有限公司产品，产品目录号为 A504193。
[0084] TSB培养基（Bacto TM Tryptic Soy Broth)为BD公司产品，货号为211825。
[0085] pIJ773在文献"Gust BI ,Challis GL，Fowler K，Kieser T，Chater KF.PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.Proc Natl Acad Sci USA.2003Feb 18;100(4):1541-6.Epub 2003Jan 31."中公开过，公众可从浙江海正药业股 份有限公司获得。
[0086] 除虫链霉菌（Streptomyces avermi t i I is )在文献 "Ikeda H，Ishikawa J， Hanamoto AjShinose MjKikuchi HjShiba Tj Sakaki YjHattori MjOmura S.Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis.Nat Biotechnol .2003May;21(5) :526-31 ·" 中公开过，公众可 从浙江海正药业股份有限公司获得。
[0087] 大肠杆菌ET12567(pUZ8002)在文献"Bierman M，Logan R，0brien K，Seno ET，Rao RNjSchoner BE:Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.Gene.1992,116(1):43-49.10.1016/0378-1119 (92)90627-2."中公开过，公众可从浙江海正药业股份有限公司获得。
[0088] 表阿霉素标准品为上海岚克医药科技发展有限公司产品，产品目录号为10309。
[0089] pSET152在文献"Bierman M，Logan R，0'Brien K，Seno ET，Rao RN，Schoner BE.Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.Gene.l992，116(l):43_9."中公开过，公众可从浙江海正药业 股份有限公司获得。
[0090] 实施例l、dnmV基因敲除质粒PZHll的构建
[0091] 一、链霉菌(CGMCC No.4827)基因组DNA的提取
[0092] 取链霉菌(061(1：吣.4827)细胞悬液5(^1接种于301111了58培养基中，28°(：，220印111 培养48hr后，于50ml离心管中，4000rpm离心10min，去上清，沉淀用30ml蔗糖-Tr i s缓冲液洗 涤2遍后，以5ml蔗糖-Tris缓冲液悬浮。加入lOOmg/ml溶菌酶溶液20μ1，37Γ水浴2hr。加入 10 % SDS溶液500μ1，温和颠倒直至基本澄清。加饱和酚溶液(pH8.0) 5ml，温和颠倒数次后， 4000rpm离心10min。取上层溶液4ml，加酸-氯仿-异戊醇(pH8.0)溶液4ml，温和颠倒数次后 4000rpm离心10min。取上层3ml，加入3M HAc/NaAc缓冲液(pH5 · 3) 300μ1，异丙醇3ml，温和颠 倒数次后，将结团的沉淀用吸头挑到1.5ml离心管。沉淀用体积百分含量为70%的乙醇水溶 液洗涤2遍后，室温干燥。加入500μ1 Tris-HCl (pH8 · 0)溶解，得到链霉菌(CGMCC No · 4827) 的基因组DNA。
[0093] 二、以步骤一得到的链霉菌(CGMCC No.4827)的基因组DNA为模板，分别用DnmVLF/ DnmVLR引物对以及DnmVRF/DnmVRR引物对扩增得到dnmV基因上游DNA片段以及dnmV基因下 游DNA片段。
[0094]引物序列如下：
[0095] DnmVLF:5'-CCCAAGCTTCCACTCTGCCCGTCCACCTCTT-3'；（SEQ ID No.3)
[0096](下划线所示序列为限制性内切酶Hindin酶切识别位点）
[0097] DnmVLR：5'~TGCTCTAGACTCACCCGTCTCCGCGTG~3'；（SEQ ID No·4)
[0098](下划线所示序列为限制性内切酶Xba頂每切识别位点）
[0099] DnmVRF:5，-TGCTCTAGACGGGCTGGTCGTCAACATCG-3，；（SEQ ID No.5)
[0100](下划线所示序列为限制性内切酶Xba頂每切识别位点）
[0101] DnmVRR：5；-CCGGAATTCGCTCCTTCCTGGGCTTCCTG-3；〇(SEQ ID No.6)
[0102](下划线所示序列为限制性内切酶EcoR頂每切识别位点）
[0103] 根据PrimeSTAR试剂盒(TaKaRa公司产品，产品目录号为R044A)说明书，按以下配 比配制PCR扩增体系： PrimeSTAR GC 缓冲液 40μΙ 2.5 mM dNTP 6.4μ1 DnmVLF(DnrnVRF) 0.8μ1
[0104] DnmVLR(DnmVRR) 0.8μ! 模板 0.8μ1 H2O 30.5μ1 PHmeSTAR 聚合酶 0.8μ!
[0105] 按照引物对的不同分装成2管进行PCR反应，PCR程序为:95°C，5min; (95°C，30sec; 55。(：，3〇86。；72。(：，311^11)\30循环，72。(：，511^11;16。(：，111^11 〇
[0106] 三、HindIII和XbaI双酶切PCR扩增得到的dnmV基因上游DNA片段，得到上游片段I; HindIII和XbaI双酶切载体pHY642(图2)，得到载体片段1;将上游片段1与载体片段1连接， 得到重组质粒，将其命名为PZH9。将pZH9送测序，结果与预期一致。
[0107] EcoRI和XbaI双酶切PCR扩增得到的dnmV基因下游DNA片段，得到下游片段2; EcoRI 和XbaI双酶切pZH9,得到载体片段2;将下游片段2与载体片段2连接，得到重组质粒，将其命 名为pZHIO。将pZHIO送测序，结果与预期一致。
[0108] Xba頂每切PIJ773,得到阿伯拉抗性基因片段;XbaI酶切PZH10,得到载体片段3;将 阿伯拉抗性基因片段与载体片段3连接，得到重组质粒，将其命名为pZHll。将pZHll送测序， 结果与预期序列一致。
[0109] pZHll即为最终构建得到的dnmV基因敲除载体。
[0110]实施例2、用于avrE基因原位替换dnmV基因的质粒pZH12的构建
[0111] 一、以除虫链霉菌（51：代口1：〇1115^6 8 3￥61'111；[1：；[1丨8)的基因组0财为模板，用引物对 avrEF/avrER扩增得到avrE基因片段。
[0112] 除模板和引物不同外，PCR扩增体系和程序同实施例1。
[0113] 引物序列如下：
[0114] avrEF：
[0115] 5 '-ACGCGGAGACGGGTGAGGCGGACATGGGGCGGTTTTCGGTGTGC-3 '；（SEQ ID No·7)
[0116] avrER：
[0117] 5，-GTCGTCGGAAGCCTGTGAGCTACACGTAAGCCGCCACCATG-3，。（SEQ ID No·8)
[0118] 二、XbaI酶切步骤一得到的avrE基因片段，得到avrE片段3;将XbaI酶切pZHIO,得 到载体片段3;将avrE片段3与载体片段3连接，得到重组质粒，将其命名为pZH12。将pZH12送 测序，结果与预期序列一致。
[0119] pZH12用于avrE基因原位替换dnmV基因。
[0120] 实施例3、表阿霉素产生菌的构建
[0121] 一、重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002，pZHll)和ET12567(pUZ8002，pZH12)的构建
[0122] ρΖΗ11、ρΖΗ12分别转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)，具体如下：
[0123] 取ΙμL实施例1制备的质粒pZHll、实施例2制备的质粒pZH12分别加入到100μΙ大肠 杆菌ETl2567(pUZ8002)感受态细胞中，冰上放置30min后，42°C热击90sec，再迅速放到冰上 冷却lmin，加入900μ1液体LB培养基，37°C水浴50min。分别取100μΙ涂布于含25μg/ml氯霉素 (Cm)、50μg/ml卡那霉素(Km)、50μg/ml氨苄青霉素(Amp)的固体LB培养基上，37°C培养过夜， 分别长出转化子，即为重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002，pZHllWPET12567(pUZ8002, pZH12)。
[0124] 二、重组大肠杆菌ETl 2567 (pUZ8002, pZHl I)和ETl 2567 (pUZ8002, pZHl 2)的培养
[0125] 分别将重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002，pZHll)和ET12567(pUZ8002，pZH12)单菌 落接种到3ml含25μg/ml Cm、50μg/ml Km和50μg/ml Amp的液体LB培养基中，37°C，250rpm培 养过夜后，分别取300μ1接种于30ml含25μg/ml Cm、50μg/ml Km和50μg/ml Amp的液体LB培 养基中，37°C，250rpm培养4-6h，至0D600为0.4-0.6之间。离心后，分别收集菌体，以液体LB 培养基洗涤2遍，最后分别加入500μ1液体LB培养基悬浮菌体备用。
[0126] 三、接合转移并筛选dnmV基因敲除菌ZHl 1
[0127] (一)接合转移
[0128] 将链霉菌(061〇：吣.4827)细胞悬液5(^1接种于301111了58培养基中，28°(：，220印111 培养48hr后，取500μ1菌液加入到500μ1步骤二培养得到的ET12567(pUZ8002，pZHll)菌液 中，离心去掉800μ1上清。以剩余的上清悬浮菌体，并涂布于MS固体培养基平板，28°C培养 16-20h后，用含有500yg阿伯拉霉素(Am)和500yg萘啶酮酸(Nal)的Iml无菌水覆盖培养基表 面，28 °C培养4-8d，长出接合子。
[0129] (二)筛选
[0130]挑一个步骤(一)得到的接合子，在含有25μg/ml Nal的MS固体培养基(琼脂20.0g， 甘露醇20.0g，黄豆饼粉20.0g，自来水定容到1000ml)上划线，28°C培养4-6d。将生长的单菌 落每一颗同时转接到以下两种固体培养基上:分别含25μg/ml硫链丝菌素(Tsr)和25μg/ml 阿伯拉霉素(Am)的MS固体培养基上，28 °C培养5d后，观察生长情况。其中在阿伯拉霉素(Am) 的MS固体培养基上生长，同时在含硫链丝菌素的MS固体培养基上不生长的菌落就是dnmV基 因敲除菌，将其命名为ZH11。
[0131 ]四、表阿霉素产生菌的构建
[0132] ( - )接合转移
[0133] 将步骤三得到的ZHll细胞的悬液50μ1接种于30ml TSB培养基，28°C，220rpm培养 48hr后，取500μ1菌液加入到500μ1步骤二培养得到的ET12567(pUZ8002，pZH12)菌液中，离 心去掉800μ1上清。以剩余的上清悬浮菌体，并涂布于MS固体培养基平板，28°C培养16-20h 后，用含有500ygTsr和500yg Nal的Iml无菌水覆盖培养基表面，28 °C培养4-8d，长出接合 子。
[0134] (二)筛选
[0135] 挑一个步骤(一)得到的接合子，在含有25μg/ml Nal的MS固体培养基上划线，28°C 培养4-6d。将生长的单菌落每一颗同时转接到分别含25μg/ml Am和不含Am、Tsr的两种MS固 体培养基上，28°C培养5d后，观察生长情况。选取只在不含Am、Tsr的MS培养基上生长、在含 Am的MS培养基上不生长（即表明dnmV替换为avrE)的菌落，该菌株为表阿霉素产生菌，将其 命名为ZH12。
[0136] dnmV基因序列如SEQ ID No.9所示。
[0137] avrE基因序列如SEQ ID No· 10所不。
[0138] 实施例4、表阿霉素的发酵检测
[0139] -、表阿霉素的发酵
[0140] 接入一环实施例3制备的ZH12的菌丝体到固体斜面培养基上，28°C培养IOd后，从 斜面挖一块约I X Icm大小的菌块接入种子培养基，28°C，250rpm培养45hr，得到种子培养 液。然后取2.5ml的种子培养液接入发酵培养基中，28°C，250rpm培养7天，得到发酵液。
[0141 ]上述各培养基的配方如下：
[0142] 固体斜面培养基配方(g/L):酵母抽提物4.0,麦芽抽提物10.0,葡萄糖4.0,琼脂 20.0，余量为水，调节pH为6.80，灭菌后斜放冷却。
[0143] 种子培养基配方(g/L):可溶性淀粉30.0，葡萄糖10.0，黄豆饼粉20.0，CaCO3 2.0， NaCl 3.0,余量为水，调节pH为6.8。
[0144] 发酵培养基配方(8/1):玉米淀粉80.0，酵母粉30.0,0&0) 33.0，他(：13.0，余量为 水，调节pH为6.80。
[0145] 以上培养基的灭菌方法均为：121°C灭菌20分钟。
[0146] 二、HPLC 检测
[0147] 发酵结束后，将发酵液用HCl调节pH到1.5,加入3倍体积的乙醇，放置Ihr后， 4000rpm离心，取上清样品进行HPLC检测，同时以表阿霉素标准品为对照。以样品与标准品 的目的峰面积比乘标准品的浓度的方法计算发酵液的表阿霉素效价。
[0148] HPLC检测方法如下：
[0149] 色谱柱：C18 柱，5ym，4.6X250mm;
[0150] 缓冲液:取十二烷基硫酸钠1.44g和磷酸0.68ml溶于500ml超纯水中制备而成；
[0151] 流动相:缓冲液：乙腈：甲醇的体积比为500:500:60;
[0152] 流速：1 · 35ml/min;
[0153] 检测波长：254nm;
[0154] 进样量:10μ1。
[0155] 表阿霉素标准品的HPLC检测图谱如图4所示，其中表阿霉素的保留时间为 10.316min〇
[0156] 表阿霉素标准品的质谱图如图5所示。
[0157] 结果表明，ZH12发酵液的表阿霉素效价为0.65μg/ml。
[0158] 实施例5、doxA基因的突变及克隆
[0159] 一、以链霉菌(CGMCC No. 4827)的基因组DNA为模板，以DoxAF/DoxAR为引物对，并 加入终浓度为0.5μΜ的MnCl2进行易错PCR扩增得到doxA突变基因片段，以对doxA基因进行 随机突变。
[0160]引物序列如下：
[0161] DoxAF:5'-ACAGAGCTCGTGGCCGTCGACCCGTTC-3'（SEQ ID No.11)
[0162] (下划线所示序列为限制性内切酶Sac頂每切识别位点）
[0163] DoxAR：5；~GGAAGATCTTCAGCGCAGCCAGACGGG~3；(SEQ ID No.12)
[0164] (下划线所示序列为限制性内切酶Bgin酶切识别位点）
[0165] 根据Taq Polymerase试剂盒（生工生物工程(上海）股份有限公司产品，产品目录 号为B500010)说明书，按以下配比配制PCR扩增体系： IOxTaq 缓冲液 Η)μΙ 2.5 mM dNTP 10μΙ DoxAF 2μΙ DoxAR 2 til
[0166] 模板 1 μΙ 50μΜ MnCl2 1 μ! Η,O 73 LiI i Taq聚合酶 1 μL
[0167] 分装成4管进行PCR反应，PCR程序为：94°C，5min; (94°C，30sec; 55°C，30sec; 72°C， 2min)父30循环，72。(：，511^11;16。(：，111^11。
[0168] 二、SacI和BglII双酶切步骤一得到的doxA突变基因片段，得到doxA突变片段4; SacI和Bgl II双酶切载体pZH5 (图3)得到载体片段4;将doxA突变片段4与载体片段4连接，得 至Ij重组质粒，将其命名为PZH99。该过程中doxA突变基因被克隆到启动子ermE*下游。
[0169] 三、XbaI和BglII双酶切pZH99,得到ermE*+doxA突变基因片段，XbaI和BamHI双酶 切载体PSET152,得到载体片段5;将ermE*+d〇XA突变基因片段和载体片段5连接，得到重组 质粒，将其命名为PZH100。
[0170] ermE*基因序列为SEQ ID No.2的第46位至第325位。
[0171] pZHIOO为DoxA蛋白突变体表达质粒。
[0172] 四、以链霉菌(CGMCC No. 4827)的基因组DNA为模板，以DoxAF/DoxAR为引物对，扩 增得到doxA基因。
[0173] 除引物不同外，PCR扩增体系和程序同实施例1。
[0174] 利用扩增得到doxA基因，按照步骤二至三的方法，得到重组质粒pZH98。将pZH98送 测序，结果与预期一致。
[0175] pZH98为DoxA蛋白表达质粒，作为pZHIOO的对照。
[0176] 实施例6、doxA突变体的筛选
[0177] 一、重组大肠杆菌 ET12567(pUZ8002，pZH98)和 ET12567(pUZ8002，pZH100)的构建
[0178] pZH98和pZHIOO分别转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)，具体如下：
[0179] 分别取lμl实施例5制备的质粒pZH98、pZH100加入到100μl大肠杆菌ET12567 (PUZ8002)感受态细胞中，冰上放置30min后，42°C热击90sec，再迅速放到冰上冷却lmin，加 入900μ1液体LB培养基，37°C水浴50min。分别取100μΙ涂布于含25μg/ml氯霉素(Cm)、50yg/ ml卡那霉素 (Km)、50μg/ml阿伯拉霉素 (Am)的固体LB培养基上，37 °C培养过夜，分别长出转 化子，即为重组大肠杆菌 ET12567(pUZ8002，pZH98)和 ET12567(pUZ8002，pZH100)。
[0180] 二、接合转移
[0181] (一)挑选一个步骤一得到的ETl 2567 (pUZ8002，pZH98)转化子单菌落接种于3ml含 25μg/ml Cm、50μg/ml Km和50μg/ml Am的液体LB培养基中，37°C，250rpm培养过夜后，取300 μL接种于30ml液体LB培养基。
[0182] (二)将步骤一得到的ET12567(pUZ8002，pZH100)的所有转化子用Iml液体LB培养 基洗下后全部接种到30ml含25μg/ml Cm、50μg/ml Km和25μg/ml Am的液体LB培养基中。37 °C，250rpm培养4-6h，至0D600为0.4-0.6之间。离心后，收集菌体，以液体LB培养基洗涤2遍， 最后加入500μ1液体LB培养基悬浮菌体备用。
[0183] (三）取实施例3制备的ΖΗ12的细胞悬液50μ1接种于30ml TSB培养基中，28°C， 220rpm培养48hr后，分别取500μ1菌液加入到500μ1步骤（一）得到的ET12567(pUZ8002， pZH98)和步骤(二)得到的ET12567(pUZ8002，pZH100)菌液中，离心去掉800μl上清。以剩余 的上清悬浮菌体，并涂布于MS固体培养基平板，28°C培养16-20h后，用含有500yg阿伯拉霉 素(Am)和500yg萘啶酮酸(Nal)的Iml无菌水覆盖培养基表面，28°C培养4-8d后长出接合子， 分别将其命名为ZH98和ZH100。将接合子ZH98和ZH100点种到实施例4中的固体斜面培养基 上。
[0184] 三、发酵检测
[0185] 按照实施例4的方法进行ZH98和ZH100的表阿霉素的发酵和HPLC检测。
[0186] ZH98发酵液的HPLC检测图谱如图6所示。
[0187] ZHl 00发酵液的HPLC检测图谱如图7所示，其中表阿霉素的保留时间为10.316min。
[0188] ZHl 00发酵液中的表阿霉素的质谱图如图8所示。
[0189] 以ZH98的发酵结果作为对照，筛选doxA突变体ZH100的表阿霉素高产菌株，其中筛 选到一株菌的表阿霉素效价大幅提高，其发酵液的表阿霉素效价达到102.Oμg/ml，而对照 ZH98为0.72μg/ml。
[0190] 四、doxA突变位点检测
[0191] 按照实施例1步骤一的方法提取步骤三得到的ZH100的表阿霉素高产菌株的基因 组DNA，并以ermEF/DoxAR为引物对，进行PCR反应，得到PCR扩增产物。
[0192] 引物序列如下：
[0193] ermEF:5'-AGCCCGACCCGAGCACGC-3'（SEQ ID No.13)
[0194] DoxAR：5'-GGAAGATCTTCAGCGCAGCCAGACGGG-3'(SEQ ID No. 14)
[0195] 将PCR扩增产物送测序。
[0196] 测序结果表明，该菌株doxA基因突变后的序列如SEQ ID No. 15所示。
[0197] doxA基因突变后编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No. 16所示。
[0198] 链霉菌(CGMCCNo·4827)doxA基因序列如SEQIDNo·17所示。
[0199] 链霉菌(CGMCC No.4827)doxA基因编码的DoxA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.18 所示。
[0200] 测序发现，该菌株中doxA基因发生的碱基突变为397G>A、399C>T、1016C>A、1193G> C，氨基酸密码子变化为第397-399位的5'-GCC-3'变为5'-ACT-3'，第1015-1017位的5'-GCC-3 ' 变为5 ' -GAC-3 '，第1192-1194位的5 ' -TGC-3 ' 变为5 ' -TCC-3 '。相对应的DoxA蛋白三 个位点发生氨基酸改变，分别为DoxA蛋白第133位的丙氨酸突变为苏氨酸(A133T)、第339位 丙氨酸突变为天冬氨酸(A339D)、第398位的半胱氨酸突变为丝氨酸(C398S)。
[0201] SEQ ID No.l:
[0202] 5'-agcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcatcgatgatatca gatcaaggcgaatacttcatatgcggggatcgaccgcgcgggtcccggacggggaagagcggggagctttgccagag agcgacgacttccccttgcgttggtgattgccggtcagggcagccatccgccatcgtcgcgtagggtgtcacacccc aggaatcgcgtcactgaacacagcagccggtaggacgaccatgactgagttggacaccatcgcaaatccgtccgatc ccgcggtgcagcggatcatcgatgtcaccaagccgtcgcgatccaacataaagacaacgttgatcgaggacgtcgag cccctcatgcacagcatcgcggccggggtggagttcatcgaggtctacggcagcgacagcagtccttttccatctga gttgctggatctgtgcgggcggcagaacataccggtccgcctcatcgactcctcgatcgtcaaccagttgttcaagg gggagcggaaggccaagacattcggcatcgcccgcgtccctcgcccggccaggttcggcgatatcgcgagccggcgt ggggacgtcgtcgttctcgacggggtgaagatcgtcgggaacatcggcgcgatagtacgcacgtcgctcgcgctcgg agcgtcggggatcatcctggtcgacagtgacatcaccagcatcgcggaccggcgtctccaaagggccagccgaggtt acgtcttctcccttcccgtcgttctctccggtcgcgaggaggccatcgccttcattcgggacagcggtatgcagctg atgacgctcaaggcggatggcgacatttccgtgaaggaactcggggacaatccggatcggctggccttgctgttcgg cagcgaaaagggtgggccttccgacctgttcgaggaggcgtcttccgcctcggtttccatccccatgatgagccaga ccgagtctctcaacgtttccgtttccctcggaatcgcgctgcacgagaggatcgacaggaatctcgcggccaaccga taagcgcctctgttcctcggacgctcggttcctcgacctcgattcgtcagtgatgatctgccggtctccctatagtg agtcgtattaatttcgataagccaggttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatca caaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcat gtctggatctgacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactgg ttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaa catgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgctcttccgcttcctcgctcac tgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagetcactcaaaggcggtaatacggttatccacag aatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaa aggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagagg tggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgac cctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggt atctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgcc ttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacag gattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagga cagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaa accaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcc tttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaa aaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttgg tctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctg actccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacc cacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaact ttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaa cgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagetccggttcccaac gatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcaga agtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaag atgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcc cggcgtcaacacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcgggg cgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagc atcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcga cacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagc ggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctga cgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtt tcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccggg agcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagca gattgtactgagagtgcaccatatggacatattgtcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatca tacacatacgatttaggtgacactatagaactcgacctgcaggtccccggggatcggtcttgccttgctcgtcggtg atgtacttcaccagctccgcgaagtcgctcttcttgatggagcgcatggggacgtgcttggcaatcacgcgcacccc ccggccgttttagcggctaaaaaagtcatggctctgccctcgggcggaccacgcccatcatgaccttgccaagctcg tcctgcttctcttcgatcttcgccagcagggcgaggatcgtggcatcaccgaaccgcgccgtgcgcgggtcgtcggt gagccagagtttcagcaggccgcccaggcggcccaggtcgccattgatgcgggccagctcgcggacgtgctcatagt ccacgacgcccgtgattttgtagccctggccgacggccagcaggtaggccgacaggctcatgccggccgccgccgcc ttttcctcaatcgctcttcgttcgtctggaaggcagtacaccttgataggtgggctgcccttcctggttggcttggt ttcatcagccatccgcttgcccteatctgttacgccggcggtagccggccagcctcgcagagcaggattcccgttga gcaccgccaggtgcgaataagggacagtgaagaaggaacacccgctcgcgggtgggcctacttcacctatcctgccc ggctgacgccgttggatacaccaaggaaagtctacacgaaccctttggcaaaatcctgtatatcgtgcgaaaaagga tggatataccgaaaaaatcgctataatgaccccgaagcagggttatgcagcggaaaagatccgtcgagcagctga- 3，
[0203] SEQ ID No.2:
[0204] 5'-gaactcgagcagctgaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaagcccgacccgagcacgcgcc ggcacgcctggtcgatgtcggaccggagttcgaggtacgcggcttgcaggtccaggaaggggacgtccatgcgagtg tccgttcgagtggcggcttgcgcccgatgctagtcgcggttgatcggcgatcgcaggtgcacgcggtcgatcttgac ggctggcgagaggtgcggggaggatctgaccgacgcggtccacacgtggcaccgcgatgctgttgtgggctggacaa tcgtgccggttggtaggatccagcggtgagcgagctcgaattcatcgatgatatcagatctgccggtctccctatag tgagtcgtattaatttcgataagccaggttaacctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctc actcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaa aaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaa tcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctcccteg tgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttct catagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgt tcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactgg cagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaac tacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtag ctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaa aaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggatt ttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaag tatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttc gttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgct gcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcg cagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgc cagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttea ttcagetccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcgg tcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctctta ctgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcgg cgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcat tggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtg cacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgca aaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatca gggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttc cccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgagg ccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttg tctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggctta actatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatggacatattgtcgttagaacgcggctacaattaa tacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactata-3 ，
[0205] SEQ ID No.9:
[0206] 5，-atgcgggtcgtggttctgggggcgacgggcagcgtcggtcggcaggtgtgtgcggcgtaccaggcg cacgggtgggacgtgcacggggtggcccgccgcccggcgccgcacctgagcgggtgcgggttcacggagctggacct cgcggccgccgcgcctgggcggatcgccacggtgctgggtgatcttccggcggacgtcgtggtcaacgcggcgggcg gctggggcgacaccgaggaggagatgacgtactcgcatctgcgactggtgcgacgcctggtggaggcgctcgcgctg ctcccgttccggccccggctggtccatctggggtcggtgcacgagtacggtcccgtgccggccggcacgctgctgca cgaggacctgctgccggagccggtcacgccgtacgcgcgcgtcaaactggagacctcgtcggccgtcctgaccgcag cgcgggccggtgtcctggacgcggtggtgctgcgcgcggcgaacatgtcgggcccgcatccgccgcaggagagtttc ctggccgccctgatggcgcgtatcagcacggcattcgcgcacggtgggcggctggagttgagcgtcgcggacgcacg gcgggacttcatcgacgtgcgggacgtcgcacaggcggtggtgcgtgccgggcgggctccggcggtcggcgggctgg tcgtcaacatcgggcgcggggacgccgtgccgatcggtgatctggtcggctggctgctggaggccgccgccttcccg gaggaccgggtcgaccgccgggaggcgccggtgcggagcaagggcggcgactggacccggctggacatcgggcgggc ccggcggttgctgtcctgggcgccgcgcatcggcctgcgggactccgtccacagcatgtggcggaccgcgcacggcg ccccggcctag-3 ，
[0207] SEQ ID No. 10:
[0208] 5?-atggggcggttttcggtgtgcccgccccggccgaccggaatactgaagagcatgctgacgactggg atgtgcgaccgaccgctggtcgtcgtactcggagcctccggctatatcgggtcggccgtcgcggcggaactcgcccg gtggccggtcctgttgcggctggtggcccggcgaccgggcgtcgttccgccgggcggcgccgcggagaccgagacgc gtacggccgacctgacggcggcgagcgaggtcgccctcgccgtgacggacgccgacgtggtgatccacctggtcgcg cgcctcacccagggagcggcatggcgggcggcggagagcgatccggtggccgagcgggtgaacgtcggggtgatgca cgacgtcgtcgcggccctgcggtccgggcgccgcgccgggccgcccccggtggtggtgttcgccgggtcggtctacc aggtgggccgcccgggtcgggtcgacggcagtgagccggacgagcccgtgacggcctatgcccgtcagaaactcgac gccgaacggacgttgaagtccgccacggtcgagggtgtcctgcgggggatctcgctgcggctgcccaccgtctacgg cgcggggccgggcccgcagggcaacggcgtcgtgcaggcgatggtgctccgggcgctcgccgacgaggccctcaccg tgtggaacggaagcgtggtggagcgtgacctggtgcatgtggaggatgtcgcgcaggccttcgtgagctgcctggcg cacgcggatgcgctcgccgggcggcactggctgctcggcagcggtcgtcctgtgaccgtcccgcacctcttcggtgc catcgccgccggcgtgtccgcccgcaccgggcgccccgcggtgcccgtgaccgcggtggaccctccggcgatggcga cggcggcggacttccacgggaccgtcgtcgactcctcggcgttccgcgcggtcaccgggtggcggccgcggctgtcg cttcaggagggcctggaccacatggtggcggcttacgtgtag-3 ，
[0209] SEQ ID No. 15:
[0210] S^gtggccgtcgacccgttcgcgtgtcccatgatgaccatgcagcgcaagcccgaggtgcacgacgcc ttccgggaggcgggcccggtcgtcgaggtgaacgcccccgcgggcggacccgcctgggtcatcaccgatgacgccct cgcccgcgaggtgctggccgatccccggttcgtgaaggaccccgacctcgcccccgccgcctggcggggggtggacg acggtctcgacatccccgttccggagctgcgtccgttcacgcteatcgccgtggacggcgaggcccaccggcgcctg cgccgcatccacgcacctgcgttcaacccgcgccggctggccgagcggacggatcgcatcgccgcgatcgccggccg gctgctcaccgaactcgccgacacttccggccggtcgggcaaaccggccgagctgatcggcggcttcgcgtaccact tcccgctgttggtcatctgcgagctgctcggtgtgccggtcaccgatccggcgatggcccgcgaggccgtcagcgtt ctcaaggcactcggcctcggcggcccgcagagcggcgggggtgacggcacggaccctgccgggggcgtgccggacac ctcggccctggagagcctgctcctcgaagccgtgcactcagcccggcggaacgacaccccgaccatgacccgcgtgc tgtacgagcgcgcgcaggccgagttcggctcggtctccgacgaccagctcgtctacatgatcaccgggctcatcttc gccggccacgacaccaccggctccttcctgggcttcctgctcgcggaggtcctggcgggccgcctcgcggcggatgc cgacgaggacgccgtctcccggttcgtggaggaggcgctgcgctaccacccgccggtgccctacacgttgtggaggt tcgctgccacggaggtgaccatcggcggcgtccggctgccccgcggagcgccggtgctggtggacatcgagggcacc aacaccgacggccgccatcacgacgacccgcacgccttccacccggaccgtccctcgtggcggcggctcaccttcgg cgacgggccgcactactgcatcggggagcagctcgcccagctggagtcgcgcacgatgatcggcgtactgcgcagca ggttccccgaggcccgactggccgtgccgtacgacgagttgcggtggtcccggaagggggcccagacggcgcggctc accgaactgcccgtctggctgcgctga-3 ?
[0211] SEQ ID No.16:
[0212] VAVDPFACPMMTMQRKPEVHDAFREAGPVVEVNAPAGGPAWVITDDALAREVLADPRFVKDPDLAPAAWRGVDDGLD IPVPELRPFTLIAVDGEAHRRLRRIHAPAFNPRRLAERTDRIAAIAGRLLTELADTSGRSGKPAELIGGFAYHFPLL VICELLGVPVTDPAMAREAVSVLKALGLGGPQSGGGDGTDPAGGVPDTSALESLLLEAVHSARRNDTPTMTRVLYER AQAEFGSVSDDQLVYMITGLIFAGHDTTGSFLGFLLAEVLAGRLAADADEDAVSRFVEEALRYHPPVPYTLWRFAAT EVTIGGVRLPRGAPVLVDIEGTNTDGRHHDDPHAFHPDRPSWRRLTFGDGPHYCIGEQLAQLESRTMIGVLRSRFPE ARLAVPYDELRffSRKGAQTARLTELPVffLR
[0213] SEQ ID No.17:
[0214] 5'-gtggccgtcgacccgttcgcgtgtcccatgatgaccatgcagcgcaagcccgaggtgcacgacgcc ttccgggaggcgggcccggtcgtcgaggtgaacgcccccgcgggcggacccgcctgggtcatcaccgatgacgccct cgcccgcgaggtgctggccgatccccggttcgtgaaggaccccgacctcgcccccgccgcctggcggggggtggacg acggtctcgacatccccgttccggagctgcgtccgttcacgcteatcgccgtggacggcgaggcccaccggcgcctg cgccgcatccacgcacctgcgttcaacccgcgccggctggccgagcggacggatcgcatcgccgcgatcgccggccg gctgctcaccgaactcgccgacgcctccggccggtcgggcaaaccggccgagctgatcggcggcttcgcgtaccact tcccgctgttggtcatctgcgagctgctcggtgtgccggtcaccgatccggcgatggcccgcgaggccgtcagcgtt ctcaaggcactcggcctcggcggcccgcagagcggcgggggtgacggcacggaccctgccgggggcgtgccggacac ctcggccctggagagcctgctcctcgaagccgtgcactcagcccggcggaacgacaccccgaccatgacccgcgtgc tgtacgagcgcgcgcaggccgagttcggctcggtctccgacgaccagctcgtctacatgatcaccgggctcatcttc gccggccacgacaccaccggctcctteetgggcttcctgctcgcggaggtcctggcgggccgcctcgcggcggatgc cgacgaggacgccgtctcccggttcgtggaggaggcgctgcgctaccacccgccggtgccctacacgttgtggaggt tcgctgccacggaggtgaccatcggcggcgtccggctgccccgcggagcgccggtgctggtggacatcgagggcacc aacaccgacggccgccatcacgacgccccgcacgccttccacccggaccgtccctcgtggcggcggctcaccttcgg cgacgggccgcactactgcatcggggagcagctcgcccagctggagtcgcgcacgatgatcggcgtactgcgcagca ggttccccgaggcccgactggccgtgccgtacgacgagttgcggtggtgccggaagggggcccagacggcgcggctc accgaactgcccgtctggctgcgctga-3 ?
[0215] SEQ ID No.18:
[0216] VAVDPFACPMMTMQRKPEVHDAFREAGPVVEVNAPAGGPAWVITDDALAREVLADPRFVKDPDLAPAAWRGVDDGLD IPVPELRPFTLIAVDGEAHRRLRRIHAPAFNPRRLAERTDRIAAIAGRLLTELADASGRSGKPAELIGGFAYHFPLL VICELLGVPVTDPAMAREAVSVLKALGLGGPQSGGGDGTDPAGGVPDTSALESLLLEAVHSARRNDTPTMTRVLYER AQAEFGSVSDDQLVYMITGLIFAGHDTTGSFLGFLLAEVLAGRLAADADEDAVSRFVEEALRYHPPVPYTLWRFAAT EVTIGGVRLPRGAPVLVDIEGTNTDGRHHDAPHAFHPDRPSWRRLTFGDGPHYCIGEQLAQLESRTMIGVLRSRFPE ARLAVPYDELRffCRKGAQTARLTELPVffLR
【主权项】
1. 一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。2. 与权利要求1所述的蛋白相关的生物材料，为如下B1)或B2): B1)编码权利要求1所述蛋白的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。3. 根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于:B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3) 所示的基因： 1. SEQ ID吣.15所示的0嫩分子； 2) 在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子； 3) 与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA 分子。4. 一种表达表阿霉素的链霉菌的构建方法，包括如下步骤:将出发链霉菌的dnmV基因 原位替换为avrE基因，并将其doxA基因突变为编码SEQ ID No. 16所示蛋白的基因序列。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述出发链霉菌的保藏编号为CGMCC No.4827〇6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述dnmV基因的序列如SEQ ID No.9所 示;所述avrE基因的序列如SEQ ID No. 10所示;所述编码SEQ ID No. 16所示蛋白的基因序 列如SEQ ID No. 15所示。7. 由权利要求4-6任一所述的方法构建得到的链霉菌。8. -种制备表阿霉素的方法，包括将权利要求7所述的链霉菌进行发酵培养。9. 如下（1 )-(3)所示的至少一种在制备表阿霉素中的应用： (1) 权利要求1所述的蛋白； (2) 权利要求2或3所述的生物材料； (3) 权利要求7所述的链霉菌和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物。10. 如下（1 )-(3)所示的至少一种在制备抗癌药物中的应用： (1) 权利要求1所述的蛋白； (2) 权利要求2或3所述的生物材料； (3) 权利要求7所述的链霉菌和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物。
【文档编号】C12P19/56GK105861455SQ201610323073
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】周敏, 蒋兴, 韩双, 何莹莹, 郑玲辉
【申请人】浙江海正药业股份有限公司