一个水稻苗期黄叶基因及其检测方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一个水稻苗期黄叶基因，该基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。通过对苗期黄叶水稻所提取的DNA进行PCR扩增，之后进行测序并且与普通水稻如“嘉花1号和日本晴”比较，发现该基因在第十外显子上有两个核苷酸（TG）的缺失，导致后续密码子发生变化，编码氨基酸数目与种类发生改变如SEQ ID No.2，以至出现苗期黄叶表型。对此设计了如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的特异性dCAPS PCR引物，通过对水稻中所提取的DNA进行PCR扩增后经Eam1105I酶切进行鉴定，能快速检测到含有该基因的水稻植株，其检测准确性高，操作简单，成本低廉。
【专利说明】
一个水稻苗期黄叶基因及其检测方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及植物生物技术和农业如水稻的叶绿素合成、叶绿体发育以及光合机制，特别是分子水平上的基因功能、植物生理、植物遗传育种等领域。
【背景技术】
[0002]水稻是世界上第二大粮食作物，也是中国最主要的粮食作物之一。因此如何提高水稻的产量来解决日益严峻的粮食问题也就显得越发的重要。光合作用是影响水稻产量的关键因素之一，而叶片是进行光合作用的重要器官，叶色在很大程度上决定了光合作用的效率。叶绿体是高等植物进行光合作用的场所，它是半自主性细胞器，由前质体发育而来，其正常发育需要核基因和叶绿体基因的相互协调。自然或非自然因素都会导致与叶绿素合成或叶绿体发育相关的基因发生突变，造成叶绿素合成或降解受阻，叶绿体发育缺陷，最终引起叶色的变化。研究表明控制叶绿体发育的基因被破坏可导致叶绿体发育受阻，进而使植物叶色发生异常，甚至使光合作用效率急剧下降。目前，研究工作者们利用物理、化学、生物等诱变得到水稻叶色突变体，将其应用于水稻的遗传育种、生理及其相关基因的克隆和功能研究。本研究利用物理诱变得到一个水稻苗期黄叶突变体并通过图位克隆技术定位到一个控制水稻苗期黄叶的基因，至今尚未有与水稻此基因相关的文献报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一个水稻苗期黄叶基因，该基因编码的蛋白质及这种基因的检测方法和应用。
[0004]在普通水稻中该等位基因若被破坏或被该黄叶基因置换即可导致水稻苗期黄叶性状。
[0005]这种一个水稻苗期黄叶基因，具有SEQID N0.1所示的核苷酸序列。
[000?]所述的基因序列所编码的蛋白质，具有SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列。
[0007]—对用于检测上述基因的特异性dCAPS PCR引物，序列为:
上游:57 -GTGTGTACTCTCAGATGAAGTACTTGGACTCTCAGT-37
下游:5' -CACATTGTATTTGCAGAACA-37即SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的序列。
[0008]检测这种一个水稻苗期黄叶基因的方法为，采用上述特异性dCAPSPCR引物对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增反应，得到113bpDNA序列如SEQ ID N0.6所示，将所得到的113bp片段(图2)，用Eamll05頂每切后仍是113bp(图3)，说明含有该水稻苗期黄叶基因。
[0009]在本发明研究中，发明人设计的特异性dCAPSPCR引物和检测方法，能对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增，该酶切位点是利用dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)设计的，之后再利用软件Primer 5.0设计特异性的PCR引物，其产物用Eaml 1051进行酶切鉴定，根据酶切带型能快速检测到含有此基因的水稻品种，其检测的准确性高，操作简单，成本低廉。若一个水稻品种中含有此黄叶基因，则用上述引物能够扩增出长度为113bp的特异性片段(图2)，然后用Eamll05I对该片段进行酶切，其酶切片段大小仍是113bp(图3)。
[0010]含有一个水稻苗期黄叶基因的材料是由粳稻“嘉花I号”经6t3CoY射线辐照而来，经海南、上海两地多年自交加代和选择，已成为各种农艺性状稳定的品系。发明人在研究中将此品系与籼稻“培矮64S”配制正反交组合，构建遗传群体，利用SSR和InDel分子标记将含有一个水稻苗期黄叶基因定位在水稻的第4号染色体上。
[0011]本发明利用RNA干扰技术，将一个普通水稻“嘉花I号”的CDNA与PTCK303构建二元表达载体，转农杆菌，并通过农杆菌介导的转基因技术将该cDNA序列转入含有一个苗期黄叶基因的植株中，其后代植株叶色转绿，说明普通水稻中该基因的等位点被破坏即可导致早期水稻叶绿体发育受阻，从而使水稻苗期黄叶。通过本发明得到的一个水稻苗期黄叶的基因可用于研究高等植物的光合作用，叶绿素的生物合成，叶绿体的遗传分化及发育等，而且可作为标记性状在杂交水稻制种，杂交水稻不育系自身以及它配制杂交水稻的纯度中得以应用。
[0012]本发明的有益效果为:获得了一个水稻苗期黄叶基因以及快速检测是否含有该基因的检测方法，并且利用该方法可以快速监测含有该基因的水稻植株，其检测准确性高，操作简单，成本低廉。使得在普通水稻中该等位基因若被破坏或被该黄叶基因置换即可导致水稻苗期黄叶性状如的提前发现，提前预防。另外通过本发明得到的一个水稻苗期黄叶基因可用于研究水稻的叶绿素合成、叶绿体发育以及光合机制等，并且也可以作为标记性状在杂交水稻制种、杂交水稻不育系自身以及它配制杂交水稻的纯度中得以应用。
【附图说明】
[0013]图1为普通水稻与含有苗期黄叶基因水稻的植株叶色对比图；
图2为本发明的特异性dCAPS PCR引物对该基因进行PCR扩增结果。Tl代表普通水稻PCR扩增产物，T2代表含有黄叶基因水稻PCR扩增产物；
图3为本发明对PCR扩增产物进行Eamll05I酶切检测结果。T3代表Tl经过Eamll05I酶切后的片段;T4代表T2经过Eaml 105頂每切后的片段；
图4为本发明的PTCK303载体结构示意图；
图5为本发明的PTCK303二元载体的电泳图；
图6为本发明的PTCK303二元载体进行酶切验证的电泳图。
【具体实施方式】
[0014]实施例1水稻DNA提取
1、称取1.0g新鲜的苗期水稻叶片，把叶片剪成0.5cm长的小段，放到预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，取0.5ml转入2.0ml离心管中。
[0015]2、向2.0ml离心管中加入Iml 65°C预热的2 X CTAB，剧烈摇晃混匀，后65°C水浴40-60min，期间取出震荡数次(至少3次)。
[0016]3、水浴结束后，取出离心管，冷却至室温，加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)混合液，充分混匀，9000转/分的条件下离心lOmin。
[0017]4、吸取上清液，加入其2/3体积的异丙醇，充分混匀，使核酸析出，室温放置1min，12000转/分的条件下离心I Omin，使核酸沉淀。
[0018]5、弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次(每次加70%乙醇500μ1，12000转/分的条件下离心3min)，之后瞭干。
[0019]6、室温干燥后溶于100-200μ1的无菌水或TE buffer中。
[0020]7、取2μ I用于后续的PCR扩增反应。
[0021]实施例2 PCR扩增和基因检测
(一)分别获得普通水稻基因与一个水稻苗期黄叶基因
1、50yLPCR反应体系如下:25μ1 2 XPCR buffer for KOD FX；10yl 2Mm dNTPs；3ylΙΟμΜ引物;3μ1 Template DNA；8yl ddH20；lyl KOD FX(1.0 U/μΙ)。
[0022]引物序列为:
F: 5 ’ -CCCCCGGGACATTCTCCTTCGTCTACCTCCGTC-3 ’ (划线处为限制性内切酶SmaI碱基识别序列)
R: 5 ’ -GCGTCGACATAGCCCACTGCTCTTTTCTTTCAT-3 ’ (划线处为限制性内切酶Sal I碱基识别序列)
2、PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。
[0023]温度和反应条件为:94°C预变性2min，98°C变性10sec，60°C退火30sec，68°C延伸6min，35个循环；最后68°C延伸6min。
[0024]PCR扩增产物长度为6.0kbp，普通水稻该基因测序结果如SEQ ID N0.7，苗期黄叶水稻该基因测序结果如SEQ ID N0.1。
[0025]参照KOME网站上获得的该基因ORF序列B1xm软件翻译成氨基酸序列普通水稻如SEQ ID N0.8所示，苗期黄叶水稻如SEQ ID N0.2所示。
[0026](二)检测一个水稻苗期黄叶基因
l、20yL PCR 反应体系如下:2μ1 模板 DNA;lyl ΙΟμΜ引物；2.5μ1 buffer for TaqDNAPol；0.5μI dNTP；lyl DMS0；12yl ddH20；lyl Taq酶(5U/yl)。
[0027]引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示:
上游:57 -GTGTGTACTCTCAGATGAAGTACTTGGACTCTCAGT-37下游:5' -CACATTGTATTTGCAGAACA-37。
[0028]2、PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。
[0029]温度和反应条件为:94°C预变性4min，94°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸90sec，35个循环；最后72°C延伸6min。
[0030]得到的扩增产物，上样于4.0%琼脂糖凝胶上并电泳，经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像，结果如(图2)所示，普通水稻出现115bp条带(图2)，是SEQ ID N0.7中的一段;含有一个水稻苗期黄叶基因出现113bp条带(图2)，是SEQ ID N0.1中的一段。
[0031]实施例3基因功能验证
采用6t3Coy射线辐照或者其他物理方法诱变，破坏水稻中SEQ ID N0.7的基因序列得到SEQ ID N0.1的基因序列。经测序SEQ ID N0.1的基因序列相对于SEQ ID N0.7的基因序列有两个核苷酸(TG)的缺失，RNA水平降低，则导致该水稻苗期植株黄叶。该基因的功能RNA干扰实验结果表明含有该正常基因的后代植株叶色呈绿色。
[0032]1、利用SSR和InDel分子标记进行水稻苗期黄叶基因的定位，通过测序和半定量RT-PCR技术，表明该基因序列发生变化，其RNA水平的表达量下降。
[0033]2、在水稻基因组文库网站(111^卩://1'；[06.卩1&111:13；[010区7.111811.6(111/0区;[-13；[11/gbrowse/rice/)上找到该目的基因的DNA序列、cDNA序列以及氨基酸序列，利用网站NCBI(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=Blast Sear ch&LINK_L0C=b Iasthome)和pf am (http: //pfam.xfam.0rg/)对目的基因编码的蛋白结构域进行预测分析，根据分析结果，再将引物设计在结构域所在的基因位置，然后利用引物设计软件Primer 5.0设计引物，引物设计片段长度大约为300_400bp，退火温度在55-58°C之间。并且对扩增的片段需进行酶切位点验证，确定无误后，在引物上下游加入酶切位点。
[0034]引物序列:
Fl: 5 ’-CGAGCTCTAGAAATGTCGTCTGAGCCTT-3 ’(划线处为限制性内切酶SacI碱基识别序列)
Rl: 5 ’-GGACTAGTCGCTGATACTCCACAGAACGC-3 ’(划线处为限制性内切酶SpeI碱基识别序列)
F2:5 ’ -CGGGATCCTAGAAATGTCGTCTGAGCCTT-3 ’ (划线处为限制性内切酶BamHI碱基识别序列)
R2: 5 ’ -GGGGTACCCGCTGATACTCCACAGAACGC-3 ’(划线处为限制性内切酶KpnI碱基识别序列)
3、构建PTCK303 二元载体
(I)以普通水稻如“嘉花I号” cDNA为模板，扩增并回收目的片段，然后连接pMD18T载体，挑取菌落PCR阳性克隆送样测序，提取测序正确的克隆的质粒。
[0035](2)将T-1质粒(为F1/R1扩增产物连接T载阳性克隆)和pTCK303(图4)分别进行SacI和SpeI双酶切，回收目的片段后连接转化，挑选阳性克隆，提取质粒(图5)。
[0036](3)将T-2质粒(为F2/R2扩增产物连接T载阳性克隆)和步骤2所提质粒回收，分别进行BamHI和KpnI双酶切。回收目的片段后连接转化，挑选到的阳性克隆就是最终的干扰表达载体。
[0037](4)对所得pTCK303二元载体进行酶切验证(图6)，酶切后片段所在位置与目的基因的大小一致，说明步骤3中所得阳性克隆没有问题。
[0038](5)利用农杆菌介导的转基因技术，将pTCK303 二元载体转入农杆菌感受态，转化苗期黄叶基因的水稻的愈伤组织，获得的阳性第一代转基因植株，其叶色呈绿色。
[0039]4、将第一代转基因植株的种子播种，其叶色出现分离，呈绿色和黄叶表型，并符合孟德尔遗传分离比即3:1。
[0040]5、该基因正常表达是水稻植株叶色呈绿色，而其表达下调的突变植株苗期叶色呈黄叶表型，因此可以通过此表型变化来鉴别一个植株是否含有一个水稻苗期黄化的基因。
【主权项】
1.一个水稻苗期黄叶基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.根据权利要求1所述的一个水稻苗期黄叶基因，其特征在于:所述的基因序列所编码的蛋白质为SEQ ID N0.2所示的821个氨基酸序列。3.一对用于检测权利要求1所述的一个水稻苗期黄叶基因的特异性dCAPSPCR引物，其特征在于，其核苷酸序列为: 上游:57 -GTGTGTACTCTCAGATGAAGTACTTGGACTCTCAGT-37 下游:5' -CACATTGTATTTGCAGAACA-37 即SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的序列。4.一种用于检测权利要求1所述的水稻苗期黄叶基因的方法，其特征在于，用权利要求3所述的特异性dCAPS PCR引物对普通水稻和含有水稻黄叶基因水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增反应，得到115bp核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示和113bp核苷酸序列如SEQ IDN0.6所示。5.权利要求4所述的水稻苗期黄叶基因的检测方法，其特征在于，由普通水稻如“嘉花I号和日本晴”的DNA扩增所得到的115bp片段，可被Eaml 1051酶切成83bp和32bp两段，而由含黄叶基因水稻扩增仍保持长度为113bp—段。
【文档编号】C12N15/11GK105861518SQ201610305249
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】王文娟, 刘朝辉, 陈佳颖, 董彦君
【申请人】上海师范大学