一种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法，包括以下步骤：羧基树脂的活化处理；微生物的预处理；将制备好的微生物菌剂加入活化好的羧基树脂中进行共价结合反应；清洗。该发明所共价结合的微生物固定化牢固，使用寿命长，工艺简单等优点。
【专利说明】
一种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法
技术领域
[0001]本发明涉及污水净化技术领域，特别涉及一种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法。
【背景技术】
[0002]微生物固定化技术是从固定化酶技术基础上发展起来的，主要是利用物理或化学手段将游离微生物细胞限定在特定区域内，使其高浓度密集、保持较高生物活性且可反复利用的方法。固定化微生物与其他游离微生物相比较，微生物密度高、活性强、可连续重复利用、耐PH、耐温度、耐有毒物质强、处理效果稳定，具有很大的潜力和前景。现今已被广泛的应用于废水净化处理领域。
[0003]目前，固定化微生物的方法有很多，主要有吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。吸附法是利用载体和微生物的细胞之间产生表面力，粘附力等作用力将其微生物固定在载体上，其缺点是固定化不牢固，微生物容易脱落。包埋法是将微生物细胞束缚在有限空间内，而底物可以自由进入的一种固定化方法，但该方法空间位阻大，会在一定程度上阻碍底物和氧扩散。交联法是利用交联剂与微生物表面的氨基、羟基、巯基等基团共价结合进行交联，使微生物菌体间相连成网状结构，但该方法化学反应激烈，微生物活性损失较大，且交联剂大多数比较昂贵。共价结合法是利用微生物细胞表面功能团(如氨基、羧基、巯基等)与载体表面基团以化学键连接将微生物固定的方法，因此结合紧密，稳定性好，但基团结合时反应剧烈，操作复杂、难控制。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法，其固定化原理是利用树脂上的羧基与微生物细胞表面的氨基起缩合反应，使微生物共价结合固定在树脂上。本发明解决微生物固定化不牢固，固定化时微生物活性损失大，且操作复杂、难以控制等问题。本发明所采用的技术方案是:一种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法，其特征在于，它包括以下步骤:
(1)羧基化树脂的活化处理:将羧基化树脂用0.1M HCl溶液中侵泡数秒中，取出沥干后，浸入20%的羧基活化剂EDACd-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐)中15—30分钟；用纯化水清洗2-3次，室温干燥2-5小时；
(2)微生物菌液的制备:将离心收集的微生物加入0.149mol/L无菌碳酸氢钠溶液，清洗2-3次后，用0.149mol/L无菌碳酸氢钠溶液制成浓度为3 X 1018-9 X 1018cfu/mL菌液；
(3)共价结合固定化反应:把制备好的微生物菌液加入活化后的羧基化树脂中，置于温度为15-38°C、湿度为45%的烘干箱内干燥；
(4)清洗:将上述固定化微生物后的树脂用无菌生理盐水清洗2-3次，去除未固定化的微生物，晾干。
[0005]在步骤(I)选择的树脂为羧基化树脂。
[0006]在步骤(I)选择的羧基活化剂为EDAC，其浓度为20%。
[0007]在步骤(2)碳酸氢钠溶液浓度为0.149mol/L。
[0008]在步骤(2)制备的菌液浓度为3X1018-9X1018cfu/mL。
[0009]在步骤(3)微生物菌液添加量为树脂重量的0.7-1.5倍。
[0010]在步骤(3)干燥条件为:温度为15-38°c，湿度为45%。
[0011]本发明的有益效果在于:本发明固定化的微生物牢固，不易脱落，工艺简单，微生物活性损失少。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实例对本发明做进一步具体的描述，但本发明的实施不限于此。
[0013]实施例1
将羧基化树脂用0.1M HCl溶解浸泡30秒，取出沥干后，浸入20%的羧基活化剂EDAC中，20分钟后，用纯化水清洗2次，室温干燥2小时，密封4°C保存备用。离心收集培养好的微生物，加入0.149M的无菌碳酸钠溶液，清洗2次，再加入无菌碳酸钠溶液配置成浓度为3 X 118的菌液。在活化后的羧基化树脂中加入I倍重量的菌液，混匀，置于温度30°C、湿度为45%的烘箱内干燥8小时。将干燥好的固定化微生物加入3倍重量的无菌生理盐水清洗3次，室温，晾干。
[0014]实施例2
将羧基化树脂用0.1M HCl溶解浸泡20秒，取出沥干后，浸入20%的羧基活化剂EDAC中，30分钟后，用纯化水清洗3次，室温干燥4小时，密封4°(:保存备用。离心收集培养好的微生物，加入0.149M的无菌碳酸钠溶液，清洗2次，再加入无菌碳酸钠溶液配置成浓度为6 X 118的菌液。在活化后的羧基化树脂中加入1.2倍重量的菌液，混匀，置于温度35°C、湿度为45%的烘箱内干燥10小时。将干燥好的固定化微生物加入4倍重量的无菌生理盐水清洗2次，室温，晾干。
[0015]实施例3
将羧基化树脂用0.1M HCl溶解浸泡15秒，取出沥干后，浸入20%的羧基活化剂EDAC中，25分钟后，用纯化水清洗2次，室温干燥5小时，密封4°C保存备用。离心收集培养好的微生物，加入0.149M的无菌碳酸钠溶液，清洗3次，再加入无菌碳酸钠溶液配置成浓度为8 X 118的菌液。在活化后的羧基化树脂中加入1.5倍重量的菌液，混匀，置于温度32°C、湿度为45%的烘箱内干燥12小时。将干燥好的固定化微生物加入5倍重量的无菌生理盐水清洗2次，室温，晾干。
【主权项】
1.一种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法，其特征在于，它包括以下步骤: (1)羧基化树脂的活化处理:将羧基化树脂用0.1M HCl溶液中浸泡数秒中，取出沥干后，浸入20%的羧基活化剂EDACd-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐)中15-30分钟；用纯化水清洗2-3次，室温干燥2-5小时； (2)微生物菌液的制备:将离心收集的微生物加入0.149mol/L无菌碳酸氢钠溶液，清洗2-3次后，用0.149mol/L无菌碳酸氢钠溶液制成浓度为3 X 1018-9 X 1018cfu/mL菌液； (3)共价结合固定化反应:把制备好的微生物菌液加入活化后的羧基化树脂中，置于温度为15-38°C、湿度为45%的烘干箱内干燥； (4)清洗:将上述固定化微生物后的树脂用无菌生理盐水清洗2-3次，去除未固定化的微生物，晾干。2.根据权利要求1所述一种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法，其特征在于:所述步骤(I)选择的树脂为羧基化树脂。3.根据权利要求1所述一种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法，其特征在于:所述步骤(I)选择的羧基活化剂为EDAC，其浓度为20%。4.一种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法，其特征在于:所述步骤(2)碳酸氢钠溶液浓度为0.149mol/L。5.—种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法，其特征在于:所述步骤(2)制备的菌液浓度为 3 X 1018-9 X 1018cfu/mL。6.—种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法，其特征在于:所述步骤(3)微生物菌液添加量为树脂重量的0.7-1.5倍。7.—种利用羧基化树脂共价结合固定化微生物的方法，其特征在于:所述步骤(3)干燥条件为:温度为15_38°C，湿度为45%。
【文档编号】C12N11/02GK105861477SQ201610413051
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】焦广飞, 林仁放, 林晶
【申请人】福建中微科创生物技术有限公司